生物急毒性检测方法鲤鱼静水式法.docx

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生物急毒性检测方法鲤鱼静水式法

生物急毒性檢測方法－鯉魚靜水式法

NIEAB904.12B

一、方法概要

　　本方法主要係以鯉魚（Cyprinuscarpio）為試驗生物，以靜水式生物毒性試驗方法，檢測生物急毒性，並計算96小時之半數致死濃度（lethalconcentration50%,LC50）或急毒性單位（acutetoxicunit,TUa）。

二、適用範圍

　　本方法適用於地面水體、地下水體、放流水、廢水、污水、水源水質及環境用藥之生物急毒性檢測。

三、干擾

（一）生物馴養及毒性試驗室內若有化學氣體侵入、馴養水或稀釋水含有有毒物質、器皿或試驗容器未洗淨致殘留有毒物質，會影響鯉魚健康且可能造成耐受性改變。

（二）試驗生物有病或健康狀況不佳，影響耐受性。

四、設備及材料

（一）鯉魚：

使用全長（上顎前端至尾鰭後端的長度）2.0至3.0公分之鯉魚幼魚（圖一），可購自魚苗繁殖場或自行繁殖。

（註1）

（二）生物馴養及毒性試驗室：

須為獨立之空間，通風良好，無化學氣體影響，且可屏蔽外界干擾（如噪音、震動、強光、人為驚擾等）。

馴養及試驗區宜加以區分，以避免污染。

光照強度同一般工作亮度。

（三）溫度控制設備：

可使用循環式水浴槽、空調等方式，將馴養水溫及試驗水溫控制在25±2℃。

（四）採樣容器：

玻璃或塑膠材質（如摺疊式水箱）。

如使用塑膠材質容器，不可重複使用。

（五）馴養容器：

玻璃或塑膠材質。

（六）試驗容器：

2L硼矽玻璃燒杯。

（七）量瓶及量筒：

硼矽玻璃材質。

（八）溫度監測裝置：

須可顯示毒性試驗期間試驗水樣之最高及最低溫度。

（九）溶氧測定儀。

（十）pH計。

（十一）導電度計。

（十二）餘氯計。

（十三）水質硬度計：

亦可使用水質硬度檢測試劑組。

（十四）分析天平：

可精秤至0.1mg。

（十五）曝氣設備。

（十六）水循環過濾裝置。

（十七）手操網：

大小合適之具握柄軟質尼龍網。

（十八）幼魚飼料：

飼料須考量適口性，大小須適合鯉魚幼魚，建議使用市售超細微粒、半沉浮性魚飼料。

五、試劑

（一）試劑水：

比電阻值須大於10Megohms-cm。

（二）馴養水：

可使用稀釋水、去氯自來水（註2）、無污染之地下水等作為馴養水。

馴養水之硬度應為80至100mgCaCO3/L，可混合適量之逆滲透水或試劑水進行調整。

（三）稀釋水：

　　每一L之試劑水含下列成分（試藥級以上）：

　　碳酸氫鈉（NaHCO3）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　96.0mg

　　七水硫酸鎂（MgSO4‧7H2O）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　123.0mg

　　氯化鉀（KCl）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4.0mg

　　二水硫酸鈣（CaSO4‧2H2O）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　60.0mg

　　可根據檢測需求量，依配方比例配製。

20L稀釋水建議配製程序如下：

１、將碳酸氫鈉、七水硫酸鎂及氯化鉀加入18L試劑水中，曝氣隔夜使試藥充分溶解。

２、將二水硫酸鈣加入2L試劑水中，充分攪拌使其完全溶解後，再加入前述18L液體中。

　　試藥完全溶解後，劇烈曝氣至少8小時，再測定硬度是否為80至100mgCaCO3/L。

