植物细胞组织培养的基本技术总结版.docx
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植物细胞组织培养的基本技术总结版
本章主要内容
●商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备
●培养基及其配制
●外植体的选择与培养
●试管苗的驯化与移载
第一节商业性组织培养实验室和小工厂
的设计与主要设备
●培养皿的清洗;
●培养基的配制、分装和高压灭菌;
●无菌操作——材料的表面灭菌和接种;
●将培养物放到培养室培养;
●试管苗的驯化、移栽和初期管理。
(一)、洗涤室(cleaningroom)
●洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。
●室内配备:
●大型水槽,最好是白瓷水槽。
为防止碰坏玻璃器皿,可铺垫橡胶。
上下水道要畅通。
●备有塑料筐,用于运输培养器皿。
●备有干燥架,用于放置干燥涮净的培养器皿。
(二)、准备室(repairingroom)
●完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。
准备室要求明亮、通风。
●如果房间较多,可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。
洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作;配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。
(三)、缓冲室
●进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋,戴上口罩。
●应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。
控制无菌室及培养室的配电板等。
(四)、无菌操作室(transferingroom)
●接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。
其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。
●配置:
●在工作方便的前提下,接种室宜小不宜大,一般7-8m2,要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑,易于清洁和消毒。
配置拉动门,以减少开关门时的空气扰动。
●接种室要求干爽安静,清洁明亮。
在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯,用以照射灭菌。
最好安装一小型空调,使室温可控,这样可使门窗紧闭,减少与外界空气对流。
(五)、培养室(culturingroom)
●培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。
培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。
●设计原则:
●充分利用空间和节省
●能源
●高度比培养架略高为
●宜
●周围墙壁要求有绝热
防火的性能。
(五)、培养室(culturingroom)
●培养架大多由金属制成。
●规格:
●一般设5层,最低一层离地高约10cm,其他每层间隔30cm左右,培养架即高1.7m左右。
培养架长度都是根据日光灯的长度而设计,如采用40W日光灯,则长1.3m,30W的长1m,宽度一般为60cm。
●培养室最重要的因子是温度,一般保持在20-27℃左右,具备产热装置,并安装窗式或立式空调机。
由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度,最好不同种类有不同的培养室。
室内湿度也要求恒定,相对湿度以保持在70%-80%为好,可安装加湿器。
●控制日光照时间可安装定时开
关钟,一般需要每天光照10-16h。
也有的需要连续照明。
现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源,这样不但可以节省能源,而且组培苗接受太阳光生长良好,驯化易成活。
(六)、驯化室
●驯化室要求清洁无菌,配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。
(七)、温室
●应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。
二、仪器设备和器皿用具
●常见仪器设备
●1、超净台
●2、无菌箱
●3、空调机
●4、除湿机
●5、恒温箱
●6、烘箱
●7、高压灭菌锅
●8、冰箱
●9、电子分析天平和托盘天平
●10、显微镜及解剖镜
●11、水浴锅
●12、摇床与转床
●13、磁力搅拌器
●14、电蒸馏水器
●15、酸度计
●16、离心机
1、超净台和无菌箱
●1、超净台,优点是操作方便自如,比较舒适,工作效率高,准备时间短。
开机10分钟即可操作,可进行长时间使用。
在工厂化生产中,接种工作量很大,需要经常长久地工作时,超净台是很理想的设备。
●2、无菌箱,在投资少的情况下,可以用接种箱来代替超净台。
接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。
但操作活动受限制,准备时间长,工作效率低。
工作原理
●超净台功率在145-260W左右,它装有小型鼓风机,使空气穿过一个前置过滤器,在这里把大部分空气尘埃先过滤掉,然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器,它除去了大于0.3um的尘埃、细菌和真菌孢子等,最后以较洁净的气流吹到工作台面。
超净空气的流速为每分钟24-30m,这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染,这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。
