缓冲液的配制培训资料.docx
- 文档编号:25684519
- 上传时间:2023-06-11
- 格式:DOCX
- 页数:13
- 大小:24.44KB
缓冲液的配制培训资料.docx
《缓冲液的配制培训资料.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《缓冲液的配制培训资料.docx(13页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
缓冲液的配制培训资料
缓冲液的配制
Elisa相关试剂的配制
1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/LpH7.2PBS
NaH2PO4·2H2O——0.39克;Na2HPO4——1.27克;NaCl——0.85克;NaN3——200mg;H2O(蒸馏水)至1000ml
2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液PH7.4,PBST
NaCl——2.0克;KH2PO4——0.2克;Na2HPO4·12H2O——2.9克;KCl——0.2克;NaN3——0.2克;H2O至1000ml吐温(Tween)200.5ml;
4°C保存备用
3、包被液(简称CB)pH9.6
Na2CO3——1.59克;NaHCO3——2.93克;NaN3——0.2克;H2O至1000ml密封盖好,4°C存放备用
4、ELISA底物液(可溶性底物)
磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0
0.1mol/L柠檬酸(21.014克/100ML)——24.3ml;0.2mol/L Na2 HPO4(28.4克/L)——25.7ml;H2O ——50ml;
4°C存放备用
5、DAB底物液(不溶性底物,组化病理等)0.05mol/LpH7.6tris-HCL
Tris——6.05克;HCL(36%)——3.15克(约2.7ml浓HCL);H2O至1000mlDAB为3´,3´二氧基联苯胺,不溶性底物,呈棕红色
ELISA试剂配制及实验流程
是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
以双抗体夹心法举例说明。
试剂配制:
(1) 包被缓冲液(PH9.6 +0.2 0.05M碳酸盐缓冲液):
Na2CO3——1.59g ;NaHCO3 ——2.93g ;加蒸馏水至1000ml。
(用时稀释成1x,加0.1%BSA)
(2)洗涤缓冲液(PH7.4 0.15M PBST):
0.05%Tween-20——0.5ml;加在PBS缓冲液1000ml中。
PBS缓冲液:
KH2PO4——0.2g ;Na2PO4·12H2O——2.9g ;NaCl——8g ;KCl——0.2g; 加蒸馏水至1000ml。
(3)封闭缓冲液:
牛血清白蛋白(BSA)2%——2g ;(或5%脱脂奶粉)加洗涤缓冲液100ml。
(4)稀释液 :
牛血清白蛋白 0.1 % ——0.1g ;加PBS 缓冲液100ml。
(5) 底物缓冲液(PH5.0):
0.2M Na2HPO4(无水28.4g/L,带12结晶水71.7g/L) 取25.7ml 0.1M 柠檬酸(无水19.2g/L,带1结晶水21.01g/L)取24.3ml;加蒸馏水至100ml。
(或Na2HPO4·12H2O——1.84g ;柠檬酸·H2O ——0.51g 加蒸馏水至100ml)
(6)TMB(四甲基联苯胺)显色液(显蓝色):
TMB(2mg/ml水)——0.05ml; 底物缓冲液——0.95ml; 30% H2O2——0.001ml ;总体积1ml。
(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液(显黄棕色)(现配避光):
OPD(干粉)——0.004g ;底物缓冲液——10ml ;30% H2O2 ——0.015ml ;总体积——10ml。
(8)终止液(2M H2SO4):
在178.3ml水中,逐滴加入浓硫酸(18M,约98%)21.7ml,边加边摇。
操作步骤:
1. 包被:
用包被液将抗体(一抗)稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。
在每板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜(或37℃温育2~3小时)。
次日,弃去孔内溶
液,用洗涤液冲洗3次,中间振荡。
(简称洗涤,下同)。
2. 封闭:
加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中,置37℃温育2小时。
然后洗涤3次
3. 加样:
加待检样品0.1ml于反应孔中,置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔(不加样品),阴性对照孔(野生型)及阳性对照孔)。
4. 加一抗:
各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。
置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
5. 加酶标二抗:
各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。