室溫下避光保存不宜超過14天。

（四）參考毒物：

氯化鈉，試藥級以上。

（五）10%（v/v）鹽酸或硝酸：

試藥級以上。

（六）丙酮：

殘量級。

六、採樣及保存

（一）放流水採樣方法參照「事業放流水採樣方法（NIEAW109）」之規定。

水樣量至少10L（註3）。

（二）採樣時樣品容器應裝至全滿，以減少揮發性物質散失。

採樣後立即避光保存於4±2℃。

（三）水樣必須在採樣後36小時內開始進行確定試驗。

七、步驟

（一）試驗準備

１、鯉魚馴養：

（１）將鯉魚幼魚自魚苗繁殖場等取回後，放入內盛馴養水之馴養容器。

（２）馴養容器以曝氣設備曝氣，使溶氧維持在5mg/L以上，並以水循環過濾裝置維護水質，如有死魚應立即移出。

（３）馴養之水溫必須與毒性試驗溫度一致，即25±2℃，光照時間應維持在每天16±1小時。

（４）馴養時間至少7天，毒性試驗開始前7天內，期間幼魚死亡率不得超過10%。

（５）幼魚成長速度與馴養之密度及餵食狀況有關，須依實際情況調整馴養容器中幼魚數量及餵食次數。

過剩之飼料宜移除以免導致水質惡化。

（６）毒性試驗開始前24小時停止餵食。

（７）試驗用鯉魚全長應為2.0至3.0公分。

試驗前須取5隻以上試驗用鯉魚量測並計算其平均體重，以估算試驗水樣所須體積（註3）。

２、試驗容器及相關器材之清洗：

（１）新的塑膠器皿，使用前須用稀釋水潤洗1次。

（２）新的玻璃器皿，須用新鮮配製之10%（v/v）鹽酸或硝酸浸泡一夜後，再用試劑水沖洗乾淨。

使用前以稀釋水潤洗1次。

（３）接觸過樣品的玻璃器皿（如試驗容器、量筒等），如需重複使用，則必須依下列步驟清洗：

（a）自來水浸泡15分鐘後，用清潔劑清洗內壁，再以自來水沖洗2次。

亦可使用洗瓶機清洗。

（b）以新鮮配製之10%（v/v）鹽酸或硝酸潤洗1次。

（c）以試劑水潤洗2次。

（d）以丙酮潤洗1次。

（e）以試劑水沖洗3次。

（f）進行毒性試驗前，再以稀釋水潤洗1次。

３、試驗前之水樣準備：

（１）先將水樣靜置半小時，待粗顆粒沈降後，再取上層液進行試驗。

（２）水樣溫度須調整至25±2℃。

若回溫後溶氧低於3.0mg/L，應對水樣溫和曝氣，使溶氧升至3.0mg/L以上。

（二）範圍尋找試驗（range-findingtest）

１、若不確定樣品之半數致死濃度落於哪一濃度範圍，可先進行範圍尋找試驗。

放流水生物急毒性檢測則不須進行範圍尋找試驗。

２、建議可將水樣或環境用藥以稀釋水適度進行10倍序列稀釋。

每一濃度之試驗水樣體積至少1.5L（註3），以1個試驗容器盛裝。

３、每一濃度之試驗生物總數均為5隻。

以手操網將經馴養且全長2.0至3.0公分之鯉魚移入試驗容器，每個容器各放5隻。

４、試驗期間鯉魚不得餵食，水溫應控制在25±2℃，光照應維持每天16±1小時。

５、觀察8至24小時，移出死亡之魚並記錄死亡數量。

試驗結果作為確定試驗稀釋方式之參考。

（三）確定試驗（definitivetest）

１、將水樣或環境用藥以稀釋水適度稀釋為5個濃度，相鄰濃度之稀釋倍數不得超過2倍。

放流水則以5個固定濃度進行試驗（100%、80%、60%、40%及20%）。

每一濃度之試驗水樣總體積至少3L（註3），以2個試驗容器平均盛裝。

２、稀釋完成後，檢測最高濃度試驗水樣之pH、溶氧、導電度及餘氯。

另須檢測稀釋水之pH及導電度。

３、每一濃度之試驗生物總數均為20隻。

以手操網將經馴養且全長2.0至3.0公分之鯉魚移入試驗容器，每個容器各放10隻。

４、空白試驗則取2個試驗容器，分別盛裝至少1.5L之100%稀釋水，以手操網各放入10隻經馴養且全長2.0至3.0公分之鯉魚。

