基因工程实验讲义.docx
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基因工程实验讲义
项目名称大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达
第一部分实验目的
1.了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶(限制性内切酶、连接酶、Taq酶)的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术;
2.理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想,PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素;
3.掌握质粒DNA的提取与定性定量分析、琼脂糖凝胶电泳、PCR基因扩增及扩增产物回收、核酸的限制性酶切与连接、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化、目的重组子筛选与鉴定等各项基本实验技术方法的基本原理与操作技能。
第二部分实验背景
据统计,全世界的盐碱地约占陆地面积的三分之一,我国有大约1亿亩盐碱化耕地。
随着人口的不断增加和现代工业的发展,人均耕地面积日趋减少。
因此,如何开发利用广阔的盐碱地来发展农业生产、提高粮食等作物的产量已经成为政府和科学家必须直面的迫切问题。
盐胁迫是盐碱地抑制植物生长、降低农作物产量的最重要环境因素之一。
长期以来,如何提高植物的耐盐性、增加盐胁迫下农作物的产量一直受到政府和科学家的关注。
深入研究植物对盐胁迫的反应机制和耐盐机理是改造植物、提高其耐盐性的前提。
其中,通过转耐盐基因提高植物耐盐性是一条日益受重视的途径。
研究表明,有些植物在受到盐胁迫时,为消除由盐胁迫所造成的不平衡,会在体内合成和积累一定浓度的小分子量、无毒性的渗透保护剂(如甜菜碱、脯氨酸、海藻糖、山梨醇及甘露醇等),来提高细胞内渗透压,降低Na对酶活性的抑制,增加酶的热稳定性,阻止酶复合物的解离。
这些渗透保护剂还可以清除活性氧,从而有助于植物耐冷害、冻害、高温及干旱等胁迫,广泛存在于细菌、藻类和动植物中。
这类物质对于细胞耐高渗环境起着重要作用。
其中甘露醇和山梨醇属糖醇类物质,其生物合成的关键酶为甘露醇-1-磷酸脱氢酶(MTLD)和山梨醇-6-磷酸脱氢酶(GUTD)。
将负责这些小分子渗透调节物合成的关键酶基因引入植物后,能够起到一定的耐盐作用。
因此,可以通过基因工程的方法使这类植物超量表达甜菜碱、脯氨酸和甘露醇等渗透保护剂,从而提高其耐盐胁迫能力。
本实验项目根据大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphatedehydrogenase,MTLD)基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从大肠杆菌E.coliJM109菌株的基因组中扩增获得甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因序列,该基因序列开放阅读区全长1146bp,编码由382个氨基酸组成、分子量约为41kDa。
扩增产物经定向克隆连接到原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a(+)/MTLD,并转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞,以期获得能大量表达生产甘露醇-1-磷酸脱氢酶的重组体克隆。
本实验项目从大肠杆菌菌株中克隆MTLD基因,将其构建到原核表达载体上后实现高效表达,从而为通过基因工程方法培育耐盐作物奠定基础。
第三部分实验总体流程
大肠杆菌基因组DNA提取
PCR扩增甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因
PCR产物纯化
PCR
双酶切
酶切产物提纯
pET-28a质粒(表达载体)提取
双酶切
酶切产物提纯
连接得到重组质粒
E.coliDH5α感受态细胞的制备
转化
重组子的鉴定
E.coliBL21感受态细胞的制备
提取重组质粒
转化
mtlD/pET-28a/BL21表达菌株
甘露醇-1-磷酸脱氢酶的诱导表达
表达产物SDS-PAGE鉴定
重组蛋白的分离纯化
第四部分实验内容
实验一大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳鉴定
1.实验原理
基因组DNA的提取通常用于PCR模板、Southern杂交、构建基因组文库(包括RFLP)等。
不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA提取方法有所不同;同种生物的不同各种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。
无论何种生物基因组DNA,其提取方法基本可分为两步:
先是温和裂解细胞及溶解DNA,接着采用化学或酶学的方法,去除蛋白、RNA及其它大分子,再用乙醇沉淀出DNA。
常用的经典提取方法有CTAB法和SDS法。
提取基因组DNA总的原则包括:
(1)保证核酸一级结构的完整性;
(2)其它生物大分子,如蛋白质、多糖、酚类、脂类分子的污染应尽量降到最低;
(3)核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;
(4)其它核酸分子,如RNA,也应尽量去除。
本实验中细菌基因组的提取采用天根生化科技有限公司的DP302细菌基因组提取试剂盒。
该试剂盒可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌的基因组DNA。
离心吸附柱中采用的硅基质材料能够高效、专一吸附DNA,可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。
提取的基因组DNA片段大、纯度高,质量稳定可靠。
基因组DNA的提取用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,电泳分离后的DNA用溴化乙啶染色,在254nm波长紫外光检测DNA的提取情况。
2.实验用品
(1)材料
本实验所用的大肠杆菌为E.coliJM109菌株,以甘油菌形式-20℃冰箱保存。
(2)试剂
1)天根生化科技有限公司的DP302细菌基因组提取试剂盒。
包括缓冲液GA、缓冲液GD、缓冲液GB、漂洗液PW、洗脱缓冲液TE、蛋白酶K、吸附柱CB3、收集管。
