FreeβHCG综述.docx
- 文档编号:25585254
- 上传时间:2023-06-10
- 格式:DOCX
- 页数:14
- 大小:138.05KB
FreeβHCG综述.docx
《FreeβHCG综述.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《FreeβHCG综述.docx(14页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
FreeβHCG综述
游离β人绒毛膜促性腺激素定量检测试剂盒
(化学发光法)
第三部分综述资料
一、产品预期用途
1.Freeβ-HCG及其临床诊断
绒毛膜促性腺激素(hCG)是由胎盘绒毛膜滋养层合体细胞分泌的糖蛋白激素,分子量约为39KD,含有α和β两个亚基。
可分规则HCG、缺口HCG、规则游离α亚基、规则游离β亚基和缺口游离β亚基多种形式,hCG在怀孕后6-8天内出现在血清中,并在最后一次月经之后50-80天内达到最大值。
β亚基是成簇的6个基因编码,但其中仅有两个在胎盘中得到转录与表达[1,2]。
大多数染色体非整倍体胎儿能引起母体血HCG水平的改变,因而可用检测母体血清HCG浓度来筛查染色体数目异常的遗传疾病,如Down综合征或21-三体综合征,以减少先天性缺陷患儿出生。
这已成为产前筛查的一项重要指标。
Freeβ-HCG比HCG更具有分辨性,且游离β-HCG在产前血清筛查中具有稳定性好,灵敏度高的优点,可同时用于母体孕早期和孕中期唐氏综合症的筛查。
调查数据表明唐氏综合症在新生儿中的发病率约为1/600~1/800,占小儿染色体病的70%~80%。
据估计我国目前大约有60万以上的唐氏综合征患儿,每年出生的唐氏综合征患儿可多达27万例左右,平均每20分钟就有1例唐氏综合征患儿出生。
而游离β-HCG在产前血清筛查中具有稳定性好,灵敏度高的优点,可同时用于母体孕早期和孕中期筛查。
因此,母体血清中人绒毛膜促性腺激素游离β亚单位的检测对产前Down氏综合征患儿筛查有非常重要的意义,且产前及时诊断染色体异常儿并终止妊娠,对降低出生缺陷、提高人口素质将发挥十分重要的作用。
β-HCG可用于异位妊娠。
在异位妊娠诊断中,Freeβ-HCG有100%的灵敏度和79%特异度,在有症状的患者中血清Freeβ-HCG测定可识别异位妊娠,有利于密切随访和减少输卵管妊娠破裂的危险性。
滋养细胞疾病患者血清中Freeβ-HCG大幅度升高。
Freeβ-HCG还可用来区分部分性葡萄胎和完全性葡萄胎,以及葡萄胎和侵蚀性葡萄胎。
羊水穿刺是诊断唐氏综合症的金标准,但由于羊水穿刺是种侵入性的操作,给患者带来痛苦,在实际临床工作中往往由于多种原因而难于实施。
而血清学检测具有无创伤性及敏感性的临床诊断指标取代羊水穿刺检查评价进行孕早期和孕中期的胎儿神经管缺陷或唐氏综合症的初步筛查,具有重要实用价值。
我们选题的目的就是研制高质量的唐氏筛查的血清学指标化学发光定量测定试剂盒,建立一种科学、方便、经济的血清学Freeβ-HCG检测方法,为临床诊断提供重要依据。
2.Freeβ-HCG的特性
2.1Freeβ-HCG的分子结构
绒毛膜促性腺激素(hCG)是由胎盘绒毛膜滋养层合体细胞分泌的糖蛋白激素,分子量约为39KD,含有α和β两个亚基。
可分规则HCG、缺口HCG、规则游离α亚基、规则游离β亚基和缺口游离β亚基多种形式[1]。
hCG的α-亚基的分子量约为13000,是92个氨基酸的糖肽,在52和78位天冬酰胺残基N-连接寡糖侧链,链中含有10个Cys残基,形成5个链内二硫键(7-31、1O一6O、28—82、32—84、59—87)维持结构稳定。
hCG的α-亚基的生物特性和其他垂体糖蛋白激素,如卵泡刺激素(FSH)、黄体生成激素(LH)、促甲状腺激素(TSH)的α-亚基相同。
β-亚基的分子量约15000,是145个氨基酸组成,链中含有12个Cys残基,形成6个链内二硫键(93—1OO、26—110、23—72、9-57、3488、38—90),这些二硫键的存在决定了hCG的二级结构,N端连接的寡糖附在13和30位天冬酰胺残基上,121,127,132,138位4个丝氨酸连接(O端连接)寡糖键结合在C端肽上[2]。
O-连寡糖主要有两种形式,三糖和六糖。
β-亚基为HCG特异性链,可被单克隆抗体检测,是一个较好的标志物。
