层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片_精品文档.ppt

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层析填料的选择层析填料的选择及装柱技术介绍及装柱技术介绍佳辰公司生物中心佳辰公司生物中心陈阶陈阶2012-04-18如何选择填料？

如何选择填料？

n一、依据所纯化的对象的各物理和化学特性。

（一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等）n二、纯化所要达到的目的（粗提？

中度纯化？

精细纯化？

）。

n三、所要选择的层析方法n1.凝胶过滤（Gf）n2.离子交换（IEX）n3.亲和层析（AC）n4.疏水层析（HIC）n5.反相层析（RPC）n四、填料自身的物理化学特性合理衔接不同层析技术IEXHIC粗粗样或样品含高盐样或样品含高盐GF脱盐GF脱盐GF脱盐ACIEXHIC或者需要稀释IEXGF或或RPCGF或或RPCGFGF样品澄清样品澄清粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化凝胶过滤如何选择填料？

凝胶过滤如何选择填料？

一、一、4种主要常用的凝胶类型种主要常用的凝胶类型n葡聚糖凝胶：

Sephadex（SephadexG中G值越小，交联度越大，吸水性越小）适合脱盐、buffer交换n琼脂糖凝胶Sepharose（宽广的分离范围）n聚丙烯酰胺凝胶sephacryl（Bio-Gelp）n琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶Superdex（高分辨率、高回收率，运行时间短）二凝胶过滤填料的选择原则二凝胶过滤填料的选择原则1凝胶的交联度越高，孔径越小。

2对大分子物质的分离，多采用琼脂糖。

3对小分子物质的分离，多采用葡聚糖。

4凝胶颗粒的粗细影响分离效果。

SephadexLH-20为例为例nSephadexLH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。

例如：

类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等。

nSephadexLH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。

nPharmadexLH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。

SephadexLH-20为例为例n对于SephadexLH-20而言，25100m的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。

然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。

这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。

在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。

SephadexLH-20在使用之前必须进行溶胀。

在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。

n1在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统。

n2使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。

n3将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。

（考虑到损耗，称量考虑到损耗，称量SephadexLH-20干胶干胶138g（柱体积（柱体积589.05ml），放入），放入2000ml的烧杯中，加入双蒸水的烧杯中，加入双蒸水1200ml并在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至并在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸近沸10分钟，随后取出，室温静置分钟，随后取出，室温静置3小时以上，直到温度降为室温。

小时以上，直到温度降为室温。

）溶溶剂剂溶胀系数（溶溶胀系数（溶胀体积胀体积ml/ml/干胶干胶gg）吸收能力（吸收吸收能力（吸收溶剂体积溶剂体积ml/ml/干胶干胶gg）水水4.04.04.44.42.12.1DDMMSSOO4.44.44.64.6-乙乙醇醇3.63.63.93.91.81.8离子交换层析如何选择填料？

离子交换层析如何选择填料？

n根据被分离物质分子表面电荷性质进行吸附解吸附。

离子交换层析如何选择填料？

离子交换层析如何选择填料？

离子交换层析如何选择填料？

离子交换层析如何选择填料？

n利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。

析方法。

n分类：

分类：

特异性配体亲和层析：

特异性配体亲和层析：

配体一般为复杂的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。

其特点是吸附特异性强，结合力大等）。

其特点是吸附特异性强，结合力大通用性配体亲和层析：

通用性配体亲和层析：

配体一般为简单的配体一般为简单的小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。

其小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。

其成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及前者前者亲和层析亲和层析亲和层析如何选择填料？

（亲和吸附介质：

基质+配体）一、基质的选择一、基质的选择理想的基质应符合下面的要求：

理想的基质应符合下面的要求：

11极低的非特异性吸附。

极低的非特异性吸附。

22高度的亲水性。

高度的亲水性。

33较好的理化稳定性。

较好的理化稳定性。

44大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。

大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。

55适当的多孔性。

适当的多孔性。

一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。

葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。

常用亲和吸附剂采用的基质常用亲和吸附剂采用的基质一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠等。

交联琼脂糖以及多孔玻璃珠等。

商品纤维素：

商品纤维素：

具有非特异吸附性，且本身结构不均一具有非特异吸附性，且本身结构不均一聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：

聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：

与配体结合后，多孔性会大与配体结合后，多孔性会大大降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与大降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与配体之间引入间隔物配体之间引入间隔物玻璃珠：

玻璃珠：

具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质也有一定的吸附力也有一定的吸附力目前使用最广泛的是目前使用最广泛的是Sepharose4B，它是有，它是有D-半乳糖半乳糖和和3，6-脱水脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化，并易于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，化，并易于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量较大容易吸附大分子物质，且吸附容量较大二、配体的选择二、配体的选择理想的配体应具有以下一些性质：