2)10×TBE电泳缓冲液:
称取Tris54g,硼酸27.5g,并加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,定容至1000mL。
3)6×上样缓冲液:
0.25%溴酚蓝,40%(w/v)蔗糖水溶液。
4)EB溶液母液:
将EB配制成10mg/mL,用铝箔或黑纸包裹。
5)DL2,000TMDNAMarker(TaKaRa公司):
本Marker为已含有1×LoadingBuffer的DNA溶液,可取5μL直接电泳。
(3)仪器
超净工作台、恒温振荡仪、高压灭菌锅、pH计、高速离心机、移液枪、水平电泳仪、电泳仪电源、凝胶成像系统、电炉。
3.实验步骤
(1)大肠杆菌活化和培养
取4微升大肠杆菌E.coliJM109甘油菌接入4mLLB液体培养基中,37℃培养过夜进行活化。
将活化好的菌按照1:
100接入锥形瓶中,37℃培养4小时使之进入对数生长期。
(2)基因组DNA的提取
1)取细菌培养液1-5mL,10000rpm离心1分钟,尽量吸净上清。
2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA,振荡至菌体彻底悬浮。
3)向管中加入20μL蛋白酶K溶液,混匀。
4)加入220μL缓冲液GB,振荡15秒,70℃放置10分钟,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
注意:
加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀,一般70℃放置时会消失,不会影响后续实验。
如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。
5)加220μL无水乙醇,充分振荡混匀15秒,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD,12000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW,12000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
9)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW,12000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
10)将吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm离心2分钟,倒掉废液。
将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意:
这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验。
11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE,室温放置2-5分钟,12000rpm离心2分钟,将溶液收集到离心管中。
注意:
为增加基因组DNA的得率,可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中,室温放置2分钟,12000rpm离心2分钟。
洗脱缓冲液体积不应少于50μL,体积过小影响回收效率。
(3)DNA的琼脂糖凝胶电泳
用1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA的提取情况。
样品贮存在-20℃冰箱中备用。
具体步骤如下:
1)琼脂糖凝胶液的制备:
称取1g琼脂糖,置于三角瓶中,加入100mL1×TBE电泳缓冲液,瓶口倒扣一个小烧杯或包一层保险膜,于电炉加热。
琼脂全部融化后取出摇匀,即为1%琼脂。
(也可加溴化乙啶2.5μL)
2)凝胶板的制备:
置水平板于工作台面上,将样品槽模板(梳子)插进水平板上凹槽内,距一端约0.5cm。
梳子底边与水平板表面保持0.5-1mm的间隙。
待琼脂糖冷至65℃左右,小心地倒入托盘内,使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。
液内不存有气泡。
室温下静置0.5-l小时,待凝固完全后,用小滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶,双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板(注意勿使样品槽破裂),则在胶板上形成相互隔开的样品槽。
3)加样:
将DNA样品液与溴酚蓝-甘油溶液以5:
1的体积比混合,用移液枪分别加人到凝胶板的加样槽内。
每个糟加10μL左右。
加样量不宜太多,避免样品过多溢出,污染邻近样品。
加样时注射器针头穿过缓仲液小心插人加样槽底部,但不要损坏凝胶槽,然后缓慢地将样品推进槽内让其集中沉于槽底部。
DNAMarker取5μL直接进行加样。
4)电泳:
加样完毕,靠近样品槽一端连接负极,另一端连接正极,接通电源,开始电泳。
控制电压降不高于5V/cm(电压值V/电泳板两极之间距离比)。
当染料条带移动到距离凝胶前沿约lcm时,停止电泳。
5)染色:
将电泳后的胶取出,小心椎至0.5μL/mL溴乙锭染色液中,室温下浸泡染色30min。
6)观察:
小心地取出凝胶置托盘上,并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液,再将胶板推至凝胶成像系统的样品板上,在紫外灯下进行观察。
DNA存在的位置呈现橘红色荧光,肉眼可观察到清晰的条带,拍照记录下电泳图谱。
4.注意事项
1)菌体培养过程要严格无菌,染菌后提取得到的基因组会成多条带。
2)基因组提取过程中所使用的器材要严格灭菌,防止核酸酶降解基因组。
3)溴乙锭是DNA诱变剂,配制和使用EB染色液时,应戴乳胶手套,并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。
凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品,必须经专门处理后,才能进行清洗或弃去。
4)加样量的多少决定于加样槽最大容积。
加人样品的体积应略少于加样槽容积。
对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。
5.实验结果
分析所提DNA的电泳图结果。
6.思考题
1.琼脂糖凝胶电泳时,应注意哪些问题?
