氟苯尼考验证测定报告.docx
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氟苯尼考验证测定报告
扬州制药有限公司第1页
氟苯尼考残留测定
及方法学验证报告
扬州制药有限公司
二00九年七月
扬州制药有限公司第2页
实施人:
审核人:
批准人:
扬州制药有限公司第3页
1.验证概述
2.验证目的
3.验证范围
4.验证项目及可接受标准
5.实施验证的人员
6.所用的仪器及设备
7.验证内容
8.验证结论
扬州制药有限公司第4页
1.验证概述
根据美国FDA对残留溶媒测定方法验证的要求,我们对氟苯尼考残留溶媒测定方法验做了专属性,定量限,检测限,线性,加样回收率,耐用性试验,对氟苯尼考(批号:
FK201006001)的残留溶剂分别进行了同人同柱,不同人同柱和同人不同柱的测定,同时我们改变检测条件,进行了系统适用性的评价。
由于氟苯尼考热稳定性较差,我们采用顶空方法分析验证,所测溶媒二氯甲烷,与水不能互溶,我们溶剂选择采用30%二甲亚砜(DMSO)作为稀释溶剂(简称溶剂A)
2.验证目的:
为了完善氟苯尼考的残留溶媒测定方法的验证。
3.验证范围:
适合氟苯尼考的残留溶媒的测定。
4.验证项目及可接受标准
验证项目
可接受标准
专属性(分离度R、理论塔板数n)
甲醇,乙醇,异丙醇,二氯甲烷R≥2.0N≥10000
定量限最低检测限测定
信噪比≥10
甲醇定量限浓度≤5.0ug/ml
乙醇定量限浓度≤3.0ug/ml
异丙醇定量限浓度≤3.0ug/ml
二氯甲烷定量限浓度≤1.0ug/m
信噪比≥3
甲醇检测限浓度≤1.5ug/ml
乙醇检测限浓度≤1.0ug/ml.
异丙醇检测限浓度≤1.0ug/ml
二氯甲烷检测限浓度≤0.3ug/ml
线性
r≥0.9995
加样回收率(%)
90.0~110.0
精密度(相对标准偏差RSD)
RSD≤10%
耐用性试验1.(同人同柱,不同人同柱,同人不同柱)
3次含量测定结果RSD≤10%
耐用性试验2.改变仪器检测条件
甲醇,乙醇,异丙醇,二氯甲烷R≥2.0N≥10000
扬州制药有限公司第5页
5.实施验证的人员:
乔志毅,林森
6.所用的仪器及设备
仪器
自编号
校验日期
有效期
安捷伦-6890N
CA051003
2010.03.02
2011.03.03
7.验证内容
7.1.测定仪器及检测条件
仪器:
安捷伦-6890N气相色色谱仪,7694E顶空进样器,N2000工作站
测定条件
柱:
毛细管柱DB-624S/N:
USA10901036H
规格:
30M×0.53mm×3.0µm
载气:
N2流速4.0ml/min,
柱温:
初温50℃保持8min,以30℃/min升到160℃,保持时间2min。
进样器温度:
200℃分流比:
10:
1进样体积1ml
7694E顶空进样器顶空瓶加热温度80℃,进样环120℃,传输管线140℃,顶空瓶加热时间20min,进样时间1.0min,瓶压14psi.顶空瓶10ml
检测器FID
温度:
250℃氢气:
40ml/min空气:
400ml/min尾吹:
20ml/min
Rang0ATTEN0
稀释溶剂A30%DMSO
7.2.专属性验证
精密吸取甲醇127µl(相当于100mg),乙醇127µl(相当于100mg),异丙醇127µl(相当于100mg),二氯甲烷75µl(相当于100mg),分别置4个事先装有
少量溶剂A的100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配置成4个相应的溶液,分别吸取各溶液5ml到4个50ml的容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配置成含
各溶剂浓度均为100µg/ml的4种溶液A(甲醇),B(乙醇),C(异丙醇),D(二氯甲烷)。
扬州制药有限公司第6页
精密称取氟苯尼考(批号:
FK201006001)100mg至10ml顶空瓶中,6份备用。
1份分别加入2ml溶剂A作为空白溶液测定,1份加入2mlA溶液(甲醇),1份加入2mlB溶液(乙醇),1份加入2mlC溶液(异丙醇),1份加入2mlD溶液(二氯甲烷),1份各加入0.5ml溶液(A.B.C.D),取6个溶液及溶剂A溶液在信噪比≥3条件下顶空进样分析,出样顺序:
甲醇A(RT=2.473),乙醇B(RT=3.148),异丙醇C(RT=3.757),二氯甲烷D(RT=4.182),结果:
甲醇.乙醇之间分离度9.091,乙醇,异丙醇之间分离度5.794,异丙醇二氯甲烷之间分离度3.400,二氯甲烷.DMSO之间分离度5.5.甲醇N=37656,乙醇N=29089,异丙醇N=20468,二氯甲烷N=24055,符合可接受标准。
7.3定量限和检测限的测定
7.3.1精密吸取2ml溶剂A到10ml顶空瓶中,作为空白溶液测定。
另取专属性项下的A溶液(甲醇)5ml到100ml容量瓶中用溶剂A稀释到刻度,配成5ug/ml的溶液,在信噪比≥10条件下顶空进样分析,再吸取5ug/ml的溶液1ml加1ml溶剂A到10ml顶空瓶中,在信噪比≥10条件下顶空进样分析。
再吸取A溶液(乙醇)1.5ml到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度配成1.5ug/ml的溶液进样,结果:
在信噪比≥10条件下顶空进样分析,测得定量限浓度为1.5ug/ml。
符合可接受标准。
吸取A溶液(甲醇)0.5ml到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成0.5ug/ml的溶液进样。
结果:
在信噪比≥3条件下顶空进样分析,测得最低检测浓度为0.1ug/ml。
符合可接受标准。
7.3.2精密吸取专属性项下的B溶液(乙醇)3.0ml到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成3.0ug/ml的溶液,在信噪比≥10条件下顶空进样分析,再吸取3.0ug/ml的溶液1ml到10ml容量瓶中稀用溶剂A释到刻度,配成0.3ug/ml的溶液进样,结果:
在信噪比≥10条件下顶空进样分析,测得定量限浓度为0.3ug/ml。
符合可接受标准。
吸取B溶液(乙醇)100ul到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成0.1ug/ml的溶液进样。
结果:
在信噪比≥3条件下顶空进样分析,测得最低检测浓度为0.5ug/ml。
符合可接受标准。
扬州制药有限公司第7页
7.3.3精密吸取专属性项下的C溶液(异丙醇)3.0ml到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成3.0ug/ml的溶液,在信噪比≥10条件下顶空进样分析,再吸取专属性项下的C溶液(异丙醇)1.0ml到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成1.0ug/ml的溶液,在结果:
信噪比≥10条件下顶空进样分析,测得定量限浓度为1.0ug/ml。
符合可接受标准
再吸取专属性项下的C溶液(异丙醇)0.3ml到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成0.3ug/ml的溶液,结果:
在信噪比≥3条件下顶空进样分析,测得检测限浓度为0.3ug/ml。
符合可接受标准
7.3.3精密吸取专属性项下的D溶液(二氯甲烷)1.0ml到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成1.0ug/ml的溶液,在信噪比≥10条件下顶空进样分析,再吸取专属性项下的D溶液(二氯甲烷)200ul到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成0.2ug/ml的溶液,再吸取专属性项下的D溶液(二氯甲烷)100ul到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成0.1ug/ml的溶液,结果:
在信噪比≥10条件下顶空进样分析,测得定量限浓度为0.10ug/ml。
符合可接受标准
再吸取专属性项下的C溶液(异丙醇)30ul到100ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成0.03ug/ml的溶液,结果:
在信噪比≥3条件下顶空进样分析,测得检测限浓度为0.03ug/ml。
符合可接受标准
表一:
甲醇、乙醇,异丙醇,二氯甲烷,定量限,低检测浓度
溶剂
定量限浓度ug/ml
检测限浓度ug/ml
甲醇
1.5
0.5
乙醇
0.3
0.1
异丙醇
1.0
0.3
二氯甲烷
0.1
0.03
7.4.线性关系测定
7.4.1.标准溶液配置
精密吸取甲醇380µl(相当于300mg),乙醇380µl(相当于300mg),异丙醇