理想的配体应具有以下一些性质：

1）配体与待分离的物质有配体与待分离的物质有适当的适当的亲和力。

亲和力。

2）2）配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性。

配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性。

3）3）配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落。

易脱落。

4）4）配体自身应具有较好的稳定性配体自身应具有较好的稳定性。

根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：

两类：

特异性配体（特异性配体（specificligandspecificligand）和和通用性配体通用性配体（generalligandgeneralligand）亲和层析如何选择填料？

（亲和吸附介质：

基质+配体）亲和吸附介质的配基n

（1）酶的抑制剂）酶的抑制剂n（22）抗体）抗体n（33）AA蛋白蛋白AA蛋白（蛋白（proteinAproteinA）为分子量约）为分子量约42KD42KD的蛋白质，存的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（在于黄色葡萄球菌（StaphylococcusaureusStaphylococcusaureus）的细胞壁中，占该）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约细胞壁构成成分约55。

AA蛋白在确定其为蛋白质之前称蛋白在确定其为蛋白质之前称AA抗原。

抗原。

n（44）凝集素）凝集素凝集素凝集素（lectin）（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。

结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。

n（55）辅酶和磷酸酰苷）辅酶和磷酸酰苷n（66）过渡金属离子）过渡金属离子n（7）组氨酸）组氨酸n（88）肝素）肝素（heparinheparin）能用于亲和层析的分子上的基团能用于亲和层析的分子上的基团亲和介质反应基团亲和介质反应基团偶联方偶联方法法物理方法物理方法包埋法包埋法和和吸附法吸附法等等化学方化学方法法偶联法偶联法：

利用：

利用CNBr、环氧氯丙烷、双环、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜、亚胺二烯酸等化学试氧乙烯、丁二烯砜、亚胺二烯酸等化学试剂使配体与活化的基质偶联或形成螯合物剂使配体与活化的基质偶联或形成螯合物交联法交联法：

即用戊二醛、碳二亚胺等双功能试：

即用戊二醛、碳二亚胺等双功能试剂交联基质与配体剂交联基质与配体CNBr是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶联、去除未结合配体、配体结合量的测定等步骤联、去除未结合配体、配体结合量的测定等步骤基体配体吸附剂的制备基体配体吸附剂的制备以以CNBr活化的琼脂糖凝胶活化的琼脂糖凝胶4B为例为例nCNBr活化活化Sepharose4B产生的氰酸酯可和蛋白质类配体一氨基共产生的氰酸酯可和蛋白质类配体一氨基共价偶联作用。

价偶联作用。

n5.0g溴化氰活化的琼脂糖凝胶溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B粉末溶于粉末溶于100毫升的毫升的1mMHCl-静置静置15-20分钟，使之膨胀分钟，使之膨胀-以水流抽气方式经以水流抽气方式经WhatmanNO.5滤纸去除滤纸去除HCl-再以再以1mMHCl清洗清洗-以总量为以总量为100ml的偶联缓冲液（的偶联缓冲液（0.1M碳酸氢钠碳酸氢钠+0.5M氯化钠，氯化钠，PH8.3）分数次清洗）分数次清洗-将吸干的溴化氰活化的琼脂糖凝胶自滤纸上刮下，加入将吸干的溴化氰活化的琼脂糖凝胶自滤纸上刮下，加入含含CA-OVA120毫克的偶联缓冲液毫克的偶联缓冲液20毫升毫升-以试管反复颠倒的以试管反复颠倒的混匀方式于室温下反应混匀方式于室温下反应2小时。

小时。

-以以900rpm离心离心5分钟，以分钟，以去除偶联缓冲液（收集，测未偶联的去除偶联缓冲液（收集，测未偶联的CA-OVA的量）的量）-加加入入20毫升封闭缓冲液（毫升封闭缓冲液（0.2M甘氨酸，甘氨酸，PH8.0）-以试管反以试管反复颠倒的混匀方式于室温下反应复颠倒的混匀方式于室温下反应2小时小时-再以偶联缓冲液清洗再以偶联缓冲液清洗一次一次-以以100毫升含毫升含0.5NNaCl的的0.1M醋酸缓冲液清洗醋酸缓冲液清洗-最后以偶联缓冲液清洗五次，即可装填管柱。

最后以偶联缓冲液清洗五次，即可装填管柱。

疏水层析如何选择填料？

疏水层析如何选择填料？

n疏水层析和反相层析（reversedphasechromatography）分离生命物质的依据是一致的，即:

视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力疏水力疏水力疏水力差异性大小，将有效成分分离出来疏水层析填料类型疏水层析填料类型1亲水性填料n基质主要是：

交联琼脂糖（SepharoseCL-4B）n配体是：

苯基或辛基化合物基质与配体通过耦合方法构成稳定的苯基（或辛基）-SepharoseCl-4B吸附剂2非亲水性填料n基质有：

硅胶、树脂（苯