37℃温育45分钟~1小时,洗涤5次。
6. 加底物液显色:
各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml(或OPD显色液),37℃暗处温育5~20分钟,或室温暗处10~40分钟充分变色。
7. 终止反应:
各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
(TMB底物蓝色变黄色,OPD底物黄色变棕色)
8.结果判定:
白色背景上肉眼直接观察结果,反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,可以依据所呈颜色的深浅,用“+”、“-”号表示测OD值:
在ELISA检测仪上,TMB底物法使用450nm测各孔OD值,OPD底物法使用492nm检测。
通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。
4 间接法
操作步骤:
1.包被:
用包被液将样品稀释(梯度稀释,比例自己定) 4℃过夜(或37℃温育2~3小时)。
次日,弃去孔内溶液,用洗涤液冲洗3次(5至7次),中间振荡。
(简称洗涤,下同)。
2. 封闭:
加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中,置37℃温育2小时。
然后洗涤。
3. 加一抗:
各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。
置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
4. 加酶标二抗:
各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。
37℃温育45分钟~1小时,洗涤5次。
5. 加底物液显色:
各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml(或OPD显色液),37℃暗处温育5~20分钟,或室温暗处10~40分钟充分变色。
6.终止反应:
各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
(TMB底物蓝色变黄色,OPD底物黄色变棕色)
7. 结果判定:
白色背景上肉眼直接观察结果,反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,可以依据所呈颜色的深浅,用“+”、“-”号表示测OD值:
在ELISA检测仪上,TMB底物法使用450nm测各孔OD值,OPD底物法使用492nm检测。
通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。
孕酮
1包被缓冲液,
(1)碳酸盐缓冲液(PH9.6+0.20.05M)
Na2CO3——1.59g;NaHCO3——2.93g;加蒸馏水至1000ml。
(2)tris缓冲液(0.05mol/L)50ml0.1mol/L(Tris)溶液与xml0.1mol/L盐酸混匀后,加水稀释至100ml
各种pH值的Tris缓冲液的配制
所需pH值(25℃)
0.1mol/LHCl的体积
7.1
45.7
7.2
44.7
7.3
43.4
7.4
42.0
7.5
40.3
7.6
38.5
7.7
36.6
7.8
34.5
7.9
32.0
8.0
29.2
8.1
26.2
8.2
22.9
8.3
19.9
8.4
17.2
8.5
14.7
8.6
12.4
8.7
10.3
8.8
8.5
8.9
7.0
某一特定pH值的0.05mol/LTris缓冲液的配制:
将50ml0.1mol/LTris碱溶液与上表所示相应体积(单位:
ml)的0.1ml/LHCl混合,加水将体积调至100ml
0.1mol/L盐酸的配置:
买来的浓盐酸是12mol/L的,以配制1L0.1mol/L的盐酸为例:
先用量筒量取8.3mL的浓盐酸倒入容量瓶,然后将溶液加蒸馏水稀释至体积为1L,此时的溶液就是0.1mol/L的盐酸。
0.1mol/Ltris的配置:
0.1mol/L溶液为12.114g/L
则配制600mlTris缓冲液的方法:
三羟甲基氨基甲烷:
3.6g
浓盐酸:
2.09ml
3)0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)
磷酸二氢钾——0.2g;磷酸氢二钠——2.90g;氯化钠——8g;加去离子水定容到1000ml。
2洗涤缓冲液(pH7.40.15mol/L)
0.05%Tween-20——0.5ml;加在PBS缓冲液1000ml中。
PBS缓冲液:
KH2PO4——0.2g;Na2HPO4·12H2O——2.9g;NaCl——8.0g;KCl——0.2g加蒸馏水至1000ml。
3测定缓冲液(Ph7.0含0.87﹪NaCl和0.1﹪BSA的0.1M磷酸缓冲液)用于标准孕酮,孕酮酶标物及奶样的稀释。
Na2HPO4·12H2O——21.85g;NaH2PO4·2H2O——6.08g;NaCl——8.70g;BSA——1.00g溶于1000mL蒸馏水中
4封闭缓冲液
牛血清白蛋白(BSA)2%——2g;(或5%脱脂奶粉)加洗涤缓冲液100ml。
0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0%BSA
