拟南芥总RNA的提取及RTPCR扩增CBF1基因文档资料.docx
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拟南芥总RNA勺提取及RPPCR扩增CBF1基因
拟南芥(Arabidopsisthaliana):
十字花科,两年生草本,高7厘米〜40厘米,广泛用于植物遗传学、发育生物学等研究,已成为一种典型勺模式植物。
其原因主要基于该植物具有以下特点:
植株个体小(1平方厘米可种植好几棵)、生长周期快(从发芽到开花不超过6周)、种子多(每株每代可产生数千粒种子)
生命力强(用普通培养基就可作人工培养),其基因组是目前已知植物基因组中最小勺;同时,拟南芥属于自花授粉植物,基因高度纯合,用理化因素处理突变率很高,容易获得各种代谢功能缺陷型勺植株。
因此,其被科学家誉为“植物中勺果蝇”。
1.CBF基因功能及特性
CBF转录激活因子是一类受低温特异诱导的反式作用因子,
它们能与CRT/DRE(C-repeat/dehydration-responsiveelement)DNA调控元件特异结合,促进启动子中含有这一调控
元件的多个冷诱导和脱水诱导基因的表达,从而激活植物体内的多种耐逆机制。
拟南芥CBF1转录激活因子能调控一组抗干旱、抗低温基因勺表达,更有效地提高植物抗干旱、抗低温勺能力。
对冷驯化过程中基因表达差异的认识,使抗冻基因(COR的克
隆及其功能的分析成为研究冷驯化过程的主要目标,在拟南芥和其他抗冻植物中分离出许多COF基因,这些基因对植物抗冻有非
常重要的作用。
在拟南芥CORM控的研究中发现CBF转录因子的
冷敏植物如番茄和玉米中发现了CBF类似基因,拟南芥CBF1基
因在转基因番茄和小麦中的过量表达提高了植株的抗寒和抗旱性。
这一研究结果展示了拟南芥CBF1类似基因的应用可能为冷
敏植物抗寒和抗旱性的品种改良提供一条新的途径。
2.材料与方法
2.1材料
2.1.1菌株、植物材料和载体
拟南芥Columbia(At)、E.coliJM109为本实验室保存,
PMD18-TVector购于TaKaRa公司。
2.1.2主要试剂
树脂型TMPCR^物纯化试剂盒购于赛百盛公司。
Trizol试剂为Invotrigen公司产品,2XPfuPCRMasterMix
购于北京天为时代生物技术公司,DEPC为Sigma公司产品,MLV
反转录酶、T4-DNA连接酶为BioLab公司产品,其他常规试剂都购于各生物技术公司。
2.1.3缓冲液配制
焦炭酸二乙酯(DEPC处理水:
向蒸馏水中加入DEPC至终
浓度为0.1%,搅拌至少12h,然后121C灭菌30min。
溶液I:
1MTris-HCl(pH8.0)12.5ml,0.5MEDTA(pH8.0)
10ml,葡萄糖4.730g,力nddH2O至500ml;高压灭菌15分钟,储存于4C冰箱。
溶液n:
0.1mol/LNaOH,1%SDS
溶液m:
5mol/LKAc60ml,冰醋酸11.5ml,H2O28.5ml,
定容至100ml,过滤灭菌,保存在4C。
2.2试验方法
2.2.1拟南芥总RNA勺提取
用Trizol一步法提取拟南芥叶片的总RNA为防止RNA的
降解,提取RNA所用的器具均用0.1%DEPC室温下浸泡12h以上,然后121C高温处理。
2.2.1.1取适量拟南芥叶片(经液氮速冻后保存于超低温冰箱)置于研钵内,加液氮,研磨成粉末;
2.2.1.2取加有1mlTrizol试剂的1.5ml离心管,将50m「100mg研磨好的样品加入离心管,混匀,室温放置5分钟后,4C,12000rpm/min离心5分钟;
2.2.1.3将上清液转入新离心管中,加200ul氯仿,振荡混匀后,室温放置15分钟,4C,12000g离心15分钟;
2.2.1.4小心吸取上层水至另一离心管中,加0.5ml异丙醇,混匀,室温放置5分钟〜10分钟。