380µl(相当于300mg),二氯甲烷45ul(相当于60mg)同一个事先装有溶剂A的200ml容量瓶中,用溶剂A稀释至刻度,配成含甲醇1500µg/ml,乙醇1500µg/ml,异丙醇1500ug/ml,二氯甲烷300ug/ml,的标准贮备液,分别精密吸
扬州制药有限公司第8页
取标准储备液:
1ml,2ml,5ml,10ml,15ml,20ml到6个100ml的容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成1#~6#的6个标准溶液。
取上述六个标准溶液分别进样,线性关系见表二,三,四,五。
表二:
甲醇的线性关系
浓度(µg/ml)
峰面积
回归方程
相关系数
15
15530
Y=1086x-1338
0.99995
30
31107
75
79099
150
160989
225
245219
300
323166
表三:
乙醇的线性关系
浓度(µg/ml)
峰面积
回归方程
相关系数
15
29513
Y=2114x-2521
0.9999
30
59037
75
156241
150
314018
225
479320
300
627577
表四:
异丙醇的线性关系
浓度(µg/ml)
峰面积
回归方程
相关系数
15
50740
Y=3649x-5106
0.9999
30
97162
75
271705
150
543436
225
825853
300
1081440
表五:
二氯甲烷的线性关系
浓度(µg/ml)
峰面积
回归方程
相关系数
3.0
25426
Y=11769x-15569
0.9999
6.0
52636
15
158019
30
335422
45
514085
60
692260
扬州制药有限公司第9页
结果:
甲醇,乙醇,异丙醇在浓度15µg/ml~300µg/ml之间,二氯甲烷在浓度3.0µg/ml~60µg/ml之间,关系良好,相关系数均大于0.9995,符合可接受标准。
7.5.氟苯尼考加样回收率实验
精密称取供试品(FK201006001)4份,每份500mg,分别置4个10ml容量瓶中,其中一份精密加入溶剂A溶解并稀释到刻度,作为空白检测溶液。
其余的每份分别加入线性项下的2#,4#,6#标准溶液溶解。
空白样进样2次,空白检测溶液中测出乙醇A=25941,,未测出甲醇,异丙醇,二氯甲烷,再将其余3份样品分别测定(n=3),并用各自相对应的线性方程计算回收率。
结果:
回收率均在90.0~110.0之间,平均回收率RSD≤5.0%符合可接受标准,结果见表六.七.八.九.。
表六:
甲醇加样回收率
次数
加入浓度(µg/ml)
峰面积
测定浓度(µg/ml)
回收率%
平均回收率%
RSD%
1
30
33758
32.32
107.7
103.9
2.8
2
30
33562
32.14
107.1
3
30
33355
31.95
106.5
4
150
163924
152.17
101.4
5
150
163353
151.65
101.1
6
150
171585
159.23
106.2
7
300
333941
308.73
102.9
8
300
326569
301.94
100.6
9
300
329380
304.53
101.5
表七:
乙醇加样回收率
次数
加入浓度(
峰面积
测定浓度(
回收率%
平均回收率%
RSD%
µg/ml)
µg/ml)
1
30
87134-25941
30.14
100.5
99.3
3.3
2
30
86164-29541
29.68
98.9
3
30
86037-25941
29.62
98.7
4
150
346562-25941
152.86
101.9
5
150
344191-25941
151.73
101.2
6
150
365162-25941
161.66
107.8
7
300
677118-25941
309.22
103.1
8
300
662432-25941
301.1
100.4
9
300
663884-25941
302.96
101.0
扬州制药有限公司第10页
表八:
异丙醇加样回收率
次数
加入浓度(µg/ml)
峰面积
测定浓度(µg/ml)
回收率%
平均回收率%
RSD%
1
30
107120
30.76
102.5
102.3
2.0
2
30
106222
30.51
101.7
3
30
105371