2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml
5底物缓冲液(pH5.4)磷酸盐-柠檬酸缓冲液
0.2MNa2HPO4(无水28.4g/L,带12结晶水71.7g/L)取25.7ml
0.1M柠檬酸(无水19.2g/L,带1结晶水21.01g/L)取24.3ml
加蒸馏水至100ml。
或柠檬酸(C6H8O7·H2O)——0.47g;Na2HPO4·12H2O——2.00g;
6
(1)TMB(四甲基联苯胺)显色液(蓝色)
A液(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺,TMB):
称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中,完全溶解后,加双蒸水至100ml。
B液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液,pH5.0-5.4):
称取Na2HPO4·12H2O14.34g,柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水,加0.75%过氧化氢尿素1.28ml,定容至200ml,调pH至5.0-5.4。
将A液和B液按1:
l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液或TMB(2mg/ml水)——0.05ml:
底物缓冲液——0.95ml;30%H2O2——0.001ml;总体积1ml。
(2)OPD(邻苯二胺)显色液(黄棕色)(现配避光)
OPD(干粉)——0.004g;底物缓冲液——10ml;30%H2O2——0.015ml;总体积10ml。
(3)TMBS底物液(用于显色)
10mg四甲基联苯胺硫酸盐(TMBS)的二甲基亚砜溶液,用底物缓冲液配成0.2mg/ml的TMBS底物液。
用前加H2O2溶液30﹪左右。
7终止液2mol/LH2SO4用于终止反应
在178.3ml水中,逐滴加入浓硫酸(18M,约98%)21.7ml,边加边摇。
(浓H2SO4:
蒸馏水=1:
9)
抗原修复液:
根据待检测的抗原,选择适当的方法
附:
抗原修复液(10mMpH6.0枸橼酸钠缓冲液)的配制
(1)储备液的配制:
A:
枸橼酸三钠-2H2O29.41g+1000ml
B:
枸橼酸21g+蒸馏水1000ml
工作液的配置:
A液82ml+B液18ml+蒸馏水900ml
抗原修复方法:
高压锅处理技术:
枸橼酸钠缓冲液(10mM,PH6.0),淹没切片,盖上高压锅,高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却(可用自来水在高压锅外冲,以助冷却)
微波处理技术:
用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内,枸橼酸钠缓冲液淹没切片,选择中或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液;再选择中或高档,5分钟(最佳温度92~95℃)
抗原修复注意事项:
组织不能干,选择抗原修复方法要因抗体而异。
该方法主要用于10%福尔马林固定,石蜡包埋组织。
抗原修复后至DAB显色的过程中,均要用PBS缓冲液。
DAB的配制:
储备液(DAB25mg/ml)的配置:
DAB250mg+pbs10ml,待完全溶解后分装成1ml,100ul。
50ul,20ul,等—20℃冻存。
工作液:
DAB储存液20ul+PBS1000ul+3%H2O25ul;
2.0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,ph6.0,1000ml):
柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3.0.5mol/LEDTA缓冲液(ph8.0):
700ml水中溶解186.1gEDTA&8226;2H2O,用10mmol/LNaOH调至ph8.0,加水至1000ml.
4.1mol/L的TBS缓冲液(ph8.0):
在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水1000ml。
酶消化液:
a.0.1%胰蛋白酶:
用0.1%CaCl12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液:
用0.1N的HCl配制。
6.3%甲醇―H2O2溶液:
用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
7.风裱剂:
a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0–9.5)等量混合b油和TBS(PBS)配制
8.TBS/PBSPH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本
二抗稀释剂:
0.05%叠氮钠;0.01M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2(注:
1升)
注备:
1)二抗稀释剂可以储存在4ºC,6个月.
2)不要用含有牛血清白蛋白或其它血清的稀释剂来稀释二抗,因为二抗可能会与牛血清白蛋白或其它血清反应.