2.如果提取的DNA中含有蛋白质和RNA污染,应如何解决?
3.如果提取的DNA产量较低,分析原因并提出解决办法。
实验二PCR法扩增大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因
及PCR产物的纯化
1.实验原理
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),简称PCR,1983年由Dr.KaryB.Mullis发明,是一种选择性的体外扩增DNA或RNA的分子生物学技术。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性(denature):
模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(anneal):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸(extension):
DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
重复循环:
变性-退火-延伸这三个过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
图1PCR反应示意图
本实验以提取的大肠杆菌E.coliJM109基因组DNA作为反应模板,利用合成的引物对编码甘露醇-1-磷酸脱氢酶的DNA序列进行PCR反应扩增,以获得甘露醇-1-磷酸脱氢酶目的基因。
扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,并用DNA纯化试剂盒进行纯化回收。
2.实验用品
(1)材料
实验一所制备的大肠杆菌E.coliJM109基因组DNA溶液
(2)试剂
1)天根生化科技有限公司的PCR反应试剂盒,含ddH2O、2×PCR反应混合液(包括dNTP、Tag酶、PCR缓冲液等);
2)上游引物、下游引物(设计后由公司合成);
3)石蜡油;
4)琼脂糖;
5)10×TBE电泳缓冲液:
称取Tris54g,硼酸27.5g,并加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,定容至1000mL;
6)6×上样缓冲液:
0.25%溴酚蓝,40%(w/v)蔗糖水溶液;
7)EB溶液母液:
将EB配制成10mg/mL,用铝箔或黑纸包裹;
8)生工生物工程(上海)有限公司的BS363-N柱式PCR产物纯化试剂盒。
包括吸附缓冲液(BindingBuffer)、漂洗液(WashingBuffer)、洗脱液(ElutionBuffer)。
(3)仪器
超净工作台、高压灭菌锅、高速离心机、移液枪、PCR扩增仪、水平电泳仪、电泳仪电源、凝胶成像系统、电炉。
3.实验步骤
(1)引物设计
在ncbi(http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查询Escherichiacolimannitol-1-phosphatedehydrogenase(MTLD)的基因序列,作为模板设计引物。
检索得到,该蛋白质由382个氨基酸组成,具体序列如下:
1mkalhfgagnigrgfigklladagiqltfadvnqvvldalnarhsyqvhvvgeteqvdtv
61sgvdavssigddvvdliaqvdlvttavgpvvleriapaiakglvkrkeqgnesplniiac
121enmvrgttqlkghvmnalpedakawveehvgfvdsavdrivppsasatndplevtvetfs
181ewivdktqfkgalpnipgmeltdnlmafverklftlntghaitaylgklaghqtirdail
241dekiravvkgameesgavlikrygfdadkhaayiqkilgrfenpylkddvervgrqplrk
301lsagdrlikpllgtleyslphknliqgiagamhfrseddpqaqelaaliadkgpqaalaq
361isdldansevvseavtaykamq
其全基因序列如下,长度为1149个bp:
1atgaaagcattacattttggcgcaggtaatatcggtcgtggctttatcggtaaactgctg
61gcagacgcgggtatccaactgacgtttgccgatgtcaatcaggtggtacttgatgccctg
121aatgcccgtcatagctatcaggttcatgtggtcggtgaaaccgagcaggtagataccgtt
181tccggcgtcgatgctgtcagcagcattggtgatgatgtcgttgatctgattgctcaggtc
241gatttagtcactaccgccgttggcccggttgtgctggaacgtattgctccggctatcgcc
301aaagggctggtgaaacgtaaagaacaaggtaatgaatccccgctgaacatcatcgcctgt
361gaaaacatggtacgcggtaccacgcagctgaaaggtcatgtgatgaacgccctaccagaa
421gacgccaaagcgtgggtagaagaacacgttggctttgtcgattccgccgttgaccgcatc
481gtaccgccttcggcttcggcaactaacgatccgctggaagtgacggtagaaactttcagc
541gaatggattgtcgataaaacgcagttcaaaggcgcactgccgaacatcccaggcatggag
601ttaaccgacaacctgatggcatttgtcgaacgtaaactcttcaccctgaacacgggtcat