4C,12000g离心10分钟,
弃上清,RNA沉于管底;
2.2.1.5力n1ml75%乙醇,温和振荡离心管。
4C,8000g离
心5分钟,尽量弃上清;
2.2.1.6室温晾干或真空干燥5分钟〜10分钟,用50Ul无
RNA酶水溶解RNA羊品,通过琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收法确定
总RNA的纯度、浓度和完整性,立刻进行下一步的实验或-80C
冰箱保存。
2.2.2反转录
轻轻混合,短暂离心,25C保温5min,42C保温60min,95C
处理5min,终止该反应,离心10s〜20s,将其放置在37C下,加入1LRNAase,轻轻混匀,37C反应30min,反应结束后,
将样品短暂离心,立刻进行下一步的实验或-20C冰箱保存。
2.2.3引物的设计
根据GenBank数据库查找拟南芥中的一个DREB类转录因子
基因CBF1利用该cDNA基因序列设计引物CBF1up和CBF1down
从拟南芥cDNA中扩增CBF1类转录因子基因。
CBF1up:
5'-ATGAACTCATTTTCAGCTTTTTCTG-3'
CBF1dow:
n5'-TTAGTAACTCCAAAGCGACACG-3'2.2.4PCR片段的扩增
PCF反应体系20L:
2XPfuPCRMasterMix10卩l,dNTP
(10mmol/L)1l,cDNA模板1l,CBF1up(10mol/L)和CBF1down(10卩mol/L)各1卩I,ddH2O补至20L。
扩增程
序:
94C预变性2min;94C30s,57C30s,72C1.5min,30
个循环;然后72C延伸10min,扩增产物进行电泳检测(1%琼脂糖,80V,20分钟)。
2.2.5DNA片段的回收
使用树脂型TMPCF产物纯化试剂盒(赛百盛公司)回收
PCR产物,具体操作过程参照使用说明书进行。
得到目的片段后,取4卩I电泳(0.8%琼脂糖,120V,10分钟)检测并定量测定。
226PCR片段与T载体的连接
配制A反应混合物(使用前临时配制):
回收PCR片段33UI,
10XPCRBuffer4卩I,dNTP(10mmoI/L)2卩I,Tag酶1I,总体积为40UI;把加A反应混合物72C孵育10min,加120卩I
无水乙醇和4卩I乙酸钠,混匀后-20C沉淀20min,13000rpm离
心15min。
再用70%^醇洗,13000rpm离心5min。
沉淀真空干燥
10min后用4.5卩L无菌水溶解,用于与pMD18-T载体连接。
按照TaKaRa的pMD18-TVector说明配制连接反应混合物:
DNA片段4.5UI,PMD18-T载体0.5卩I,SolutionI5卩I,总
体积为10UI。
把连接反应混合物在16C保温12-16小时。
然后
加1UI乙酸钠(1/10体积)和33UL无水乙醇(3倍体积),-20C沉淀20min,13000rpm离心15min。
再用70%乙醇洗,13000rpm离心5min。
沉淀真空干燥10min后用5卩L无菌水溶解。
2.2.7转化
把Eppendorf管和电转化杯预冷备用,于冰上冻融-70C保
存的感受态细胞,取2.5UL重组载体加入到40UL的感受态细
胞中混匀,冰浴1min;将细胞和DNA昆合液转到电转化杯中,并将液体敲至杯底。
把小杯放入电转仪的小盒中,电击;取出小杯,迅速加入1mLLB培养基,重悬细胞。
把细胞转至灭菌的离
心管中,37C轻柔振荡1小时,取电击转化培养液500卩L,往
离心管中加入40UIX-gal(20mg/ml)和4卩IIPTG(200mg/ml),
混匀后,涂平板,37C倒置培养过夜。
2.2.8鉴定转化子
从平板上挑取半个白斑菌落,进行PCF鉴定,PCR反应体系
为:
10XPCRBuffer2卩L,dNTP(10mmoI/L)1卩L,CBFlup(10
Umol/L)和CBF1down(10卩mol/L)各1卩l,Taq酶1卩l,再
挑入半个白斑菌落,用ddH2O补齐到20UL。
扩增程序:
94C预变性2min;94C30s,55C30s,72C30s,32个循环;然后72C延伸10min,扩增产物进行电泳检测(1%
琼脂糖,80V,20分钟)。
2.2.9质粒DNA的大量提取
2.2.9.1取一管-70C保存的大肠杆菌(含已转化目的片段
的质粒),接种50mLLB培养基(含100卩g/mLAmp,37C260r
振荡过夜。
使沉淀充分悬浮。
2.2.9.5加入6mL新鲜配制的溶液II,轻轻颠倒混匀,冰上
放置3min。
229.6加入4.5mL溶液III,轻轻颠倒混匀,冰上放置5min。
2.2.9.713000r,4C离心10min,移出上清,用擦镜纸过滤。
2.2.9.8上清中加入0.6-1倍体积的异丙醇,冰上放置
10min,13000r,4C离心10min。
2.2.9.9弃上清,70%乙醇小心漂洗沉淀,稍离心后倾去乙
醇,将沉淀于真空干燥器中干燥。
229.10在干燥后的离心管中,每管加入500mLTE用枪
把沉淀打散,移入Eppendorf管中,加入10卩LRNase,37C保
温15min。
离心3min。
加入500UL
2.2.9.14
氯仿,颠倒混匀,14000r离心15min。
取上清,加入等体积13.3%PEG800Q冰上放置15min,14000r离心15min。
2.2.9.15弃上清,沉淀用500UL70%乙醇小心漂洗(尽量
不使沉淀漂起来),离心3min。
弃去乙醇,沉淀于真空干燥器
中干燥。
2.2.9.16用50卩L无菌水或TE液溶解沉淀,-20C保存备
用,或酶切电泳检测。
2.2.10双酶切鉴定
重组质粒经EcoRI和PstI双酶切处理。
酶切体系为:
酶
切缓冲液2.5UI,PCR产物或载体3.0UI,EcoRI(10U/卩I)
1.0Ul,PstI(10U/ul)1.0ul,无菌水17.5ul,总体积
为25UI。
37C孵育仆,琼脂糖凝胶电泳,观察结果。
结果与分析
3.1RT-PCR扩增CBF1基因
以总RNA为模板,通过MLV反转录酶合成cDNA的一链,再以此为模板,采用CBF1up和CBF1dowr为引物,扩增激活蛋白
cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳后,得到一条约1Kb大小的片断,
结果如图1。
3.2扩增片段与T载体连接
把片断回收,加A后与PMD18-T载体连接后,重组质粒命名为PT-CBF1,并转化大肠杆菌JM109后,挑取白色菌落,提取质
粒,根据T载体上的多克隆位点序列,选用EcoRI和PstI进
行酶切,琼脂糖电泳,电泳结果如图2:
3.3序列分析
分析序列并利用软件DNAMA翻译相应蛋白质,得到该基因
AC、GT数量分别是162、138、186、156,GC为50.47%。
1。
对翻译所得的蛋白序列进行分析,蛋白长度为213个氨基酸,分子量为23811.4,各氨基酸组成的分析见上表
4.总结与讨论
本文根据Tran等报道的拟南芥中CBF1基因序列设计引物,扩增基因,并连接到克隆载体上,下一步进行原核表达,利用表
达产物制备多克隆抗体,用以确定高羊茅、狗牙根、结缕草和马
蹄金等抗旱性强的植物中是否含有DREB类转录因子,然后从所
筛选的植物中获得新的DREB类转录因子基因,并对该基因进行
序列分析、功能预测及其表达研究,同时构建DRE或基因的植
物表达载体,为进一步利用DRE或转录因子基因进行其他草坪
草的遗传转化,为培育抗旱草坪草品种奠定基础。
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