3)用TBS稀释二抗会降低染色,因此TBS用于有强背景的抗体活碱性磷酸酶标记得二抗,因为磷酸盐可以抑制碱性磷酸酶的活性.
辣根过氧化酶-链霉亲和素(HRP-StreptavidinDilutionBuffer)稀释剂:
0.01M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2(注:
1升)0.05%硫柳汞
注备:
此稀释剂可以储存在4ºC,6个月.
碱性磷酸酶-链霉亲和素(AP-StreptavidinDilutionBuffer)稀释剂:
0.05MTris缓冲液(TBS),pH7.6;0.05%硫柳汞
注备:
1)此稀释剂可以储存在4ºC,6个月.2)磷酸缓冲液不能用来稀释碱性磷酸酶-链霉亲和素,因为磷酸盐回抑制碱性磷酸酶活性.
荧光染料(Avidin-FITC,Avidin-TexasRed,Avidin-AMCA)稀释剂:
0.01M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2(注:
1升)0.05%硫柳汞
荧光封片剂
荧光染色封片剂有几种:
1.缓冲甘油封片介质(常用) 0.5mol/L 碳酸盐缓冲液(pH8.5),lOml;无荧光甘油(AR级),90ml,混合后在搅拌器上充分混匀。
2.聚乙烯醇—缓冲甘油混合介质 0.5mol/L 碳酸盐缓冲液(pH8.5),40ml;1%聚乙烯醇,lOml;分析纯甘油,lOml。
三液混合后,不断搅拌6h,72000g离心1h,吸取上清4℃保存备用。
3.荧光信号增强封片剂 聚乙烯醇40-88,4.8g;分析纯甘油,12ml;蒸馏水,12ml;0.2mol/L Tris盐酸缓冲液(pH8.5),24ml;l,4—重氮双环—[2,2,2]—辛烷,L 25g(终浓度约2.5%)。
另外有供应抗荧光衰减封片剂,以高纯度甘油为介质,内含抗荧光淬灭剂,有强烈的抗荧光衰减作用,用于对荧光组织和细胞样品的封片。
样品封片后4oC或-20oC避光保存2-3周,可最大限度延长荧光持续时间和维持荧光发光强度,同时封片剂中的其它成分有助于保持组织抗原抗体处于结合状态。
适用于所有光谱范围的荧光如FITC,Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7,DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。
|||荧光封片剂配制:
称取NaHC03 3.7克,无水Na2C03 0.6克溶于100m1三蒸水中,然后与甘油1:
1混合,4℃保存。
200微升的甘油和800微升的0.01M的PBS
伊红
(1)伊红(水溶性)
配方:
伊红(水溶性)2.5-5g
蒸馏水500ml
将水溶性伊红溶于蒸馏水中,然后加浓盐酸10毫升,充分搅拌,静置过夜后过滤。
过滤后的沉淀用蒸馏水冲洗二次,再过滤;将沉淀物连同滤纸一起放入温箱内干燥,加95%酒精1000毫升,配成饱和液。
使用前再用95%的酒精1:
1~2倍稀释,加入1~2%冰醋酸。
此方法具有染色时间快,颜色鲜艳,不容易褪色,使用寿命长等特点。
(2)伊红(醇溶性)
配方:
伊红(醇溶性)2.5-5g
75%酒精1000ml,加几滴冰醋酸至半透明状
TAE缓冲液
TAE是使用最广泛的缓冲系统。
其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量(TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量),且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%,电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果,此外,回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。
TAE的缺点是缓冲容量小,长时间电泳(如过夜)不可选用,除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。
50×TAEBuffer配制方法:
1。
称量Tris242g,Na2EDTA.2H2O37.2g于1L烧杯中;
2。
向烧杯中加入约800ml去离子水,充分搅拌均匀;
3。
加入57.1ml的冰乙酸,充分溶解;
4。
用NaOH调pH至8.3,加去离子水定容至1L后,室温保存。
使用时稀释50倍即1×TAEBuffer
(5×)TBE缓冲液1L
名称:
TBE(Tris硼酸),是一种PCR技术中用到的缓冲液。
