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RNA的剪接机理
摘要
酶母tRNA的剪接自身剪接反应能够编码蛋白质的内含子细胞
核中的剪接连接点套索的产生snRNAs的作用核内不均一RNA酶母tRNA的剪接RNA的剪接就是要把断裂基因的转录本中的内含子除去。
酵母细胞核中400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。
不同氨基酸的tRNA基因中的内含子不相同,因此,剪接酶类看来并不能识别任何共同顺序......
一、酶母tRNA的剪接
RNA的剪接就是要把断裂基因的转录本中的内含子除去。
酵母细胞核中400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。
这些基因均只有一个内含子,位于与反密码子的3'侧相隔一个核苷酸之处,长度为14至46bp。
不同氨基酸的tRNA基因中的内含子不相同,因此,剪接酶类看来并不能识别任何共同顺序。
所有内含子中均有一段与tRNA的反密码子互补的序列,因而使反密码臂的构象发生了改变,即反密码子被配对而使反密码臂伸长了很多。
在前体中仅反密码臂受到影响,tRNA分子的其他部分仍保持其正常结构。
酵母tRNAphe中的内含子能与其反密码子碱基配对,从而改变了反密码臂的结构。
此剪切过程可分为两个阶段。
第一步是磷酸二酯键的断裂,这不需要ATP。
这一步由一种内切核酸酶所催化。
第二步是连接反应,需要ATP的存在,由RNA连接酶所催化。
在无ATP时,产生的两个tRNA半分子不能连接起来。
这两个半分子具有独特的末端:
其5'端有OH基,而3'有一个2',3'-环磷酸基。
当加入ATP时,即发生第二步反应:
两个tRNA半分子先发生碱基配对,形成成熟tRNA分子的构象,然后由RNA连接酶形成磷酸二酯键而将两个半分子共价连接起来。
2',3'-环磷酸基的存在并不限于酵母,在植物和哺乳动物的tRNA剪接反应中也有环状基团的产生。
在人的HeLa细胞中,RNA连接酶能将带有2',3'-环磷酸基的RNA和另一带有5'-OH基的RNA直接连接起来。
酵母tRNA前体也可以在爪蟾的卵母细胞核提取液中正确地被剪接。
这表示剪接反应没有种属特异性。
爪蟾具有能识别酵母tRNA的内含子的酶类。
二、自身剪接反应
以前一直认为只有蛋白质有酶活性。
这个概念在生物化学界已根深蒂固。
然而近期发现RNA也可有酶活性。
这种有酶活性的RNA有人称之为ribozyme。
一种四膜虫Tetrahumenathermophila的两个主要rRNAs的基因和其他真核生物相类似(见前文),被转录在同一个初级转录本中。
此转录本称为35S前体RNA,较小的rRNA的序列在5'侧,较大的rRNA(26S)序列则在3'侧。
在编码26SrRNA序列存在一个单一的,短的(约400bp)内含子。
如将这个35S前体RNA在体外温育,可以发生自动剪接作用:
内含子从前体中被切出,先呈线性RNA片段,后来又环化为环状RNA。
这个反应仅需要加入一种一价阳离子,一种二价阳离子,和一种鸟嘌呤核苷酸(G)。
其他碱基均不能代替G.但并不一定需要GTP;GDP;GMP和鸟苷都可以应用。
这表示此反应并不需要能量供应。
此外,此鸟嘌呤核苷酸必须有一个游离的3'-OH基。
这个G要连接到内含子的5'端上(通过通常的磷酸二酯键)。
当线性的内含子成为环状时,其3'端可连接在距离5'端15个核苷酸之处,从而将原来5'端和15个碱基的节段(包括G在内)排除出去。
这种反应基本上是一种磷酸酯转移反应。
外显子A的3'-OH基可直接和外显子B的5'端相连接。
亦即一个磷酸酯可以直接被转移到另一个上去,不需要经过中间步骤(如水解作用之类),因此磷酸酯键的能量被保存着。
这解释了为什么此反应不需要水解ATP或GTP来供应能量。
同时,两次磷酸酯转移反应似乎是紧密相连的,因为始终没有找到过游离的外显子(A或B)。
而线性内含子的环化则可以被看作是第三个磷酸酯转移反应。
在体外系统中进行剪接时,并不需要蛋白质的存在。
RNA有能力自行剪接,故称为自身催化作用(autocatalysis)。
T.Cech和S.Altman各自独立地发现RNA具有催化作用。
从而改变了生物催化剂的传统概念。
为此他们共同获得了1989年Nobel化学奖。
1978年Altman从纯化的RNA酶P中分离出一种多肽和一种RNA(M1RNA)。
最初的实验结果表明,蛋白质和M1RNA单独都没有酶活性,但二者混合在一起又可恢复活性。
