分子生物学试验报告.docx
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分子生物学试验报告
实验一真核基因组DNA的制备与分析
一、实验步骤
1、材料处理
(1)取<1g的组织块,用生理盐水洗净,剪碎至糜状。
(2)将上述组织碎末加入盛有10倍体积(m/v)裂解液的50mL离心管中,37℃水浴1h。
2、用蛋白酶K和苯酚处理细胞裂解液
(1)加蛋白酶K至终浓度为100ug/ml,温和地将酶混入粘滞的溶液中。
(2)将裂解细胞的悬浮液置于55℃水浴3h,不时的温和旋动该粘滞溶液,至看不到明显的组织块为止。
(3)将溶液冷却至室温,加等体积Tris平衡酚,缓慢的来回颠倒离心管至两相混合形成乳浊液,于室温以5000g离心10min,使两相分开。
(4)用大口径移液管将上层粘稠的水相移到一洁净的离心管中,用酚重复抽提2次。
(5)第三次酚抽提后,将水相移至另一离心管中,于室温加0.2体积的10M乙酸铵和2倍体积的乙醇,转动离心管使溶液充分混合,DNA立即形成沉淀,通常可用吸管将沉淀从乙醇溶液中移除。
如果DNA沉淀为碎片,则与室温离心收集。
(6)DNA沉淀用70%的乙醇洗涤,离心收集。
将离心管于室温下放置实验台上,直至乙醇挥发殆尽。
不要使DNA沉淀完全干燥,否则极难溶解。
(7)待沉淀将近透明后加适量的TE溶解DNA,通常需要12-24小时使DNA完全溶解,将DNA溶液存于4℃.
3、DNA琼脂糖凝胶电泳检测
小型凝胶电泳提供了一种定量测定DNA并分析其物理状态的便捷方法。
若样品中含有较多RNA时可选用此法。
(1)制备0.6%的琼脂糖凝胶。
(2)取适量DNA样品,与凝胶上样缓冲液混合,加至上述凝胶上样孔内。
(3)取适量标准DNA溶液同样加至凝胶上样孔内。
(4)电泳,电压为1V/cm,距离以阳极至阴极为准。
(5)电泳结束后,将凝胶放入含溴化乙锭(0.5μg/mL)的水中室温浸染30-45min,用紫外灯观察凝胶和照相。
二、实验结果
如上图所示,基因组DNA在0.6%琼脂糖凝胶上跑出50kb左右的单一条带,但有个别组的样没有明显的条带出现。
三、结果分析
提取的基因组DNA片段大概50kb左右,虽说基因组DNA非常大,但在提取的过程中全部都断裂成同样大小的片段,因为枪头的空间大小,动作的剧烈程度可以使同一批的基因组DNA断裂成大致相同的大小。
有个别组的基因组DNA在琼脂糖凝胶上未显示出条带,可能是由于实验操作不当引起的。
实验二质粒DNA的小量制备
一、实验步骤
1、培养细菌扩增质粒
(1)将2mLLB加入到容量为20mL的灭菌试管中,根据质粒的抗性于2mLLB液体培养基内加入氨苄青霉素,终浓度为100ug/mL。
(2)用接种环挑取1个单菌落或吸取少量菌液于上LB液体培养基中,37℃,剧烈震荡培养过夜。
2、收集菌体和裂解细菌
(1)取1.0mL培养液置微量离心管中,离心,12000r/min,30秒,弃去上清,保留菌体沉淀。
用吸水纸吸取残留液体,使菌体尽可能干燥。
(2)将菌体沉淀悬浮于预冷的100uL溶液I中,剧烈震荡,混匀。
(3)加入200uL新鲜配制的溶液II,盖紧盖口,快速颠倒离心管数次,确保混匀,置于冰上。
3、分离纯化质粒DNA
(1)加入150uL的冰预冷溶液III,盖紧盖口,温和颠倒数次混匀冰上放置5min,使沉淀完全。
(2)4℃下离心,12000r/min,5min,上清液转移至另一干净的离心管内。
(3)在上述溶液中加入两倍体积预冷无水乙醇,混合摇匀,室温放置10min。
4℃下离心,12000r/min,5min,弃去上清夜,并将离心管倒置在吸水纸上,空干管壁粘稠的溶液。
(4)加入70%冷乙醇1mL,洗涤沉淀物,离心,弃去上清夜,尽可能除净管壁上的液体,放置干燥,即得质粒DNA制品。
(5)将DNA沉淀溶于20uLTE缓冲液,置-20℃保存。
4、质粒DNA的电泳检测
制备0.7%琼脂糖凝胶,取质粒DNA样品5uL,加1uLloadingbuffer混匀上样,采用1V/cm的电压,使DNA分子从负极向正极移动至合适位置,取出凝胶置紫外灯下观察,照相。
二、实验结果
本次实验所用质粒为,pEGFP-N1其片段大小为4733bp,在0.7%的琼脂糖胶上跑出3kb左右大小的条带为其超螺旋结构大小。
点样孔处的亮带为杂质蛋白质,胶下端的亮带为杂质RNA,量较多。
三、结果分析
电泳图中每个点样孔都跑出了多条带,是由于在提取质粒DNA过程中操作过于剧烈,导致DNA片段的断裂,形成了超螺旋,开环和线性结构的DNA。
杂质RNA过多的原因是因为没有经过RNA酶的处理,此外,酚氯仿的抽提也能去除部分杂质。
各组提取的DNA量也有所差别,可能原因是操作中存在个体差异,最终导致提取量的区别。
实验三感受态大肠杆菌的制备和转化
一、实验步骤
(一)制备感受态细胞
1、前夜接种受体菌(DH5a),挑取单菌落于LB培养基中,37℃摇床培养过夜。