30.28
100.9
4
150
557035
154.05
102.7
5
150
552901
152.92
101.9
6
150
581291
160.7
107.1
7
300
1119129
308.09
102.7
8
300
1095339
301.57
100.5
9
300
1094112
301.24
100.4
表九:
二氯甲烷加样回收率
次数
加入浓度(µg/ml)
峰面积
测定浓度(µg/ml)
回收率%
平均回收率%
RSD%
1
6.0
53207
5.84
97.4
95.4
2.8
2
6.0
53643
5.88
98.0
3
6.0
52061
5.75
95.8
4
30
320135
28.52
95.1
5
30
309454
27.62
92.1
6
30
335765
30.00
100.0
7
60
653738
56.87
94.8
8
60
633896
55.18
92.0
9
60
643810
56.03
93.4
7.6.氟苯尼考精密度测定
精密称取供试品(批号FK201006001)6份,每份500mg,置10ml容量瓶中用溶剂A溶解并稀释到刻度,标准溶液配置,精密吸取标准储备液10ml到100ml容量瓶的,用溶剂A稀释到刻度,配成含甲醇,乙醇,异丙醇各150ug/ml,二氯甲烷30ug/ml,标准溶液,标准溶液进6次,甲醇A=175819RSD=2.2%,乙醇A=344429,RSD=2.1%,异丙醇A=593935RSD=2.1%,二氯甲烷A=350829RSD=2.4%,标准溶液峰面积误差≤10%,供试品进2次,按外标法计算供试品中残留溶剂含量(ppm)。
6次测定结果见下表十,
精密度相对标准偏差RSD≤10.0%,符合可接受标准。
扬州制药有限公司第11页
表十:
氟苯尼考精密度(乙醇)
供试品浓度
(g/ml)
标准峰面积
乙醇平均
RSD
(%)
样品峰
面积A均
含量
(ppm)
平均
(ppm)
RSD
(%)
0.050122
344429
2.1
29450
256
259
0.82
0.050005
29712
259
0.050030
29679
258
0.050010
29987
261
0.049982
29668
259
0.050221
30236
262
7.7.耐用性试验1
根据验证要求,我们对氟苯尼考(FK201006001)分别采取了3种方法测定其残留溶媒。
1.同人同柱试验(柱:
DB-624,S/NUSA109036H)测试人:
乔志毅结果取精密度项下6次测定结果。
2不同人同柱试验(柱:
DB-624,S/NUSA109036H),测试人:
林森。
3.同人不同柱试验(柱:
DB-624,S/NUS4652334H),测试人:
乔志毅。
7.7.1同人同柱试验
同人同柱试验:
取精密度项下6次测定结果乙醇256PPM
7.7.2不同人同柱试验
该试验测试人为林森,其余测定条件均未发生变化。
标准溶液配制:
精密吸取甲醇,乙醇,异丙醇,各380ul(相当于300mg)二氯甲烷45ul
在200ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,再精密吸取该溶液5ml
到50ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成含甲醇150ug/ml,乙醇150ug/ml,异丙醇150ug/ml,二氯甲烷30ug/ml的标准溶液。
精密称取氟苯尼考(FK201006001)6份,重量分别为502.06mg,501.08mg,501.21mg,501.46mg,502.19mg,500.62mg,分别置于6个10ml容量瓶中,用溶剂A溶解并稀释到刻度。
标准溶液进6次,甲醇A=166368RSD=1.6%,乙醇A=325600,RSD=1.8%,异丙醇A=561834,RSD=1.9%,二氯甲烷A=265807,RSD=2.6%,标准溶液峰面积误差≤10%,供试品进2次,按外标法计算供试品中残留溶剂含量(ppm)。
扬州制药有限公司第12页
6次测定结果见下表十一,
表十一不同人同柱试验样品的残留测定
测定
标准乙醇峰面积
样品浓度g/ml
样品乙醇峰面积
乙醇含量
ppm
乙醇平均含量ppm
RSD%
1
325600
0.050206
27521
252
258
1.5
2
0.050108
27861
257
3
0.050121
27881