其它生物材料的实验结果表明M1RNA是RNA酶P活性所必须的。
1983年Altoman证明,在较高浓度的Mg2+存在下,单独的M1RNA就可以催化tRNA前体的成熟,而单独的蛋白质则没有这种能力。
这样,RNA即可看作是个酶。
事实上,M1RNA的酶活性并不比RNA酶P的粗制品的活性低。
原来认为蛋白质赋予酶的活性,RNA只起某种辅助作用(例如帮助蛋白质与其底物结合),但现在发现这两种功能已经倒转。
Cech给
具有催化活性的RNA定名为ribozyme。
很长时间以来,人们就试图自己设计和生产酶分子,但因蛋白质分子结构上的复杂性,迄今为止,尚无成功的例子。
近年来随着ribozyme的发现,人工酶(新概念下的酶,它的构件分子是核苷酸)的设计又产生了新的希望。
澳大利亚的科学家就设计了九个ribozyme分子,它们都具备内切酶的活性,且切割位点有高度特异性。
同时,ribozyme的活性随pH、温度、及阳离子浓度的变化而变化,显示出典型的酶特性。
由于ribozyme的作用位点高度特异,故可以用来切割特定的基因转录产物(RNA)。
有人将这种切割作用叫做抗基因活性。
因为切割的结果破坏了RNA,也就是抑制了基因的表达。
这种特性为我们进行基因和病毒的治疗提供了一个可行的途径。
某些线粒体中的内含子也是自身剪接的内含子。
一些常见的真菌,如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa),酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的线粒体内含子都能进行自身剪接,像四膜虫中进行的磷酸酯转移反应一样。
三、能够编码蛋白质的内含子
某些真菌线粒体中的内含子有很不寻常的结构,这些内含子有编码顺序,这些顺序的翻译对于该顺序所在的内含子的剪接是必须的。
编码细胞色素b的box基因在仅剪去内含子1时,会产生RNA成熟酶的mRNA。
当内含子2亦被剪去时,才是细胞色素b的编码顺序的开端。
线粒体中的box基因是编码细胞色素b(cytb)的。
box基因中的外显子1有417bp,编码cytb的N端139个密码子。
内含子1有765bp,不编码。
外显子2非常短,仅有5个密码子。
其后是一个很长的内含子2。
内含子2的特点是其开头840bp是一个开放读框(ORF),有280个密码子,其最后一个密码子为终止密码子。
当将内含子1剪去后,翻译即从外显子1起始,通读过外显子2而进入内含子2的ORF,产生一个有423个氨基酸残基的蛋白质(其中144个是cytb的N端氨基酸,279个则由内含子2编码,称为RNA成熟酶(maturase)。
RNA成熟酶是特异地用来剪去内含子2的。
这样,这个酶促反应便成为一个非常敏感的负反馈径路。
去除内含子2后,外显子1和2即与外显子3相连接,因而破坏了编码成熟酶的顺序。
细胞核中的剪接连接点
剪接连接点(splicingjunctions)是指在切断和重接位点处的两旁的顺序。
在内含子左侧的连接点称为供体(donor),在内含子右侧的称为受体(acceptor)。
在细胞核的结构基因(即编码多肽的基因)中的所有内含子在外显子-内含子连接处均有GT...AG的共同顺序。
较详细的共同顺序如下,供体位点受体位点:
外显子...AG↓GTAAGT...内含子...Py10CAG↓...外显子
箭头表示切断的键。
这些还是较短的共同顺序,存在于几乎所有的真核生物中。
从上述共同顺序可见供体和受体位点之间并无互补现象,所以不可能想像这两个位点会通过碱基配对而结合一起,以便于内含子的切除。
正确的剪接并依赖于天然前体RNA分子的完整性。
一个外源基因如果存在于病毒顺序中,仍能很好地被剪接。
另外,前体RNA亦能在不同的组织,或甚至不同物种的细胞中被正确地剪接。
这都表示剪接作用是很保守的。
一个真正基因中一个外显子可以和另一个基因的外显子连接起来。
例如,将SV40(猴病毒40)的早期转录单位的第一外显子和小鼠β珠蛋白的第三外显子相连,这样形成的杂交内含子仍能正确地被剪接。
即SV40的内含子的供体位点(1I)可以剪接到小鼠β珠蛋白的内含子的受体位点(r2)上。
四、套索的产生
HeLa细胞的核提取液能够剪接纯化的RNA前体,这表示剪接作用并不与转录作用相关连。
RNA的修饰也和剪接无关,例如珠蛋白RNAs即使缺少poly(A)尾链,也没有加帽,仍能正常地被剪接。
剪接过程可分为两个阶段,与上文所述自身剪接不需能量不同,核内剪接需要用ATP。
在第一阶段中,内含子左端(供体位点)处被切断,形成两个分离的RNA分子,即左外显子和右内含子-外显子。