661gctataaccgcgtacctcggaaaactggccggtcatcagaccattcgtgacgctattctc
721gacgagaaaatccgcgcggtggtaaaaggtgcgatggaagaaagtggtgcggtactgatc
781aagcgctacggctttgacgcagacaaacatgcggcgtacatccagaaaatcctcggtcgt
841tttgagaacccgtatctgaaagatgatgtagagcgcgtaggccgtcagccgctgcgtaaa
901ctgagtgctggcgaccgtctgatcaagccattgctcggtacgctggaatacagccttccg
961cacaagaatctgattcaggggattgctggtgcaatgcacttccgcagtgaagacgatccg
1021caggctcaggaactggcagcactgatcgctgacaaaggtccgcaggcggcgctggcacag
1081atttccgatcttgatgccaacagcgaggttgtatccgaggcggtaaccgcttataaagca
1141atgcaataa//
根据以上DNA序列和所采用的表达质粒载体pET-28a-c(+)的图谱(图1),用PrimerPremier5.0软件设计了两对引物。
在上游引物和下游引物上分别设置BamHI和SacI的酶切位点,这两个不同的限制性内切酶识别位点分别在引物中以下划线的方式标记出来。
引物序列如下:
上游引物5‘-GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTCGCG-3‘(BamHI)
下游引物5‘-TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAAGCG-3‘(SacI)
图2质粒pET28a-c(+)图谱及其多克隆位点序列
(2)基因扩增
以提取的基因组DNA作为反应模板,利用合成的引物对编码MTLD的DNA序列进行PCR反应扩增。
在PCR管中分别依次加入以下试剂:
试剂
体积/µL
ddH2O
19
2×PCR反应混合液
25
上游引物
2
下游引物
2
模板E.coliJM109全基因组
2
总体积
50
手指轻弹管壁混匀后,加20µL石蜡油覆盖于混合物上,防止PCR过程样品中水分的蒸发。
反应参数:
94℃5min
35个循环
94℃1min
55℃1min
72℃2min
72℃10min
当所有的反应都完成以后,设置PCR仪的温度保持在4℃。
反应完毕后各取5µL用1%琼脂糖凝胶电泳检测,基因长度约为1150bp。
DNAMarker取5μL直接进行加样。
电泳完毕,在紫外灯下观察结果并拍照。
(3)PCR产物的纯化
采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化,具体步骤如下:
1)取剩余酶PCR产物至1.5ml离心管中。
2)加5倍体积的Bindingbuffer。
3)把混合液吸至装有吸附柱的2mL离心管中,室温下静置2分钟。
4)8000rpm离心1分钟,弃2mL离心管中离心液。
5)在吸附柱中加500µLWashingbuffer,10000×g(rcf)离心1分钟,弃离心液
6)再加500µLWashingbuffer,10000×g(rcf)离心1分钟,弃离心液。
7)10000×g(rcf)再离心1分钟,以甩去多余的液体。
8)在柱中间薄膜中滴加50µLElutionbuffer,50℃保温5分钟。
9)把吸附柱转移至新的1.5mL离心管中,10000×g(rcf)离心1分钟,弃吸附柱,1.5mL离心管中离心液即为纯化后的PCR产物。
4.注意事项
1.PCR反应的灵敏度很高,为了防止污染,使用的0.2mL的Eppendorf管和吸头都必须是新的、无污染的,实验操作需戴上一次性手套,操作应尽可能在无菌操作台上进行。
2.使用工具酶和DNA样品的操作必须在冰浴条件下进行,使用后有剩余的应立即放回冰箱中。
3.应设含除模板DNA所有其他成分的阴性对照。
4.引物的使用浓度一般为0.1-1.0µmol/L,浓度过高易形成引物二聚体或增加非特异性产物;过低则影响效率。
5.PCR产物要经电泳鉴定,得到分子大小一致的目的条带后再进行PCR产物的纯化和回收,在用凝胶电泳检查时,样品可存放于4℃。
5、思考题
1.简述PCR扩增技术的原理与各试剂的作用(Mg2+、dNTP、引物、DNA、缓冲液)。
2.PCR产物电泳时如果出现非特异性杂带,可能有哪些原因?
3.PCR过程中预变性3min,最后保温10min的目的分别是什么?
实验三碱裂解法提取表达质粒载体pET-28a及电泳鉴定
1.实验原理
可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞,并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子叫载体(vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:
(1)分子量小、多拷贝、松驰控制型;
(2)具有多种常用的限制性内切酶的单一位点;(3)能插入较大的外源DNA片段;(4)具有容易操作的检测表型。
常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间,如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
为表达蛋白质设计的载体称为表达载体(expressionvector)。
pET系统是有史以来在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白功能最
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