2.2Freeβ-HCG的生物学功能
Freeβ-HCG是现在唯一知道的可以同时用于一期和二期筛查的标记物。
怀有唐氏综合症胎儿的母血中Freeβ-HCG水平高于健康孕妇,而在怀18染色体单体异常胎儿母血中戏剧性的降低。
唐氏综合症母血Freeβ-HCG平均水平为1.9MoM,健康母血为1.0MoM。
由于完整的hCG水平在DS患者母血中只有1.3MoM,不能明显鉴别出DS患者。
2.3产品预期用途
大多数染色体非整倍体胎儿能引起母体血Freeβ-HCG水平的改变,因而可用检测母体血清Freeβ-HCG浓度来筛查染色体数目异常的遗传疾病,如Down综合征或21-三体综合征,以减少先天性缺陷患儿出生。
如果胎儿患有唐氏综合症,则孕中期母体血清中HCG的游离β亚基水平会在怀孕中期增长超过100%[2,3]。
这已成为产前筛查的一项重要指标。
Freeβ-HCG具有分辨性强,且Freeβ-HCG在产前血清筛查中具有稳定性好,灵敏度高的优点,可同时用于母体孕早期和孕中期唐氏综合症的筛查。
Freeβ-HCG也可用于异位妊娠的诊断,异位妊娠的患者血清Freeβ-HCG浓度大概为28-180IU/L,β-HCG倍增时间延长,可达3~8d。
滋养细胞疾病患者血清中Freeβ-HCG大幅度升高。
当血中可测到高浓度的Freeβ-HCG时高度提示滋养细胞疾病。
Freeβ-HCG还可用来区分部分性葡萄胎和完全性葡萄胎,以及葡萄胎和侵蚀性葡萄胎。
本产品的预期用途为诊断唐氏综合症患儿,异位妊娠和滋养细胞疾病等疾病。
二、产品描述
1.化学发光免疫分析
20世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行分析检测,即利用发光的化学反应(chemiluminescence,CL)和生物反应(bioluminescence,BL)分析超微量物质,特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。
这一方法,从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段,近十年来获得了很大的发展。
化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)以其灵敏度高(attomole即10-18mol),快速(几秒钟内产生化学发光信号,有的情况下信号可持续几小时),简便,测试中不使用有害的试剂,因此成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
我公司采用的化学发光免疫分析方法,是利用酶催化发光底物,则发光底物发生化学反应并释放出大量的能量,产生激发态中间体。
这种激发态中间体,当其回到稳定的基态时,可同时发射出光子,利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额,该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。
由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。
与几种传统的免疫学检测方法对比而言,无论从灵敏度、检测时间、线性范围、试剂的稳定性、有无环境污染等方面对比,化学发光法的优势都显得极为突出。
化学发光法作为一种20世纪90年代才迅速兴起的一种新型检测技术,除具有检测方法简单快速的优点之外,还具有灵敏度高,检测范围宽等优点,因此越来越多的受到临床诊断实验室的关注,是近年来该领域的研究热点。
而我公司经过多年来的深入研究,已经开发建立了化学发光免疫检测平台,这就为下一步各种检测试剂盒的建立打下了坚实的基础。
2.检测原理
游离β人绒毛膜促性腺激素定量检测试剂盒(化学发光法)是基于酶联免疫分析技术和化学发光检测技术建立的检测体系。
试剂盒应用双抗体夹心法原理,将β-HCG单克隆抗体包被微孔反应板作为固相载体,辣根过氧化物酶(HRP)标记游离β-HCG单克隆抗体作为酶结合物,采用一步法反应模式。
在微孔板各孔中分别加入标准品、样本后,然后加入酶结合物,则标准品、样品中所含的Freeβ-HCG将会与之形成抗体-抗原-抗体-酶复合物。
洗去未结合的酶结合物后,加入化学发光底物,其发光强度与Freeβ-HCG含量成正比。
