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第二章细胞生物学研究方法细胞生物学的研究方法归纳起来大体上可划分为四大类:
形态观察、生化分析、生理检测、实验性操作形态观察、生化分析、生理检测、实验性操作技术。
技术。
光学显微镜(lightmicroscope)电子显微镜(electronmicroscope)第一节细胞形态结构的观察方法尼康E-600显微镜一、光学显微镜一、光学显微镜(一一)普普通通光光学学显微镜显微镜普通显微镜由聚光器、物镜和目镜三部分组成。
LightPathwayofMicroscope普通显微镜最大放大倍数普通显微镜最大放大倍数1000100015001500倍倍因为它的分辨率有限,再放大也是空放大因为它的分辨率有限,再放大也是空放大分辨率(resolution):
能将物体相近两点分辨清楚的距离极限D=0.61/N.A.代表光波波长;N.A.为镜口率,也称数值孔径。
N.A.=nSin/2n:
物镜与标本间介质的折射率;(1或1.515):
镜口角(聚光焦点对物镜镜口的张角,180)物镜镜口标本结论:
结论:
通过公式可知通过公式可知光学显光学显微镜最大分辨率微镜最大分辨率0.2um减小分辨率需减小介质空气水香柏油溴萘折射率11.331.5151.66显微镜的几个光学特点:
sin/2的最大值小于1;普通光线的波长为400700nm,光镜分辨力约为0.2m,人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大有效倍数为1000X。
普通光学显微镜神经节细胞内高尔基体
(二)紫外线显微镜(ultravioletmicroscope)根据光学原理,光源光波越短,显微镜的分辨本领越大。
紫外线显微镜以紫外线为光源,分辨率可提高一倍。
可看到在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。
可用来测定细胞中的核酸含量。
透镜:
石英、萤石(CaF2)、碳酸锂等制作。
价格昂贵,使用受限。
(三)荧光显微镜(fluorescentmicroscope)20世纪40年代在紫外线显微镜基础上发明。
原理:
细胞中有些物质,如叶绿素等,受激发光照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经过照射也可发荧光。
荧光显微镜对这类物质进行定性或定量研究。
结构:
在普通光学显微镜上添加一些附件:
A.光源:
通常采用超高压汞灯或氙灯,由它发出各种波长的光。
B.滤片:
根据性能分为两组。
一是激发滤片,作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上,而将其它光都吸收掉。
二是阻断滤片,安装在物镜后,作用是吸收和阻挡激发光进入目镜,以免干扰荧光和刺伤眼睛;选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。
敏感性高,主要用于细胞结构和化学成分等的研究。
荧光显微镜荧光显微照片(微管绿,微丝红,核蓝)(四)暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)原理:
显微镜加装挡光片,使直射光不能进入物镜,只允许被标本反射、衍射的光线进入物镜特点:
视野的背景是暗的,样品的边缘是亮的。
特殊装置:
在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野光阑(五)相差显微镜(phasecontrastmicroscope)相差显微镜由PZernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。
这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
原理:
将透过标本的可见光的光程差(也就是相位差)变成明暗差(即振幅差),从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。
构造:
聚光器或光源上安装环状光阑(annulardiaphragm);在物镜中加了环形相板(annularphaseplate)。
主主要要用用于于观观察察活活细细胞胞或或活活组组织织,是是体体外外细细胞胞和和组组织织培养工作的重要工具。
培养工作的重要工具。
相差显微镜体外培养的Hela细胞(六)微分干涉相差显微镜(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope)1952年,Normaski在相差显微镜原理的基础上发明。
能显示结构的三维立体投影影像。
DIC显微镜下的硅藻分离的有丝分裂纺锤体左、微分干涉显微镜;右、相差显微镜;(七)激光共聚焦扫描显微镜(laserconfocalscanningmicroscope)用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,图像以电信号形式记录。
由于激光束的波长较短,光束很细,有效排除焦点以外的光信号干扰,所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力,大约是普通光学显微镜的3倍。
激光共聚焦扫描显微镜随时采集记录信号,既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。
laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)光学显微镜小结普通光学显微镜:
0.2um紫外线显微镜:
0.1um荧光显微镜暗视野显微镜相差显微镜微分干涉差显微镜激光共聚焦扫描显微镜二、电子显微镜(二、电子显微镜(electronmicroscopeelectronmicroscope)简称电镜简称电镜电子显微镜以电子束代替了可见光,大大提高了显微镜的分辨率,可以观察细胞的亚显微结构。
电子束的波长与电压成反比,波长极短。
例如,电压为6万伏,则=0.0488埃,比最短的可见光4000埃约小10万倍。
德国西门子公司制成了第一台电子显微镜,当时分辨率只有3nm。
1964年后达到0.3nm,现在最佳性能的电镜分辨本领可达0.1-0.2nm。
电镜的基本构造主要如下:
A:
电子束照明系统;B:
电磁透镜成像系统;C:
真空系统;D:
记录系统;E:
电源系统。
电镜与光镜的主要区别:
光光镜镜电镜电镜光光源源可见光电子束介介质质空气(香柏油)真空聚光聚光镜镜光学透镜电磁透镜分辨力分辨力0.30.1um0.1nm放放大大倍倍数数1000倍百万倍
