WB实验基本步骤.docx

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WB实验基本步骤

实验基本步骤

提取细胞蛋白

I

BCA定呈

I

制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）

I

蛋白样品变性

I

电泳

I

转膜

I

封闭

I

—抗

I

TBST洗涤

I

二抗

I

TBST洗涤

I

显影

贝脚内容9

结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾0.24g

磷酸氢二钠1-44g

氯化钠8g

氯化钾0.2g

加入500ml纯水，调PH=7.2

定容至1L.高压蒸汽灭菌

2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3•电转液500ml

Tris1・5g

甘氨酸7.2g

400ml水溶解

加入100ml甲醇，置于4°C冰箱预冷

4•电泳液（1X）

10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST（TBS+0.05%吐温・20）

50mlTBS+450ml纯水+o.25ml吐温・20

7•封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40C预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:

一管细胞，PBS（4°C预冷），PMSF（lOOmM）,移液枪（lOOOuL10ul）,1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4°C预冷

1.于-20°C冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液

2.加入lml4°C预冷的PBS（0.01MpH7.2〜7.3）。

用移液枪轻轻吹成悬浮液后4°C,8000r离心5min,然后弃去上淸。

重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。

3.按lml裂解液加10UIPMSF（lOOmM）,摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）

4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后，于4°Cb12000rpm离心5min。

7.将离心后的上淸分装转移倒0.5ml的离心管中放于一20°C保存。

二、蛋白含量的测定（BCA定量）

准备：

96孔板，移液枪（lOOOublOuh200ul）,BCA工作液（A+B）,50mlEP管,lxPBS,BSA标准液1•将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复.（外用一圈的孔最好不用）2•算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B）,（A液：

B液=50:

1,一般配多些，如60扎A液12000uL

B液240ul）3•将样品稀释到一定倍数才能定量,（10倍,20倍,30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul,—般配80ul4•配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0・5mg/ml,若配200ul的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ulPBS溶液5•将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0.1,2,4,8,12,16,2001加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul6•每孔加200ul配好的工作液，平行加，不能上下加，以减少误差7•将加好的96孔板放在379下孵育30分钟8•孵疗完后,放在酶标仪轻微震荡3・10s冲速,吸光值595nm,进行比色测屯记录标准曲线及样品吸光值数据后，以蛋白含量（ml）为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线。

（R2>0.98才有用，酶标仪操作:

两个箭头图标ZL是结果,2是保存）9•讣算蛋白含量（注意左量样品已经稀释了10倍）

蛋白质定量标准曲线加样量

序号

标准液浓度mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5

三、SDS-PAGE电泳

1.配胶（12%,可以提前配好）

准备：

玻璃板，梳子，AP（解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4°C冰箱冷藏）

（1）玻璃板验漏5min

（2）按表配置分离胶

（3）灌胶，加酒精封压，凝30min（注意不要有气泡）

（4）按表配浓缩胶，倒掉洒精，用吸水纸吸去洒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30min

（5）取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4°C冰箱保存备用

2.样品处理

准备：

PBS,移液枪，1.5mlEP管

（1）稀释样品：

一般每孔上样5ul,即lmg/ml浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PBS稀释至lmg/ml

（注意loadingbuffer的加入也得算入）

（2）取出上样样品15ul至1.5ml离心管中，加入6XSDS上样缓冲液3ul至终浓度为IX。

（上样总体积一般不超过15Pl,加样孔的最大限度可加20,样品。

）

（3）将样品在100°C煮5min震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）

3.电泳

准备：

电泳液500ml（现配），蛋白胶，20ul移液枪（枪头），样品，Marker,冰盒，电泳装置

（1）将SDS-PAGE胶放入电泳槽中，加足够的电泳液。

（短玻璃板而向内，长玻璃板面向外。

若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一而面向外。

电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。

注意先检漏。

）

（2）上样。

用移液枪贴壁吸取样品，将样品吸岀不要吸进气泡。

将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。

（加样太快可使样品冲出加样孔.若有气泡也可能使样品溢出。

加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

）

（3）先设置80V,开始电泳，样品澳酚蓝跑至分离胶后增至120V电压，电泳至渙酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

（此时准备好电转液）

四、

准备：

电转液（现配4C冰箱冷藏），很子，滤纸，PVDF膜（0.45um）,电转装置，冰盒

注意：

拿滤纸和膜时一过要戴手套或用银子，因为手上的蛋白会污染膜。

1.在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫

2.滤纸浸入电转液中，PVDF膜任甲醇中润湿成半透明，小心将膜放入4°C电转液中平衡至少5min。

3.将夹子打开使黑的一而保持水平。

在上而垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。

（一手擀另一手要压住垫子使苴不能随便移动。

）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

4.先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。

（撬时一左要小心，玻板很易裂。

）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。

小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。

将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。

在膜上盖3张滤纸并除去气泡。

最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。

整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。

膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。

（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。

）

5.将夹子放入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白而对槽的红而。

一般用100mA转移90min＜；

6.转完后将膜用IX丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。

然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。

将膜晾干备用。

（准备封闭液）

六、免疫反应

准备：

封闭液，一抗，二抗，TBST

1.将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。

2.TBST洗4次。

每次5分钟。

3.将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育2h或者4°C过夜

4.室温下孵冇1〜2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min

5.同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵ffl〜2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗4次，每

次5min

七、显影

准备：

样品胶片，移液枪（200ul）,中枪头，吸水纸，显影液（A+B）,薄银子

一抗

二抗

目的蛋白78kd

Bip1:

1000

兔二抗

目的蛋白34kd

GAPDH内参1:

5000

鼠二抗

28kd

目的蛋白17kd

Sepl51:

1000

兔二抗

2•将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;

2.1min后，取适量显影液于显影仪台面上，将膜用银子夹起来正反而充分和显影液接触，注意切角在左上,即正而朝上。

应注意的是：

显影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

3•盖上盖子，将胶片进行扫描或扌白照。