2、取1mL过夜培养物转接于100mLLB培养基中,在37℃摇床上剧烈振荡培养3小时。
3、将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷;以下步骤均在超净工作台和冰上操作。
4、吸取1.5mL培养好的菌液至2.0mL离心管中,在冰上冷却10分钟。
5、4℃下3000g冷冻离心5分钟。
6、弃去上清,加入500μL预冷的将0.1MCaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,在冰上放置10分钟。
7、4℃下3000g冷冻离心5分钟。
8、弃去上清,加入150uL预冷的0.1MCaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,在冰上放置10分钟。
9、加入50uL60%的甘油,缓缓滴入并轻轻摇晃,使其充分混合均匀,冰浴10分钟。
10、细胞悬浮液可立即用于转化实验或超低温冷冻贮存备用(-70℃).
(二)转化
1、从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞,放于冰上至融化,取3uL纯化的DNA加入装有感受态细胞的管中,轻轻吹打几次,冰浴放置30分钟。
2、将管放入42℃水浴45秒,不要摇动管。
3、快速将管转移至冰浴中,放置2分钟。
4、每管加入800uLLB液体培养基,置于恒温振荡器,37℃培养1小时。
5、取适量培养液(每个90mm直径培养皿约200uL)均匀涂布在含Amp+的培养基平板上。
6、将平板置于室温直至液体被吸收,倒置平皿,于37℃恒温培养箱中培养12-16小时,然后观察结果。
二、实验结果
本实验分为十组,每组做两个平板,其中一组为阴性对照。
我们组转化的结果较好,实验组数得单菌落为87个,阴性对照组没有长菌落。
转化效率=单菌落总数/质粒DNA加入量=87*(800/100)*1000/2*3=1.16*105个/ug
三、结果分析
本次实验中,有些组加质粒转化后在平板上没有长出单菌落,原因可能是在实验操作中存在失误,例如涂棒未冷却就直接涂抹菌液,使细菌被高温烫死,导致不能长出菌落。
还有一些组的平板上菌落长成一片,不能分辨单个菌落,分析原因可能是没有均匀的涂布菌液,致使菌落长成一片,或者就是转化的质粒DNA浓度过高。
而设立的阴性对照正常情况下是不应该有细菌长出的,若长出细菌克隆,则可能存在下列原因:
感受态细胞被有抗生素抗性的菌株污染;平板的抗性失效;平板被某种具有抗性的菌株污染了。
实验四聚合酶链式反应(PCR)
一.实验步骤
1.向无菌的200µL薄壁管依次加入以下溶液。
反应物
体积
无菌水
17μL
10×buffer(含Mg2+)
2.5μL
4×dNTP(2.5mM)
2.0μL
Taq酶(2.5U/μl)
0.5μL
正向引物(10pmol/μl)
1μL
反向引物(10pmol/μl)
1μL
模板DNA(10ng/μl)
1μL
总体积
25μL
2.反应体系混匀,离心5秒。
3.在PCR仪上按以下方式循环。
Step
Temperzture(℃)
Time
Numberofcycles
Note
起始变性
94
3min
1
变性
94
30s
30
退火温度比理论退火温度大概低5℃,再根据反应结果优化
退火
58
30s
延伸
72
3min10s
每分钟延伸1000bp
最终延伸
72
10
1
4.取5μL反应液,加1μl6×Loadingbuffer在0.7%-0.8%琼脂糖凝胶上电泳。
5.在凝胶成象系统上观察实验结果,并对照Marker检测PCR扩增产物产量及长度是否正确。
二、实验结果
本实验选用的模板大小为3kb左右,取5ul反应液在0.7%的琼脂糖凝胶上电泳后有十组跑出片段大小为3kb,符合实验结果,产量大约为200~400ng/ul,其他组则未显示明显的条带。
三、结果分析
琼脂糖凝胶电泳DNA条带弱或无的原因可能有以下情况:
Taq酶的活力有问题,体系中有酶的抑制剂,操作中漏加某种成分,目的片段长,退火温度过高,引物设计不合理等等。
但本次实验是在相同的环境下完成的,所用试剂、反应条件也都相同的,唯一不同的是实验的操作人员,所以导致某些组别没有跑出目的片段的原因应该是在实际操作中存在的问题。
实验五DNA重组及分析
一.实验步骤
(一)PCR产物纯化
1.向PCR反应液中加入3倍量的DBBuffer,均匀混合。
2.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。
3.将上述操作步骤1的溶液转移至SpinColumn中,12000rpm离心1分钟,弃滤液。
注意:
如将滤液再加入SpinColumn中离心一次,可以提高DNA回收率。