(一)透射电子显微镜(TEM:
transmissionelectronmicroscope)观察标本内部细微结构放大近百万倍超薄切片(500埃)通常以锇酸和戊二醛固定样品,以环氧树脂包埋,以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片,切片采用重金属盐染色,以增大反差。
JEM-1011透射电子显微镜细胞毒T细胞结合到靶细胞(肿瘤细胞)上细胞毒T细胞杀死了靶细胞冰冻蚀刻(freeze-etching),或冰冻断裂(freeze-fracture)配合透射电镜观察而设计的一种标本制作技术。
配合透射电镜观察而设计的一种标本制作技术。
研究生物膜内部结构的有用技术。
研究生物膜内部结构的有用技术。
主要步骤主要步骤:
A.A.冰冻标本(冰冻标本(-100-10000CC干冰或干冰或-196-19600CC液氮)液氮)B.B.冷刀断开标本(冰冻断裂)冷刀断开标本(冰冻断裂)C.C.升温,冰升华,断裂面结构暴露(蚀刻)升温,冰升华,断裂面结构暴露(蚀刻)D.D.表面喷一层蒸汽碳和铂,表面喷一层蒸汽碳和铂,E.E.将组织溶掉,碳和铂的膜称复膜(将组织溶掉,碳和铂的膜称复膜(replicareplica)F.F.电镜下观察复膜,复膜构造电镜下观察复膜,复膜构造=标本构造标本构造蚀刻复膜(replica)冰冻蚀刻电镜照片
(二)扫描电子显微镜(SEM:
scanningelectronmicroscope)观察标本表面形态结构标本特殊处理:
固定脱水后,喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
JEOL扫描电子显微镜人类血细胞SEM照片弹性纤维网左:
狗主动脉的低倍扫描电镜图片;右:
同一血管外层的纵向排列的致密弹性纤维网(高放大倍数)。
其它成分已用酶和甲酸消化。
一个典型的有丝分裂中期的染色体近末端区域的扫描电镜照片一个有丝分裂染色体的染色单体的透射电镜照片一个正在分裂的动物培养细胞,扫描电镜图片早期小鼠胚胎的扫描电镜照片A:
2细胞时期B:
4细胞时期C:
8-16细胞时期,桑椹胚D:
胚泡期ABCD三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜(scanningtunneling(scanningtunnelingmicroscope,STM)microscope,STM)Binning,Rohrer等1981年发明,获1986年诺贝尔奖。
用来显示晶体表面原子布阵的一种显微镜。
原理:
加上一定电压的精密探针。
钨丝或白金丝,直径几个埃。
电子在样品与探针之间(距离几个埃)转移形成电流。
特点:
分辨率高,横向为0.1-0.2nm,纵向为0.001nm.三维图像。
三态物质均可观察。
细胞化学和组织化学技术免疫细胞化学显微光谱分析技术放射自显影术超离心技术分子杂交技术PCR技术第二节生物化学分析一、细胞化学和组织化学技术细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理,从而对某种成分进行研究和分析。
细胞的各种成分几乎都能显示,包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。
例:
DNA的Feulgen反应显示法1924年,Feulgen和Rossenbeck发明。
原理:
盐酸水解,DNA分子中的嘌呤碱基被解离,出现醛基,试剂中的无色品红与醛基反应,呈现紫红色,以鉴定DNA的存在。
例:
PAS(过碘酸席夫反应)鉴定多糖类物质醛基与Schiff试剂反应,生成红色化合物。
小鼠肝细胞中糖原人肝癌细胞中的微丝蛋白二、免疫细胞化学(immunocytochemistry)是根据免疫学原理,利用抗体同特异抗原专一结合,对抗原进行定位测定的技术。
抗原主要为大分子或与大分子结合的小分子;抗体则是细胞针对特异的抗原分泌的蛋白。
如果将抗体结合上标记物,再与组织中的抗原发生反应,即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。
方法:
原位分析体外蛋白质分析
(一)原位分析免疫反应直接法:
Ag+Ab*镜检(*代表标记物)间接法:
Ag+Ab1+Ab2*镜检NSE标记神经元GFAP标记星形胶质细胞
(二)体外蛋白质分析蛋白质印迹法(Westernblotting)技术路线:
样品制备样品分离样品转移免疫反应检测蛋白质由SDS聚丙烯凝胶硝酸纤维素膜转移的过程即为印迹(blotting)三、显微光谱分析技术细胞中有些成分具有特定的吸收光谱,核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线,如核酸的吸收波长260nm,蛋白质280nm。
有些成分经组织化学染色后,对可见光有特定的吸收光谱。
四、流式细胞术仪器:
流式细胞仪flowcytometer特点:
细胞是高速运动的主要应用:
用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量;测定细胞群体中不同时相细胞的数量;从细胞群体中分离某些特异染色的细胞。
五、放射自显影(radioautography)放射自显影技术:
利用放射性物质使照相乳胶膜感光,再经显影以显示该物质自身的存在部位的技术。
由于有机大分子均含有碳、氢原子,实验室一般采用14C、3H标记。
14C、3H均为弱放射性同位素,半衰期长。
一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷来显示DNA,用3H尿嘧啶核苷显示RNA。
在研究蛋白质和粘多糖时,分别选用3H氨基酸、3H甘露糖、3H岩藻糖等。
3H-尿嘧啶脉冲标记的细胞,示异染色质区(核内白色区)无转录活性五、超离心技术高速离心:
1000025000r/min超速离心:
转速大于25000r/min沉降系数(“S”Svedbergunit):
单位离心场中溶质分子的沉降速度,以每单位重力的沉降时间表示,1S相当于110-13s离心目的:
分离细胞器与生物大分子及其复合物离心种类:
分析离心:
分析离心:
用于分析和测定制剂中的大分子的种类和性质等制备离心制备离心:
差速离心:
分离密度不同的细胞组分密度梯度离心:
精细组分或生物大分子的分离(介质蔗糖、氯化铯)差速离心(分离细胞器)密度梯度离心蔗糖CsCl六、分子杂交技术(molecularhybridiz
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