５、試驗期間為96小時，水溫應控制在25±2℃，光照應維持每天16±1小時。

試驗期間鯉魚不得餵食。

６、開始試驗後，至少於第2、24、48、72及96小時，觀察及移出死亡之鯉魚並記錄死亡數量。

７、結束試驗後，須測量並記錄最高濃度試驗水樣之溶氧及pH，並記錄試驗期間之最高及最低水溫。

八、結果處理

（一）死亡判定：

死亡之判定須符合下列二條件：

１、鰭及鰓的活動停止。

２、魚體經輕觸沒反應。

（二）96小時LC50之計算：

１、計算各試驗濃度之96小時鯉魚死亡總數及鯉魚死亡百分率：

　　　　鯉魚死亡總數＝2個試驗容器之鯉魚死亡數量加總

　　　　鯉魚死亡百分率＝鯉魚死亡總數÷20×100%

２、以下列4種方法計算96小時LC50：

圖解法（graphicmethod）、機率單位法（probitmethod）、史丕曼－卡伯法（Spearman-Karbermethod）、史丕曼－卡伯修正法（trimmedSpearman-Karbermethod）。

方法取捨依圖二之流程作判斷，詳細計算方式參見附錄。

（三）放流水之96小時TUa計算

１、TUa為LC50之倒數，即

　　　　TUa＝100%÷（96小時LC50）

２、若放流水水樣5個濃度之鯉魚死亡百分率均小於50%，則96小時之LC50>100%，換算之TUa<1.00。

３、若放流水水樣5個濃度之鯉魚死亡百分率均大於50%，則96小時之LC50<20%，換算之TUa>5.00。

４、若結果數據不符合前述2種狀況，則依八、

（一）之方法計算96小時LC50，再換算TUa。

九、品質管制

（一）試驗魚種必須確認為鯉魚，不可混合其他品種。

（二）執行毒性試驗後之試驗生物須廢棄，不得重複使用。

（三）初始毒性試驗：

依本方法執行生物急毒性試驗之實驗室，應先以氯化鈉進行初始毒性試驗，以證明該實驗室之試驗結果具備良好之穩定性。

初始毒性試驗之執行方式如下：

１、以氯化鈉進行至少5次毒性試驗。

２、前述毒性試驗每次皆應使用相同之試驗濃度：

氯化鈉以稀釋水溶解並適度稀釋為5個不同濃度，相鄰濃度之稀釋倍數不得超過2倍。

5個濃度中，至少須有2個會造成試驗生物部分死亡。

３、求取其LC50平均值及變異係數（coefficientofvariation,CV）。

生物試驗之CV值不得超過50%。

（四）空白試驗：

每次毒性試驗應至少伴隨一空白試驗。

若空白試驗之死亡率超過10%，則該次毒性試驗之試驗結果不可採用，必須重做。

（五）參考毒物試驗：

１、執行毒性試驗期間，每個月至少執行一次參考毒物試驗。

２、新購入之鯉魚馴養後須進行參考毒物試驗，以確定該批鯉魚之敏感度。

３、參考毒物試驗濃度須與初始毒性試驗一致。

試驗結果（LC50）須建立品質管制圖，建立方法參考「環境檢驗品質管制圖建立指引（NIEA-PA105）」之第4節，但管制上下限為±2SD。

若最近20次參考毒物試驗結果，有2次以上超出管制上下限，則須檢討誤差來源、執行矯正措施並重新進行參考毒物試驗。

十、精密度及準確度

　　單一實驗室以氯化鈉進行生物急毒性試驗結果，96小時LC50之平均值為9.25g/L，變異係數為25.2%（n=5）。

十一、參考資料

（一）USEPA.2002.MethodsforMeasuringtheAcuteToxicityofEffluentsandReceivingWaterstoFreshwaterandMarineOrganisms.5thed.OfficeofWater,U.S.EnvironmentalProtectionAgency,Washington,DC.EPA-821-R-02-012.

