分子标记辅助选择降低籼稻057的直链淀粉含量图文精.docx
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分子标记辅助选择降低籼稻057的直链淀粉含量图文精
分子标记辅助选择降低籼稻057的直链淀粉含量
张士陆1,3,4 倪大虎1 易成新1 李 莉1 汪秀峰1 王宗阳2 杨剑波1,3
(1安徽省农业科学院水稻研究所,安徽合肥230031;2中国科学院上海植物生理生态研究所,上海200032;3安徽农业大学农学系,安徽合肥230036;4安庆市农业科学研究所,安徽安庆246007;3通讯联系人,E2mail:
yjianbo@
ReducingAmyloseContentofIndicaRiceVariety057byMolecularMarker2AssistedSelection
ZHANGShi2lu1,3,4,NIDa2hu1,YICheng2xin1,LILi1,WANGXiu2feng1,WANGZong2yang2,YANGJian2bo1,3
(1RiceResearchInstitute,AnhuiAcademyofAgriculturalSciences,Hefei230031,China;2ShanghaiInstituteofPlantPhysiologyandEcology,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200032,China;3DepartmentofAgronomy,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China;4AnqingInstituteofAgriculturalSciences,Anqing246007,China;3Correspondingauthor,E2mail:
yjianbo@mail.ah.
Abstract:
Tolowerthehighamylosecontent(ACofaneliteindicaricerestorerline057,fourindicavarieties(R367,91499,Yanhui559andHui527withlowamylosecontentwereusedasdonorandbackcrossedwithrecurrentparent057re2spectively,andtheirbackcrosseswereidentifiedusingamolecularmarker(PCR2AccⅠ.ThereexistedsignificantdifferencesinACamongthreeWxgenotypes(GG,TT,GT.Amylosecontentsinricegrainweremorethan20%inGGgenotype,17171%to28.48%inGTgenotypeandlessthan18%inTTgenotype.ItwassuggestedthatthePCR2AccⅠmolecularmarker2assistedselectionforACofricegrainwasusableandreliable,andtheACof057hadbeenloweredsuccessfully.
Keywords:
molecularmarker2assistedselection;indicarice;amylosecontent;breeding;grainquality
摘 要:
以4种低直链淀粉含量(AC的籼稻品种(R367、91499、盐恢559、恢527作优质基因的供体,以产量配合力较强的三系籼稻恢复系057为受体轮回亲本,对高AC值的057进行回交改良。
在回交改良中利用分子标记对控制AC值的基因型进行选择,并对分子标记鉴定的Wx基因3种表达类型(GG、TT、GT植株稻米的AC值进行测定分析。
结果显示,GG型植株的稻米AC值高于20%;GT型的变化较大,为17.71%~28.48%;TT型的小于18%。
经最小显著差数法(LSR检验,3种基因型间AC差异达极显著水平。
表明这种分子标记对稻米AC值的辅助选择是可靠有效的。
通过分子标记辅助选择有效降低了057的AC值。
关键词:
分子标记辅助选择;籼稻;直链淀粉含量;育种;稻米品质
中图分类号:
S331;S511.033文献标识码:
A文章编号:
100127216(20050520467204
近年来,水稻育种在注重产量提高的同时,更加注重品质的改良。
许多研究表明水稻胚乳中直链淀粉含量在决定稻米食用品质与蒸煮加工品质上起着重要的作用,适中的直链淀粉含量是优质稻米的重要指标[1]。
育种实践表明,要获得适中直链淀粉含量(AC的籼型杂交稻,其亲本选配原则是低AC值与中、高AC值配组或中AC值之间配组[1,2]。