4.将500μl的RinseA加入SpinColumn中,12000rpm离心30s,弃滤液。
5.将700μl的RinseB加入SpinColumn中,12000rpm离心30s,弃滤液。
6.重复操作步骤5。
7.将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer,室温静置1分钟。
注:
把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
8.12000rpm离心1分钟洗脱DNA。
(二)连接
1.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。
2.在离心管中加入下列成分:
10×ligationBuffer
1μl
T载体(vector)
0.5μl
PCR产物(insertDNA)
2μl
T4ligase
1.5μl
水
5μl
总体积
10μl
3.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
4.将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间(16℃连接过夜)。
(三)转化
1.取200μl感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入5μl连接产物,轻轻吹打混匀,冰浴30min。
3.将菌液放入42℃水浴中热激45s,立即放入冰浴中2min。
4.向上述管中加入0.8mLLB,摇匀后于37℃恒温摇床上200rpm×1hr温育。
5.取200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面,平板于37℃倒置培养过夜。
(1)当转化的是TA克隆连接产物时可在200μl菌液中加入8μlIPTG和40μlX-gal混匀后涂板,以进行蓝白斑筛选。
(2)如果平板上的菌落较少,可将菌液4000rpm/min离心3分钟,留200μl上清液将菌体打散,均匀涂布于平板表面。
(3)平板可于37℃培养箱中预先放置数小时使其干燥。
(四)重组子的筛选和鉴定
1.用接种环挑取平板上的菌落接种于1mL含适当抗生素的LB培养基中,37℃摇床培养过夜。
2.次日取菌液0.1mL,放4℃保种。
3.剩余菌液用碱裂解法小量提取质粒DNA,进行琼脂糖电泳,加入载体质粒DNA作为阴性对照,根据质粒大小初步筛选重组子,重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。
4.选取适当的酶,对重组子进行酶切分析,酶切体积均为10μl体系。
酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。
5.可用PCR法进一步鉴定,取少量重质粒DNA为模板进行PCR,电泳检测PCR产物,应能得到目的条带。
6.酶切或PCR分析正确的重组子可进行序列测定,同时进行保种。
(五)重组子的保存
1.质粒DNA的保存:
经纯化的质粒DNA保存于-70℃。
2.菌种保存:
用接种环将正确重组子的菌液接种于含青霉素的LB琼脂平板表面,于37℃过夜培养,挑取单个菌落,接种至5mL含青霉素的LB培养液中,37℃过夜培养,取0.45mL细菌培养物,加入0.15mL60%甘油(高压灭菌),振荡培养物使甘油分布均匀,然后放-20℃或70℃保存。
在复苏时,用枪头刮取冻结的培养物表面,然后立即把黏附于枪头上的细菌划于含青霉素的LB琼脂平板表面,于37℃过夜培养。
附1:
酶切
酶切前确定待切样品的浓度,并选择克隆位点内切酶和配套Buffer。
在离心管中加入如下成分:
10×Buffer
2μl
待切样品
8μl
酶
0.5μl
加水补足20μl
混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
将离心管置于37℃中温育1-3hr,若待切样品为PCR产物,则可将反应时间适当延长。
用未酶切的质粒作为对照,琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
二、实验结果
本实验得到的重组DNA片段大小应为5.8kb左右,本试验跑出的都大于5.8kb。
结果不是很准确。
三、结果分析
导致试验结果不理想的原因很多,可能点样出错,两条带都为重组DNA片段的电泳结果。
还可能是因为连接体系中载体多而插入片段少,导致的连接效率偏低,最终使得重组DNA得率较低。
实验六真核细胞总RNA的制备与分析
一.操作步骤
(一)实验操作
1.分离约100mg肌肉组织放入1.5mL 离心管,立即置于液氮中。
2. 将约100mg冰冻组织放在研钵中,用研棒研磨。
3.将组织碎末移入匀浆器中,并加入1mL Trizol试剂进行匀浆。