445mmol/LTris碱——54g;445mmol/L硼酸盐——27.5g硼酸;;10mmol/LEDTA——20ml的0.5mol/LEDTA(pH8.0);水——补足1L
TRIS是一种最常用的生物缓冲液,常配成PH值为6.8,7.4,8.0,8.8。
其PH值随温度变化很大。
一般来说,温度每升高一度,PH值下降0.03。
1MTRIS-HCl6.8和1.5MTRIS-HCl8.8是SDS-PAGE最常用的试剂。
而由TRIS配成的TAE,TBE等是DNA电泳最常用的试剂,TE(PH8.0)主要用于溶解DNA。
TE为Tris加EDTA合称。
CAPS
现在蛋白质的PVDF转膜已经不用Tris-gly、SDS、20%甲醇缓冲液:
,因为缓冲液中有甘氨酸,所以测序的时候很难区分甘氨酸是BUFFER带进去还是蛋白质本身的。
现在测序用的转膜缓冲液是:
10mM/lCAPS,10%的甲醇。
CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是0~20%,一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白质的转移效果好,而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。
配制CAPS电印迹缓冲液。
方法如下:
10×CAPS(100mmol/L)
CAPS22.3g;加去离子水至900ml;用2mol/LNaOH(约20ml)将pH值调至11.0,然后定容至1L,贮存于4℃。
CAPS电印迹缓冲液(含10%甲醇的1×CAPS):
10×CAPS200ml;甲醇200ml;去离子水1600ml
stripping
1、strippingbuffer含有适量的SDS,在低ph值或适当的温度下,可以使膜上的大多数抗原抗体复合物分开。
使用strippingbuffer可以去除一抗和二抗,然后可以重新利用膜。
2、完全可以用同一种抗体再杂交一次。
我的经验是同一张膜stipping3次就差不多了,而且用同一种一抗,信号强度是一次比一次递减的。
strip的配方有多种,不同的配方,strip的原理都不太相同。
但是目的都只有一个,那就是使膜上的抗原抗体复合物分开。
(洗脱一抗二抗)
StrippingBuffer配方:
β-mercaptoethanol342μl;
20%SDS5ml;1MTris-ClpH6.73.125ml;加ddH2O至50ml。
方法:
将用过的膜浸入strippingbuffer中,置50℃水浴箱中30min,间断振摇。
之后用TTBS洗3*5min就好。
此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。
CBS(ELISA抗原包被缓冲液)
包被缓冲液(pH9.6,0.05M碳酸盐缓冲液):
NaHCO3——1.59克;NaHCO3——2.93克;加蒸馏水至1000ml
TBS
TBS即Tris缓冲盐水,是Tris-HCl缓冲盐溶液,为等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液,在做WesternBlot时用到。
配制方法如下:
1mol/LTris·HCl(pH7.5)——10ml;NaCl——8.8g;蒸馏水至1000ml;
TBST(TTBS)
TBST中含有Tris-Hcl,NaCl,tween20这三种物质,是做WESTERNBLOT中常用的一种缓冲溶液。
Tween是一种离子表面活性剂,它可加速抗体非特异性结合的分离。
Tween20含量0.05%。
告诉大家一个免调pH值的10×TBST配方,相信可以解决你的问题,同时也能让广大战友省力不少!
体积1000ml包括:
Tris:
30.28g;NaCl:
87.66g;HCl:
17ml;Tween20:
5ml;使用之前稀释10倍即可!
PBS
磷酸盐缓冲液(简称PBS)的是常用的用于生物学研究的一个缓冲溶液。
它是一种水基盐溶液中含有氯化钠,磷酸盐,以及(在某些配方)氯化钾和磷酸钾。
缓冲液有助于保持恒定的pH值。
解决方案的渗透压和离子浓度通常与人体pH相近(等渗)。
Elisa洗涤缓冲液(PH7.4PBS):
0.15M
KH2PO4——0.2克;Na2HPO4•12H2O——2.9克;NaCl——8.0克;KCl——0.2克;Tween-20 0.05%——0.5ml;加蒸馏水至1000ml;
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 缓冲液 配制 培训资料