因此,选育中、低AC的亲本是必要的。
由于稻米AC值受主效基因控制并受到微效基因和环境因素的影响,用传统育种方法无法直接对主效基因进行选择,而针对其主效基因的分子标记辅助选择,可克服传统育种方法的不足,在育种早期世代直接进行基因型选择,从而提高品质育种的效率。
水稻蜡质基因(Wx编码的结合在淀粉粒上的淀粉合成酶(GBSS直接控制了水稻的AC值。
王宗阳等[3]成功分离到水稻的Wx基因后,又对Wx基因表达调节规律进行了研究,发现水稻的AC值的高低与Wx基因第1内含子的剪接效率关系密切[4]。
进一步研究[5~9]揭示,蜡质基因第一内含子的剪接效率与第一内含子中+1位置的碱基有关,正常Wx基因第一内含子中+1位置为G碱基,其第一内含子能被有效剪接从而产生较多的蜡质基因成熟的mRNA,使翻译成的GBSS量增多,相应的水稻胚乳中直链淀粉含量就会提高;若+1位置碱基突变为T碱基,第一内含子不能被有效剪接,水稻胚乳中产生的蜡质基因成熟mRNA的量就减少,翻译成GBSS的量也变少,相应的水稻胚乳中直链淀粉含量就会下降。
对Wx基因DNA序列分析发现正常的碱基G及其旁邻序列恰是AccⅠ酶的酶切位点,若突变成T就不能被AccⅠ酶酶切。
选用适当引物对Wx基因上游的DNA片段进行体外聚合酶链式反应(PCR,对产物进行AccⅠ酶切,就能根据电泳条带的多态性来判别第一内含子+1位置的碱基是T还是G。
蔡秀玲等[10]利用这种分析方法检测了来自不同地区的63个栽培水稻品种(系,证实了PCR2AccⅠ分子标记技术用于AC值辅助选择的可行性。
分子标记辅助选择改良水稻品质的基础研究已有不少报道[11~14],但在实际应用中取得成功的例子尚不多见。
籼型杂交稻协优57以其优势强、产量高、适应广,而深受稻农喜爱,但美中不足的是直链淀粉含量偏高,食味品质和蒸煮品质欠佳。
主要原因是其父本057的AC值过高。
我们使用4个食味佳、AC值适中的品种作供体亲本分
收稿日期:
2004212208;修改稿收到日期:
2005203221。
基金项目:
国家“863”计划资助项目(2004AA211163;国家转基因植物研究与产业化开发专项(JY032B211;安徽省自然科学基金资助项目(03041102。
第一作者简介:
张士陆(1975-,男,在职硕士研究生。
764
中国水稻科学(ChineseJRiceSci,2005,19(5:
467~470http:
//www.ricescience.org
图1 PCR2AccⅠ分子标记辅助选择回交降低057直链淀粉含量的流程
Fig.1.ProcedureforreducingtheACof057byPCR2AccⅠmolecularmarker2assistedselection.别与057回交,并利用PCR2AccⅠ分子标记进行辅助选择,
初步降低了057的直链淀粉含量。
本文报道这一研究结果。
1 材料与方法
1.1 供试材料
受体亲本为057,供体亲本为91499、R367、盐恢559、恢527。
057是三系籼型杂交稻优良恢复系;91499是安徽省农业科学院水稻研究所选育的优质常规籼稻;R367是美国的优质常规品种;盐恢559是江苏省选育的优质恢复系;恢527是四川省选育的优质恢复系。
4个供体亲本来自不同的地区,具有一定的代表性。
1.2 试验方法
1.2.1 叶片总DNA的提取
参照卢扬江和郑康乐[15]的方法。
1.2.2 PCR反应及AccⅠ酶切分析
参照蔡秀玲等[10]的方法。
上下游引物是5’2GCTTCACTTCTCTGCTTGTG23’和5’2ATGATTTAACGAGAGTTGAA23’。
该引物可在Wx基因的上游特异扩增出包含第一内含子+1位碱基在内的460bp的DNA片段,利用AccⅠ酶切可使含有GG型内含子的扩增片段产生403bp和57bp片段;含有TT型内含子的扩增片段不能被酶切,电泳只显示460bp的条带;而含有杂合GT型内含子的扩增片段能部分酶切产生403bp和460bp的条带,因此可通过琼脂糖凝胶(2%电泳分析进行3种基因型的识别检测。
1.2.3 改良057的流程
用4个供体亲本按图1所示分别对057进行回交改良,利用PCR2AccⅠ分子标记选择Wx基因型的GT型单株,部分与057继续回交,部分一直自交。
文中世代均指植株的世代,如回交4次自交1次所得种子长成的植株的世代为BC4F2。
试验从2000年正季开始并经海南岛加代,至2003年正季已获得回交6代的材料。
1.2.4 直链淀粉含量的测定
按中华人民共和国农业部部颁标准米质测定方法NY147288测定AC值。
2 结果与分析
2.1 受体亲本057和供体亲本之间直链淀粉含量差异及分子标记的多态性比较
分别对4个供体亲本及受体亲本057进行AC
值的测图2 PCR2AccⅠ分子标记检测受体亲本和供体亲本
Fig.2.PCR2AccⅠpatternofreceptoranddonorparent.