在这样的无菌条件下操作,就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。
●根据风幕形成的方式,超净台可分为水平式和垂直式二种型号。
(二)各类玻璃器皿
1、培养器皿
2、分注器
3、离心管
4、刻度移液管
5、细菌过滤器
6、实验器皿
1、培养器皿
●1、培养器皿:
在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。
要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成,以保证长期贮存药品及培养的效果;培养用的还要求透光度好,能耐高压高温,能方便放入培养基和培养材料的器皿,根据培养的目的和要求,可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。
其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。
●最常使用的是
●三角瓶
●培养皿(9、12cm直径)用于:
游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。
●试管(18mmXl80mm或20mmX200mm)用于:
培养较高的试管苗。
●工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶,加盖半透明的塑料盖,由于瓶口大,所以大量繁殖时操作方便、工作效率高,也减少了培养材料的损伤。
但缺点是易引起污染。
瓶口封塞
●瓶口封塞可用多种方法,要具有一定的通气性和密闭性,以防止培养基干燥和杂菌污染。
●以前封口常用棉塞。
但这种封口办法夏季极易污染,且不易保持培养基的湿度。
现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口,以线绳结扎或橡皮圈箍扎。
为了增加通气性,可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。
这样经济方便,且通气好。
也可采用专用的封口膜。
5、细菌过滤器
●用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。
一般采用0.22um微孔滤膜进行抽滤灭菌。
包括滤头,注射器或采用抽滤装置:
真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。
6、实验器皿
●在组织培养中配制培养基,贮藏母液,材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿,包括:
●100ml、250ml、500ml、1000ml烧杯;
●l0ml、l00ml、1000ml量筒;
●l00ml、1000ml试剂瓶(棕色)等等。
(三)、器械用具(P13)
●1.镊子类:
尖头和枪形
●2.剪刀类
●3.解剖刀
●4.解剖针
●5、接种工具:
接种针、接种钩及接种铲(由白金丝或镍丝制成)
●6、钻孔器
●7、其它:
酒精灯,电炉,试管架,搪瓷盘等
第二节培养基及其配置
●目的要求:
●
(1)一般掌握培养基的种类、特点;
●
(2)掌握基本培养基的配方;
●(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量;
●(4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤;
●(5)熟练掌握培养基的灭菌方法;
●(6)一般掌握培养基的筛选办法。
培养基及其配制
●培养基的种类
●培养基的成分
●培养基配制
1.培养基的种类
●按成分分类:
●MS,B5,White,NT,KM-8P,N6等。
●按状态:
液体,固体。
(1)MS培养基(MurashigeandSkoogMedium)
MS培养基(MurashigeandSkoogMedium)
●ToshioMurashige,FolkeSkoog.ARevisedMediumforRapidGrowthandBioAssayswithTobaccoTissueCultures.Physiol.Plant.1962,15:
473-497.
●植物组织培养中常用的一种培养基。
●离子浓度较高,硝酸盐含量较其他培养基高。
●器官,花药,细胞,原生质体培养。
(2)B5培养基(B5Medium)
●Gamborg,O.L.;Miller,R.A.;Ojima,K.Nutrientrequirementsofsuspensionculturesofsoybeanrootcells.Exp.CellRes.50:
151–158;1968.
B5培养基(B5Medium)
●铵含量较低
●木本植物,十字花科植物
(3)White培养基(WhiteMedium)
●White,P.R.Handbookofplanttissueculture.NewYork:
TheRonaldPressCo.;1943.White,P.R.;Grove,A.R.Proceedings,InternationalConferenceonPlant
●TissueCulture(1963:
UniversityPark,PA).Berkeley,CA:
McCutchanPub.Corp.;1965:
553pp.
●无机盐含量低
●生根培养
(4)NT培养基(NTMedium)
●1970
●烟草叶肉原生质体培养
(5)KM-8培养基(KM-8Medium)
●1974
●有机成分复杂,包括所有单糖和维生素,呼吸代谢主要有机酸
●原生质体和融合体培养
(6)N6培养基(N6Medium)
●1974,朱至清等。
●成分简单,KNO3和(NH4)2SO4含量高
●小麦,水稻及其他植物花药培养和组织培养
2.培养基的成分
●水
●无机营养成分
●有机营养成分
●植物生长调节剂
●附加成分
(1)水
●培养基的主要组分
●水是植物原生质体的组成成分,也是一切代谢过程的介质和溶媒,是生命活动过程中不可缺少的物质。
●配制培养基母液时要用蒸馏水,以保持母液及培养基成分的精确性,防止储藏过程发霉变质。