（二）APHA.2005.StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater,21stEdition,Section8711.AmericanPublicHealthAssociation,Washington,D.C.

（三）OECD.1992.GuidelineforTestingofChemicals,TestNo.203:

Fish,AcuteToxicityTest

（四）陳弘成，魚類毒性試驗標準方法之研究，EPA-83-E3S5-09-03-02，1994。

（五）李俊宏、柳家瑞，魚類急毒性試驗研究，環保署環境檢驗所環境調查研究年報第2號，1994。

（六）台灣魚類資料庫，http:

//fishdb.sinica.edu.tw/chi/home.php，中央研究院生物多樣性研究中心。

註1：

動物之科學應用應依「行政院農業委員會」訂定之「動物保護法」及其相關規定辦理。

生物屍體之清除及處理，依一般事業廢棄物相關規定辦理。

註2：

自來水可使用活性碳過濾或曝氣等方式去氯，但不可使用化學藥劑去氯。

註3：

每公升試驗水樣承受之試驗生物總重不得超過2.0g。

　圖一　鯉魚幼魚（圖中幼魚全長為2.3公分）

　　　　　　　　　　　　　　　　圖二　96小時LC50之計算流程圖

附錄　LC50計算方法

一、機率單位法

（一）使用條件

１、5個試驗濃度之死亡百分率，須有至少一個≧50%，及至少一個≦50%。

２、5個試驗濃度須有2個或2個以上的濃度有部分死亡的情形，也就是死亡百分率數據須有至少2個大於0且小於100%。

（二）計算步驟

１、可使用程式probit.exe進行計算（可參考美國環保署網站http:

//www.epa.gov/eerd/stat2.htm#tsk）。

２、probit.exe之輸入範例如圖1，輸出結果如圖2。

本程式之結果輸出檔為文字檔，內容包含異質性之卡方檢定結果（Chi-squaretestforheterogeneity）及LC50計算結果。

計算所得之卡方值（Chi-squareforheterogeneity（calculated））須小於查表值（tabularvalueat0.05level），LC50之計算結果才可採用。

３、若數據輸入後出現Overflow或錯誤訊息、結果輸出檔呈現錯誤訊息、或計算所得之卡方值未小於查表值，則改用史丕曼－卡伯法進行計算。

（三）範例

１、若結果數據如表1之結果1，因試驗濃度40%及60%出現部分死亡情形，故使用機率單位法進行計算。

２、執行probit.exe檔，數據輸入如圖1，結果如圖2。

（１）計算所得之卡方值（5.151）小於查表值（7.815），故機率單位模式適用於此組數據。

（２）LC50為56%，TUa為1.79。

二、史丕曼－卡伯法及史丕曼－卡伯修正法

（一）使用條件

１、5個試驗濃度之死亡百分率數據經過平滑化及調整後，須有至少一組≧50%，及至少一組≦50%。

２、5個試驗濃度之死亡百分率數據經過平滑化及調整後，必須有1個或1個以上的濃度有部分死亡的情形。

３、若最低濃度之平滑調整死亡百分率為0%，且最高濃度之平滑調整死亡百分率為100%，則使用史丕曼－卡伯法。

若不符合前述條件，則使用史丕曼－卡伯修正法。

（二）計算步驟

１、可使用程式tsk.exe進行計算（可參考美國環保署網站http:

//www.epa.gov/eerd/stat2.htm#tsk）。

２、tsk.exe之輸入範例如圖3，輸出結果如圖4。

本程式會自動進行死亡百分率數據之平滑化及調整，而結果輸出內容包含SPEARMAN-KARBERTRIM之數值及LC50計算結果。

（１）若SPEARMAN-KARBERTRIM之數值為0%，代表計算時使用史丕曼－卡伯法。

（２）若SPEARMAN-KARBERTRIM之數值非0%，代表計算時使用史丕曼－卡伯修正法。

（三）範例

１、若結果數據如表1之結果2，雖然試驗濃度40%及100%出現部分死亡情形，但機率單位法無法計算，故使用史丕曼－卡伯法或史丕曼－卡伯修正法進行計算。

２、執行tsk.exe檔，數據輸入如圖3，結果如圖4。

（１）計算所得之SPEARMAN-KARBERTRIM為20.51%，代表計算時使用史丕曼－卡伯修正法。

（２）LC50為92%，TUa為1.09。

三、圖解法：

適用於各濃度均無部分死亡的情形。

（一）5個試驗濃度之死亡百分率數據經過平滑化及調整後，須有至少一組≧50%，及至少一組≦50%。

（二）計算步驟

１、將死亡百分率數據平滑化：

（１）假設空白試驗之死亡百分率為p0，而樣品5個濃度之死亡百分率依序為p1、p2、……、p5（由低濃度至高濃度）。

若死亡百分率未依循p0≦……≦p5之順序，則必須進行平滑化。

（２）進行平滑化時，將不符合上述順序之相鄰死亡百分率加總後平均，再以平均值取代原有之死亡百分率。

　　舉例來說，若p1＝p2＝p3＜p0＜p4＝p5，則不符順序之數據為p0、p1、p2、p3。

此時需進行數據平滑化，將p0至p3加總平均，並以平滑後之死亡百分率取代原有之p0至p3：

p0s＝p1s＝p2s＝p3s＝（p0＋p1＋p2＋p3）/4。

２、死亡百分率調整：

完成死亡百分率平滑化後，若p0s≠0，則將樣品各濃度之死亡百分率依據p0s加以調整。

　　　　pia＝（pis－p0s）/（1－p0s）

　　pia：

稀釋樣品i之調整死亡百分率

　　pis：

稀釋樣品i之平滑化死亡百分率

　　p0s：

空白試驗之平滑化死亡百分率

３、將樣品濃度（對數座標軸）對調整死亡百分率（線性座標軸）作圖。

找出括住50%之兩點，畫一直線。

找出此一直線上死亡百分率為50%時之濃度值，即為LC50。

（三）範例

１、若結果數據如表1之結果3，死亡百分率計算結果依序為5%、0%、0%、0%、100%、100%。

２、因p0至p3未依循p0≦……≦p5之順序，故進行死亡百分率平滑化。

平滑後之死亡百分率依序為1.25%、1.25%、1.25%、1.25%、100%、100%。

３、因p0s≠0，故進行死亡百分率調整。

調整後之死亡百分率依序為0%、0%、0%、0%、100%、100%。

４、將樣品濃度（對數座標軸）對調整死亡百分率（線性座標軸）作圖如圖5。

在濃度60%及80%之資料點之間畫一直線，該直線上死亡百分率為50%時，濃度值為69.28%，故LC50為69%，TUa為1.45。

表1

　　　　　　　　　　　試驗生物死亡數量原始數據（每組之試驗生物均為20隻）

　　　　　　　　　　　　　　　　圖1　probit程式之輸入範例

　　　　　　　　　　　　　　　　圖2　probit程式之結果範例

　　　　　　　　　　　　　　　　圖3　tsk程式之輸入範例

　　　　　　　　　　　　　　　　圖4　tsk程式之結果範例

　　　　　　　　　　　　　　　　　　圖5　圖解法作圖範例