泳道1-057;泳道2-协青早A;泳道3-R367;泳道4-91499;泳道5-恢527;泳道6-盐恢559;泳道M-Marker。
Lane1,057;Lane2,XieqingzaoA;Lane3,R367;Lane4,91499;Lane5,Hui527;Lane6,Yanhui559;LaneM,Marker.
定,结果显示057的AC值高达28.4%,4个供体亲本R367、91499、盐恢559、恢527的AC值分别为17.66%、16.08%、14.37%和14.24%。
PCR2AccⅠ分析表明受体亲本057与供体亲本之间具有多态性(图2。
杂交稻协优57的母本协青早A与父本057显示403bp的条带,表达类型为GG型,而4个供体亲本都只出现460bp的条带,表达类型为TT型。
由此不难看出GG型的AC值明显较TT型高。
另外,同为GG型或TT型其AC值也会因遗传背景和环境的影响等而表现一定程度的差异。
2.2PCR2AccⅠ分子标记的辅助选择
按图1设定的步骤,对057进行杂交和回交改良。
在每次回交前用PCR2AccⅠ分子标记检测Wx基因,选择GT型单株与057回交(图1,随着回交世代的增加,后代的性状也越接近057。
2003年正季,选取株叶形态与057相似的各改良世代株系或单株,用PCR2AccⅠ分子标记统一进行Wx基因的选择,并测定其植株所结的稻米AC值,结果显示GG型株系或单株上的稻米AC值大于20%;TT型低于18%,都比亲本057的AC值低,且出现超低亲现象,株系中最低AC值只有10.77%;GT型的平均AC值为22.40%,但株系间变化很大。
经最小显著差数法(LSR检验表明GG型、GT型和TT型间差异都达极显著水平(表1。
说明第一内含子+1位置的碱基替换直接影响了稻米的AC值。
这进一步证明了PCR2AccⅠ分子标记辅助选择在回交改良中应用是可靠的。
864中国水稻科学(ChineseJRiceSci 第19卷第5期(2005年9月
图3 PCR2AccⅠ分子标记检测057改良后代(BC4F2
Fig.3.PCR2AccⅠpatternoftheimprovedgenerations(BC4F2of057.
泳道5、7、8、9为TT型;泳道1、6为GG型;泳道2、3、4、10、11为GT型;M为Marker。
Lanes5,7,8and9,TTtype;Lanes1,6,GGtype;Lanes2,3,4,10and11,GTtype;M,Marker.
表1 057改良后代Wx基因3种表达型的单株或株系的稻米AC值
Table1.ComparisonofACinriceofsingleplantorlineforthethreegenotypesofWx.
基因型
Genotype株系数
Numberoflines
平均值±标准差
Mean±SD/%AC变化幅度RangeofAC/%GG6524.69±1.97A20.41~29.38GT9622.40±2.41B17.71~28.48TT
106
13.79±1.43C
10.77~17.48
同一列数据后跟有不同字母者表示差异达1%显著水平。
Datawithinacolumnfollowedbydifferentlettersindicatesignificanceat1%level.
表2 不同供体亲本对057改良的BC4F2代GT型的AC值比较
Table2.ComparisonofACinBC4F2generationwithGTderivedfrom
differentdonorsbackcrossedwith057respectively.
供体亲本
Donorparent株系数1
Numberoflines1
平均值±标准差2
Mean±SD2/%R36714
24.81±2.16aA91499
1423.74±1.89aAB盐恢559Yanhui559
523.66±0.40aAB恢527Hui527
4
21.78±0.85bB
1
分子标记检测到含有GT型单株的株系总数。
2
同一列数据后跟有相同大、小写字母者分别表示差异未达1%
和5%显著水平。
1
ThenumberoflineswithGTtypeidentifiedbythemolecularmarker.
2
Datawithinacolumnfollowedbythesamecapitalandlower2
caselettersindicatednosignificantdifferenceat1%and5%levels,respectively.