4.将上述组织的Trizol裂解液转入离心管中,在室温15~30℃放置5分钟。
5.在上述离心管中,按照每1mL Trizol加0.2mL氯仿的量加入氯仿,盖上管盖子,在手中用力震荡15秒,在室温(15℃~30℃)放置2~3分钟后,12000g(2℃~8℃)离心15分钟。
6.取上层无色的水相置于新离心管中,按照每1mL Trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇,在室温下(15℃~30℃)放置10分钟,12000g(2℃~8℃)离心10分钟。
7. 弃上清,按照每1mL Trizol加1mL75%乙醇进行洗涤,涡旋混合,7500g(2℃~8℃)离心5分钟,弃上清。
8.让沉淀的RNA在室温下自然干燥;用RNase-freewater溶解RNA沉淀。
(二)RNA检测
(1)紫外分光光度计测定样品
RNA定量方法与DNA定量相似。
RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。
因此,可以用260nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40μg/mL的单链RNA。
如用1cm光径,用ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可算出样品稀释前的浓度:
RNA(μg/mL)=40×OD260读数×稀释倍数(n)
所获得的RNA其OD260/OD280的比值通常为1.8-2.0。
(2)进行(甲醛变性)琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性。
二、实验结果
本实验将提取的RNA进行电泳,均得到2条带,分别为18s和28s,但片段均偏小。
三、结果分析
RNA的OD260/280的比值通常为1.8~2.0,若比值偏高,则提示RNA有降解。
RNA的电泳图中跑出的片段偏小,就可能是因为RNA被部分降解了所导致。
而RNA被降解的原因有以下几点:
RNA存放一周后被部分降解,操作过程中被含RNA酶的手或移液器等降解,电泳槽中的缓冲液没有用DEPC处理过的水配制等。
试验七、反转录扩增cDNA(RT-PCR)
一、实验步骤
(一)反转录合成cDNA第一链
(1)在DEPC处理的200uL薄壁管中(冰浴)依次加入以下溶液:
TotalRNA2uL
Oligo(dt)18primer(0.5ug/uL)1uL
DEPC-treatedwater9uL
轻轻混匀,离心5秒
(2)70℃水浴5分钟,冰浴30秒,离心5秒。
(3)向上述管中(冰浴)依次加入一下溶液:
5×reactionbuffer4uL
RibolockRibonucieaseinhibitor(20u/uL)1uL
10mMDntp2uL
轻轻混匀,离心5秒
(4)37℃水浴5分钟,加入1uLM-MuLVReverseTranscriptase(200u/uL),混匀。
(5)42℃1小时。
(6)70℃10分钟结束反应,产物置冰上进行下一步PCR实验,余下的-70℃保存。
(二)PCR
(1)向无菌的200uL薄壁管中依次加入以下溶液:
反应物
体积(uL)
无菌水
16
10×buffer(含Mg2+)
2.5
4×dNTP(2.5mM)
2
Taq酶(5U/uL)
0.5
正向引物(10pmol/uL)
1
反向引物(10pmol/uL)
1
模板cDNA
2
总体积
25
最后加Taq酶
(2)反应体系混匀,离心。
(2)反应体系混匀,离心。
(3)在PCR仪上按以下方式循环
步骤
温度℃
时间
循环数
注意
起始变性
94
3min
1
变性
94
40秒
30
退火温度比理论退火温度大概低5℃,再根据反应结果优化
退火
58
40秒
延伸
72
30秒
每分钟延伸1000bp
最终延伸
72
10秒
1
(4)取5-10uL反应液,加1-2uL6×Loadingbuffer在0.7%-0.8%琼脂糖凝胶上电泳。
(5)在凝胶成像系统上观察实验结果,并对照Marker检测PCR扩增产物产量及长度是否正确。
二、实验结果
以DL2000为Marker,取10ulRT-PCR产物在3%的琼脂糖胶上进行电泳,均跑出250bp左右的特异性条带。
三、结果分析
RT-PCR未跑出条带的原因可能是:
上次实验测得的RNA的OD260/280偏大的组,由于RNA被降解,导致电泳后无条带出现。
此外,在向PCR管中加样时可能漏加了某种成分,使RT-PCR失败,最终也导致无条带的出现。
试验八蛋白质免疫印迹检测(WeastenBlot)
一、实验步骤
(一)蛋白样品制备(组织中总蛋白的提取)
(1)将10-100mg组织块置于液氮中碾碎,置于匀浆器,加入1mL裂解液,进行充分匀浆。
(2)取0.5mL组织匀浆液,转移至1.5mL离心管中,加入1mL抽提试剂充分混匀,4℃下静置10min,中途略摇动。