利用标准品所建立的标准曲线,可以计算出样本中Freeβ-HCG的含量。
双抗体夹心法原理如下图所示:
3.主要原材料来源
本试剂盒涉及到的主要原材料均为外购产品,来源如下:
Freeβ-HCG抗原:
纯化高值尿样,经DELFIA时间分辨荧光法甲胎蛋白/游离hCGβ亚基双标试剂盒测定其靶值为13421ng/ml。
β-HCG包被抗体:
购自依美诺生物
HRP-Free-β-HCG单抗:
购自依美诺生物
4.主要生产工艺过程
4.1包被板的生产
4.2酶结合物的配制与分装
4.3标准品的配制与分装
4.4发光底物的配制与分装
4.5试剂盒组装流程图
5.标准品、质控品的制备方法及量值的溯源
标准品是经标定的在试剂盒中配备的校准物质。
标准品内含有一定量的抗原物质,根据不同的抗原含量以及这些抗原在测定中不同的发光值,即可建立校准曲线,用于计算待测样本中该物质的含量。
标准品的制备方法是在选定的标准品稀释液中添加一定量的抗原,用DELFIA时间分辨荧光法甲胎蛋白/游离hCGβ亚基双标试剂盒测定的临床进行赋值。
定值后的标准品采用逐级稀释法即将高浓度的抗原通过适当的稀释,配制成系列浓度的标准品。
质控品主要是用于试剂盒的内部质量控制,因此质控品不需要进行赋值,而是用其相应的试剂盒对其进行多次测量,给出允许范围。
质控品的制备方法同标准品的配制,也采用逐级稀释法将高浓度的抗原通过适当的稀释,配制成低、高两个梯度的质控品,再用试剂盒标定其浓度,通过20-30次的测定,结果删除大于±2SD的数据,计算其平均值及标准差,得出质控品的允许测量范围。
三、有关生物安全性方面的说明
试剂盒中所用的主要原材料有β-HCG单克隆抗体、酶标Freeβ-HCG单克隆抗体、Freeβ-HCG抗原、牛血清白蛋白,Freeβ-HCG抗原经测定抗-HCV、抗-HIV、HBSAg、TRUST(anti-TP)均为阴性,在一定程度上保证了使用的安全性。
其他原料不含有任何病原体和任何人源性的组织和体液。
所使用的抗体是经过供货商纯化处理的,牛血清白蛋白在从牛血清提取过程中已经过多道工艺处理。
因此,本产品虽涉及到以上的动物源性生物材料的使用,但在其运输、使用过程中产品本身对使用者和环境均是安全的。
在产品使用过程中的所检测的血清样本具有潜在的污染性,血清样本及其所接触过的物品均应作为潜在的传染性物质,废弃时必须按照国家规定的医疗垃圾处理方法进行处理。
四、产品主要研究结果的总结和评价
1.主要研究结果的总结
试剂盒的研究过程,主要包括生物活性原材料的筛选,包被板、酶结合物和标准品的生产工艺研究、反应体系研究、正常参考值的确定和稳定性研究。
现将主要研究结果总结如下:
1.1生物活性原材料的筛选
筛选了高特异性的β-HCG单克隆抗体用于包被板的制备,Freeβ-HCG纯化的纯品用于配制标准品,HRP标记的Freeβ-HCG单克隆抗体用于配制酶结合物,应用这三种主要原材料建立起了Freeβ-HCG测定的方法和模式,为试剂盒的研制打下了坚实的基础。
1.2包被板的制备:
包被液采用Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)作为包被缓冲液,包被浓度为1/5000,于2~8℃过夜进行吸附包被。
采用含1%BSA的(pH7.4)溶液,37℃放置3hr,进行封闭,2.5%蔗糖的(pH7.4)溶液,37℃放置3hr,进行保护。
然后进行干燥,封袋。
1.3酶结合物的制备
酶结合物采用0.05MpH7.4Tris-HCl缓冲液+BSA+Casein+IPBC溶液作为稀释液,首批原酶配制酶结合物的工作浓度为1/3000。
1.5标准品的制备
标准品稀释液选用含BSA的0.05MpH7.4的Tris-NaCl溶液作为稀释液,配制的标准品浓度依次为:
0ng/ml,2ng/ml,5ng/ml,20ng/ml,100ng/ml,200ng/ml。
1.6反应体系研究结果
1.6.1反应模式:
20μl标本,加100ul酶结合物,37℃反应60分钟,纯化水洗板5次,加入100μl等比混合的发光底物,室温避光5分钟检测结果。
标准品防腐剂选用NaN3,酶结合物则选用Proclin-300作为系统中的生物防腐剂。
1.6.2正常参考值的确定:
测定840份正常人(含健康男性、非妊娠女性以及绝经后女性)标本,97.5%的正常人低于0.30ng/mL.