2.3 遗传背景对直链淀粉含量的影响
2.3.1 供体亲本的遗传背景对GT基因型的植株稻米直链
淀粉含量的影响
在057回交改良的后代中,统一选取BC4F2代GT型植株,收获其籽实进行稻米的AC值测定,比较不同供体亲本的遗传背景对植株的稻米AC值的影响(表2,可看出BC4F2代植株上所结的稻米AC均值大小表现出与供体亲本AC值相同的变化趋势,供体亲本AC值差异越大(如R367与527,它们改良的后代平均AC值差异也就越大。
这表明057遗传组分基本相同(同为回交4代的情况下,各供体亲本的遗传背景对AC值表现有一定的影响,即供体亲本AC值越高改良后代的AC值也就相对越高,反之也是一样。
这
种影响在BC4F2代TT型植株中也显示出来(表3。
这表明
要获得适中的AC值,供体亲本的选择是很重要的。
同时也说明微效修饰基因的存在。
2.3.2 受体亲本的遗传背景对TT基因型植株上的稻米直链淀粉含量的影响 在4个品种同步改良057所得后代群体中,通过对不同世代TT型植株的稻米AC值测定(表3可以看出,一些供体亲本(如R367和恢527的回交后代随着回交世代的增加,轮回亲本057的遗传组分不断增多,057背景对回交后代AC值的影响逐渐增强,AC值呈逐渐增高趋势。
而在另一些供体亲本(如91499的回交后代中,这种趋势则不太明显。
尽管轮回亲本057对不同供体后代和不同世代的AC值的影响有程度上的差异,但随着世代的进程逐步趋于稳定。
从表3的AC值的变异系数看出,在较低的回交世代(BC1F5和BC2F4中,大部分供体亲本对057改良的后代各株系间的变异系数较大,而在较高的回交世代变异系数则相对较小。
说明在低回交世代,基因互作效应较明显。
这表明在回交育种中,要获得AC值较稳定的株系,需要一定的回交次数。
3 讨论
针对直链淀粉含量的品种改良,传统的方法是对收获的种子进行AC值的测定,用时长,效率低,易受环境条件的影响。
分子标记技术为实现对基因型的直接选择提供了可能,PCR2AccⅠ分子标记与控制直链淀粉含量的基因型直接相关。
因此我们能够借助这种分子标记对目标性状的基因型进行选择。
本试验采用不同的亲本对057进行回交改良,在回交后代利用PCR2AccⅠ分子标记技术选择基因型,结合直链淀粉含量测定进行验证,收到了很好的改良效果,获得一批农艺性状与057相似且AC值得到改良的稳定株系,显示
9
64张士陆等:
分子标记辅助选择降低籼稻057的直链淀粉含量
表3 不同品种改良057的部分世代TT型的AC值统计
Table3.StatisticsofACforvariousbackcrossgenerationswithTTderivedfromthebackcrossesof057withdifferentvarieties.%供体亲本
Donorparent
BC1F5BC2F2BC2F4BC3F2BC3F3BC4F2
R36713.11±0.77-13.43±1.7014.71±0.1715.31±1.4315.59±1.479149914.11±1.68--14.33±0.8613.72±0.4314.60±0.87盐恢559Yanhui55912.99±1.2615.89±0.5215.12±0.6815.67±1.8713.81±0.9114.52±0.48恢527Hui52712.16±1.7713.43±1.3513.67±1.37-13.86±1.2713.91±0.97
了该方法的可靠性和先进性。
在利用低AC值供体亲本对057回交改良的后代中,所有TT型植株的AC值都比057低(表3。
而且部分TT型株系出现超低亲,表1也显示部分GG型株系AC值出现超高亲现象,这与戚华雄等[16]的结果相似。
另外,在整个AC值回交改良的进程中,供体和受体的遗传背景都不同程度地对AC值的高低产生影响,这都说明了微效基因的存在。
总之,AC值变化的影响因素是复杂的,除了Wx基因组成型核苷酸序列以外,其内含子组成与结构尤其是第一内含子中+1位置上的碱基组成直接影响到基因表达的效率,这在本研究及先前研究中已加以证实,也有报道证实Wx基因引导序列中的微卫星(CTn的多态性变化同样影响着Wx基因的表达[14,17]。
上述都说明了Wx基因表达的复杂性以及可能导致AC含量的多样性变化,这都要求我们在品种AC值改良的实践中加以综合考虑。
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