(3)在4℃下12000rpm离心10min,溶液分为上下两相,中间为蛋白膜层,吸去上清,用吸头拨开蛋白膜层,吸去下相溶液,蛋白膜层附着于离心管壁。
(4)敞开管口,室温干燥10min后,加300uL蛋白溶液缓冲液,95℃煮10min,室温放置30min溶解沉淀,用紫外分光光度计测定蛋白浓度,置于-70℃保存。
(二)SDS-PAGE电泳
灌胶与上样
(1)玻璃板对齐后放入夹中对称加紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。
(2)按前面方法配置12%分离胶,加入TEMED后立即摇匀灌胶。
灌胶时。
用枪吸取液体沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度即可。
然后在胶上加一层水,液封后的凝胶更快。
(3)当水和胶之间有一条折线时,说明胶凝了。
等待10min使胶充分凝固倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配置5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶后插入梳子。
灌胶时要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生,插梳子时使梳子保持水平。
待胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。
(6)测完蛋白含量后,取30uL蛋白溶液至0.5mL离心管中,加入30uL2×SDS上样缓冲液。
将样品于沸水中煮沸5min使蛋白变性,然后离心5秒混匀。
(7)向电泳槽中加入足够的电泳液后取24uL样品开始上样。
用移液枪贴壁吸取样品,将加样器头插入加样孔中缓慢加入样品。
(8)电泳时间2h,电压100V。
电泳至溴酚蓝刚跑出停止电泳,进行转膜。
(三)转膜
(1)将玻璃板撬掉剥胶。
除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去,然后量好胶的尺寸,小心剥下分离胶,放入转移buffer中。
(2)准备一张与胶大小相同的PVDF膜和六张略小于膜的滤纸。
且滤纸和膜的时候戴上手套。
转移前准备:
将PVDF膜按次序浸入100%甲醇10秒,去离子水中5min,然后将胶、滤纸、膜浸入转移buffer中平衡5min。
在加有转移液的转移槽里放入两块海绵垫,一支玻棒。
(3)将转移夹子打开,使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以赶走里面的气泡。
在垫子上放三层滤纸,一手固定滤纸,一手用玻棒赶去其中的气泡。
(4)小心将胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒赶去气泡。
将膜盖于胶上(做好标记),要盖满整个胶并除去气泡。
在膜上盖三张滤纸并出去气泡。
最后盖上另一个海绵垫,擀几下合起夹子。
(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室须空气流通。
)
(5)将夹子放入转移槽中,使夹子的黑面对槽的黑面,夹子的白面对槽的红面。
用80mA转移2小时。
(四)免疫反应
(1)将膜用TBS从下向上浸湿后,移至含有封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)的平皿中,室温下封闭1小时。
(2)取5uL一抗用5mLTBST稀释(在1.5mL离心管中);撕下适当大小的保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上;从封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡;4℃下孵育过夜,用TBST在室温下用手摇动平皿洗三次,每次5min。
(回收一抗-20℃下保存)
(3)同上方法准备二抗稀释液(1:
10000)并与膜接触,室温下孵育1h后,用TBST在室温下脱色摇洗3次,每次5min。
(回收二抗于-20℃下保存)
(五)显色反应
膜转入DAB显色液中,置暗处反应,待显色反应达到最佳程度时,立即用双蒸水洗涤终止反应。
膜用扫描仪扫描,保存反应结果。
二、实验结果
WeastenBlot显色结果:
三、结果分析
膜上没有出现条带的原因可能是:
1上样量太少,使得被检测抗原量太低;
2洗膜时没有将膜上的SDS洗干净,影响了后面抗体的结合;
3将膜放入抗体稀释液的时候,所有的膜都放在同一平皿中,影响了蛋白质与抗体的结合。
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