256
4
0.050146
28024
257
5
0.050219
28640
263
6
0.050062
28339
261
7.7.3.同人不同柱试验
该试验中将毛细管色谱柱换为柱:
DB-624,S/NUS4652334H,其余测定条件不变,测试人乔志毅。
标准溶液配制:
精密吸取甲醇,乙醇,异丙醇,各380ul(相当于300mg)二氯甲烷45ul在200ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,再精密吸取该溶液5ml到50ml容量瓶中,用溶剂A稀释到刻度,配成含甲醇150ug/ml,乙醇150ug/ml,异丙醇150ug/ml,二氯甲烷30ug/ml的标准溶液。
精密称取氟苯尼考(FK201006001)6份,重量分别为500.22mg,501.05mg,500.06mg,500.88mg,498.32mg,500.44mg,分别置于6个10ml容量瓶中,用水稀释到刻度。
标准溶液进6次,甲醇A=182074RSD=3.0%,乙醇A=347393RSD=3.1%,异丙醇A=607723RSD=3.2%,二氯甲烷A=370225RSD=7.5%,标准溶液峰面积误差≤10%,供试品进2次,按外标法计算供试品中残留溶剂含量(ppm)。
6次测定结果见下表十二,
扬州制药有限公司第13页
表十二同人不同柱试验样品的残留测定
测定
标准乙醇峰面积
样品浓度g/ml
样品乙醇峰面积
乙醇含量
ppm
乙醇平均含量ppm
RSD%
1
347393
0.050022
31520
272
264
4.8
2
0.050105
30816
266
3
0.050006
29324
256
4
0.050088
31938
275
5
0.049832
31440
272
6
0.050044
28084
242
从上述结果可以看出,不管是在同人不同柱,和不同人同柱条件下测定的结果均基本一致,样品中仅含有乙醇,结果如下表十三。
表十三样品的残留测定的结果比较
测试人
乔志毅
林森
乔志毅不同柱
乙醇含量ppm
259
258
264
乙醇平均(ppm)
260
RSD%
1.2
7.7.4.耐用性试验2
为了使我们的实验结果更加可靠,我们针对实验中可能出现的问题,对实验条件做了如下改动,并做了系统评价。
从系统适用性评价来看,无论在下述条件下,我们测定的各个溶剂的理论塔板数和峰与峰之间的分离度都均符合验证要求。
说明我们的测定条件耐用性较好。
测试溶液为甲醇150ug/ml,乙醇150ug/ml,异丙醇150ug/ml,二氯甲烷30ug/ml
溶液,结果见表十四,十五。
表十四耐用性试验结果(理论塔板数N)
改变条件N
甲醇n
乙醇n
异丙醇n
二氯甲烷n
原条件(流速4.0ml/min.柱温50℃.进样口200℃
37655
25081
18341
25271
柱温45℃
33878
24085
16880
22890
柱温55℃
38056
26960
20022
24781
流速3.6ml/min
40973
26605
19300
26356
流速4.4ml/min
35143
22456
17072
18953
进样口180℃
流速3.8ml/min
柱温52℃
35409
25751
19665
25678
扬州制药有限公司第14页
表十五耐用性试验结果(分离度R)
分离度R
甲醇于乙醇R
乙醇于异丙醇R
异丙醇与二氯甲烷R
二氯甲烷与DMSOR
原条件(流速4.0ml/min.柱温50℃.进样口200℃
8.6960
5.373
3.355
82.459
柱温45℃
9.412
5.789
3.182
62.949
柱温55℃
7.976
5.085
3.382
50.638
流速3.6ml/min
9.082
5.556
3.415
73.731
流速4.4ml/min
8.295
5.234
3.151
30.353
进样口180℃
流速3.8ml/min
柱温52℃
8.298
5.379
3.400
79.921
7.5.氟苯尼考残留测定
供试品配制:
取供试品(批号:
FK201006001,FK201006002,FK201006003),3批样每个批号精密称取500mg到10ml容量瓶中,用溶剂A溶解并稀释到刻度,分别吸取上述3个溶液各2ml到10ml顶空瓶中加盖密封(每个
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