大规模生产时可用自来水。
(2)无机营养组分
●作用
●满足植物对各矿质元素的需求。
●大量元素,6种
●微量元素,7种
●非必须元素,6种
铁采用螯合铁,FeSO4加EDTA
(3)有机营养成分
●碳源
●蔗糖
●维生素类
●硫胺素(B1),烟酸(B3),吡哆醇(B6),泛酸钙(B5),肌醇。
●氨基酸
●蛋白质组成成分,促进细胞生长。
●其他有机附加物
●椰子汁,酵母提取物,马铃薯,水解酪蛋白等。
可以促进组织生长。
●椰子汁
●椰子的液体胚乳。
它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。
一般使用浓度在10%-20%。
它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。
●马铃薯
去掉皮和芽后,加水煮30分钟,再经过过滤,取其滤液使用。
对PH值缓冲作用大。
添加后可得到健壮的植株。
其他
●酵母提取物,香蕉,水解酪蛋白等。
(4)植物生长调节物质
●生长素
●细胞分裂素
●赤霉素
●乙烯
生长素﹑赤霉素﹑细胞分裂素﹑
脱落酸﹑乙烯
-------植物激素“五兄弟”
●生长素(auxin)的发现
向光性:
在单侧光的照射下,植物朝向光源方向生长的现象。
1、19世纪末达尔文(C.R.Darwin)实验
实验材料:
胚芽鞘
总结上述三个实验,达尔文提出:
胚芽鞘尖端受单侧光刺激后,就向下面的伸长区传递影响,造成伸长区背光面比向光面生长快,因而使胚芽鞘出现向光弯曲。
2.1910年詹森(B.Jensen)的实验
结论:
胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。
3.1914年拜尔(Paal)的实验
结论:
胚芽鞘的弯曲生长,是因为尖端产生的影响在其下部分布不均匀造成的。
4、1928年(F.W.Went)温特的实验
结论:
胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化学物质引起的,并命名为生长素。
●1934年从人尿分离出具有生长素效应的物质——吲哚乙酸。
●1942年从高等植物中分离出生长素,并确认是IAA。
●在植物体内,具有促进植物生长的功能,除了吲哚乙酸(IAA)外,还有苯乙酸(PAA)和吲哚丁酸(IBA)。
生长素生理作用的应用
●顶端优势
●植物的向光性
●根的向重力性(向地性)
●茎的背重力性(背地性)
顶端优势:
植物的顶芽优先生长,而侧芽生长受抑制的现象。
形成原因:
顶芽产生的生长素向下运输,大量地积累在侧芽部位,侧芽对生长素浓度又比较敏感,使侧芽的生长受到抑制。
茎的背地性和根的向地性生长
植物向光性
在单侧光线照射下,
背光侧>向光侧,背光侧细胞生长快
结果使茎朝向光源一侧弯曲
生长素类似物的应用
(1)促进扦插的枝条生根
(2)促进果实发育(培育无籽果实)
(3)防止落花落果,疏花疏果
(4)用作除草剂
1、促进扦插枝条生根
用一定浓度的生长素类似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。
2、生长素促进果实发育(无籽果实)
传粉受精后,胚珠发育成种子的过程中产生大量生长素,促进子房发育成果实。
如何培育无籽果实?
在没有接受花粉的雌蕊柱头上涂上一定浓度的生长素类似物,使子房正常发育为果实,因为没有受精,果实内没有种子。
3、防止落花落果
农业生产上常用一定浓度的生长素类似物溶液喷洒棉株,可以达到保蕾保铃的效果。
4、杂草的除草剂
如(2,4-D),适用于麦田、稻田,双子叶植物比单子叶植物对生长素更敏感,用高浓度的除草剂能抑制双子叶植物(杂草)的生长。
生长素(auxin)
●吲哚乙酸(IAA,天然),奈乙酸(NAA),二氯苯氧乙酸(2,4-D),吲哚丁酸(IBA),2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)。
●促进细胞分裂与根分化
●2,4-D有强烈的愈伤组织诱导能力,但抑制器官分化
细胞分裂素(cytokinin)
●激动素(KT),6-苄基腺嘌呤(6-BA),玉米素(ZT),异戊烯氨基嘌呤(2IP)
●刺激细胞分裂,诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高,抑制根的生长。
●细胞分裂素常与生长素相互配合,用以调节细胞分裂,细胞伸长,细胞分化和器官形成。
细胞分裂素主要作用:
促进细胞分裂
细胞分裂素与生长素相互作用
●生长素与细胞分裂素的比例被称为“激素杠杆”,决定着发育的方向。
●当生长素含量高于细胞分裂素时,主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成
●当细胞分裂素的效应高于生长素时,主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。
生长素含量高于细胞分裂素
2,4-D1mg∕L+6-BA0.1mg∕L
生长素含量低于细胞分裂素
赤霉素(gibberelinacid)
●GA3
●促进细胞生长
●刺激不定胚发育成正常小植株
病苗细长,叶色淡绿,比健苗高,病株节间伸长,茎节上逆生不定根,茎杆逐渐变褐,腐烂,其内有白色蜘蛛丝状菌丝。
将赤霉菌培养基的滤液喷洒稻健康水稻幼苗上不感染赤霉菌,却有恶苗病的症状。
1935年科学家从培养基滤液中分离出赤霉素(GA)
GA3诱导甘蓝茎的伸长,产生超长茎
GA3对矮生型豌豆的效应对照
主要作用
促进细胞伸长
促进种子萌发
果实发育
合成部位
幼叶、幼芽、幼根、未成熟的种子
乙烯在常温下是气体。
作为生长调节剂用的是乙烯利。
促进果实着色和成熟
乙烯(ethylene)
●对芽的诱导具有一定作用
●在生理环境的温度和压力下,是一种气体,比空气轻,实验中很难掌握用量,所以一般不使用
●培养的植物组织也会产生乙烯,如果封口用的是不透气的塑料膜,容器内就会逐渐积累乙烯,严重时可引起培养物的死亡
●AgNO3可逆转乙烯的抑制作用
(5)附加组分
●活性炭
●渗压剂
●硝酸银
●抗生素
●凝固剂
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