左外显子此时为-线性分子,但右内含子-外显子则不然:
内含子左端(5'端)以5'-2'键与在内含子右端上游约30碱基处的CTGAC序列(共同序列)中的A相连接,于是形成一个"套索"(lariat)"。
在第二阶段,在受体位点处被切断而将此套索状的内含子剪去;同时分离的右外显子即与左外显子相连接。
套索然后被"脱支(debranch)"而形成一线性内含子。
在这种剪接机构中,有三个很短的共同顺序,即供体和受体位点处于一个和套索分支处的一个序列。
用酵母做的实验证明:
分支处的共同顺序如果发生突变或缺失将使剪接不能进行。
这个共同顺序常称为TACTAAC盒。
它和左侧的供体位点共同顺序互补,但研究证明两者并不发生碱基配对。
在高等真核生物中此分支靶顺序的保守性较小。
五、snRNAs的作用
真核细胞有细胞核和细胞浆中都含有许多小RNA,它们约有100到300个碱基,每个细胞中可含有105-106个这种RNA分子。
它们是由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ所合成的,其中某些像mRNA一样可被加帽。
在细胞核中的小RNA称为snRNA,而在细胞浆中的称为scRNA。
但在天然状态下它们均与蛋白质相结合,故分别称为snRNP和scRNP。
某些snRNPs和剪接作用有密切关系。
有些snRNPs分别和供体及受体剪接位点以及分支顺序相互补。
snRNAs中最受注意的一个是U1,它普遍存在于哺乳动物、鸟类和昆虫细胞中。
人U1snRNP中除RNA外还8个蛋白质分子。
人U1snRNA的可能二级结构如图。
其5'端的11个核苷酸是单链的,并有一段和内含子左侧的供体序列互补。
在供体位点处的互补序列通常为4-6bp。
在体外,完整的U1snRNP粒子能和左侧共同顺序结合,但纯化的U1snRNA却不能。
U1snRNA参与剪接的证据是抗U1snRNP的抗体可以在体外抑制剪接作用;而且如果从系统中将U1snRNP除去,剪接即不能进行。
事实上,除去U1snRNA5'端的几个核苷酸即可抑制体外剪接作用。
有可能U5snRNA能识别右侧(受体位点)共同顺序;而U2snRNA,则具有与分支位点互补的顺序。
抗U2snRNP的抗体可以和U2snRNA及包括分支位点在内的内含子所形成的复合体发生免疫沉淀。
U1和U2可能参与剪接反应的起始阶段,因为U1和U2的灭活将阻止左侧连接点的切断和套索的形成。
另外两个snRNAsns(U4和U6)可能亦参与剪接作用,但它们的功能尚不详。
一般认为,脊椎动物细胞有6种不同的snRNAs,称为U1、U2、U3、U4、U5和U6。
最小的是U6,有约100核苷酸长。
最大的是U3,也不过215核苷酸长。
它们和蛋白质结合成snRNPs。
系统性红斑狼疮(SLE)患者和某些风湿病患者的血清中常可检出对snRNPs中某些蛋白质的自身抗抗体。
六、核内不均一RNA
编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转录的。
但是核浆中的RNA却并不像mRNA。
核浆RNA要大得多,很不稳定,并且其顺序的复杂性也要大得多。
由于它的大小很不一致,故称核内不均一RNA(hnRNA)。
已经证明mRNA确实是从hnRNA生成的。
细胞浆内的mRNA平均只有1800-2000个碱基。
而哺乳动物的hnRNA平均有8000-10000个碱基,其范围很广泛,从2000-14000碱基均有,所以一般要比mRNA大4-5倍。
如果以5倍计算,由于正常哺乳动物细胞中测得mRNA仅占hnRNA量的5%,则相当于有25%的hnRNA可转变为mRNA。
这意味着有3/4的hnRNA即在核内降解。
hnRNA被切除内含子后即成为mRNA,并进入细胞浆内。
但在切除内含子之前,hnRNA可先加帽和加poly(A)尾链。
有一种称为poly(A)聚合酶的酶可以用ATP为底物,以加上poly(A)尾链,这是hnRNA转变为成熟的mRNA所必须的。
在哺乳动物细胞中,仅约30%的hnRNA被多聚腺苷酸化,而mRNA中却约70%是有poly(A)尾链的。
可能多聚腺苷酸化是hnRNA分子要被加工的信号。
hnRNA的尾端要被切去一段,然后才加上poly(A)。
因为RNA聚合酶在转录时即已通过了相当于加上poly(A)的位点,故hnRNA尾端的多余部分要由内切核酸酶切去,才能加上poly(A)。
参考:
现代分子生物学(第三版)朱玉贤等
中国生物化学与分子生物学报
小木虫学术论坛
中国知网
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