1.7稳定性研究
我们所做的稳定性试验,主要采用半成品加速破坏(37℃放置)稳定性试验和整盒正常保存条件下(2~8℃)实际放置至保质期后2个月的稳定性试验。
由该试验结果可知,加速破坏试验的37℃放置7天试验(相当于4℃放置12个月)试剂盒均能达到各项质控要求。
因此,初步将该试剂盒的有效期定为12个月。
2.试剂盒性能评价总结:
2.1分析灵敏度:
0.05ng/ml
2.2分析特异性:
测定含量为1400U/L的整分子hCG,测定结果不高于0.05ng/ml;
测定含量为324µU/ml的hTSH,测定结果应不高于0.05ng/ml;256U/L的hFSH,测定结果应不高于0.05ng/ml;250U/L的hLH,测定结果应不高于0.05ng/ml。
2.3干扰物质分析:
胆红素、血红蛋白、甘油三脂不影响检测。
2.4精密性:
分析内变异小于15%,分析间变异小于20%;
2.5稳定性:
试剂盒37℃贮存7天和2-8℃储存12个月都能达到各项性能指标。
2.6临床性能:
临床研究结果显示,与北京源德生物医学工程有限公司的游离绒毛膜促性腺激素β亚单位(Freeβ-HCG)定量检测试剂盒(化学发光法)对比测定,有较高的符合率和相关性。
五、其他
1国内外同类产品的批准上市情况
目前国内已批准上市的游离β人绒毛膜促性腺激素定量检测试剂盒及其方法和特点如下表所示:
试剂盒名称
生产商
注册号
批准日期
有效日期
DELFIA时间分辨荧光法游离hCGβ亚基试剂盒
芬兰PE
公司
国食药监械(进)字2006第3401080号
2006.06.18
2010.06.17
DELFIA时间分辨荧光法甲胎蛋白/游离hCGβ亚基双标试剂盒
芬兰PE
公司
国食药监械(进)字2006第3401221号
2006.07.20
2010.07.19
游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位(F-hCGβ)诊断试剂盒化学发光法
北京倍爱康生物
国食药监械(准)字2006第3400903号
2006.10.19
2010.10.18
游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位(F-hCGβ)诊断试剂盒(磁微粒分离酶联免疫法)
北京倍爱康生物
国食药监械(准)字2005第3401226号(更)
人绒毛促性腺激素游离β亚单位(Free-β-HCG)定量检测试剂盒(化学发光法)
康华生物
鲁食药械(准)字2008第2400247
2相关产品所采用的技术方法比较
以上所有产品的反应原理均是基于抗原抗体反应的免疫学检测原理,所不同的是在组成整个反应体系的某些方面采用了某种特别的技术。
以上国内的试剂盒无论是酶联免疫法、化学发光法还是时间分辨荧光分析法,除检测信号有不同外,其技术原理包括夹心法和竞争法,这主要与所选用的抗原抗体有关。
在产品的使用方面,都为手工操作,半自动检测仪器进行检测,仪器及试剂成本相对较低,适合中小医院使用。
我公司研制开发的游离β人绒毛膜促性腺激素定量检测试剂盒(化学发光法),采用双抗体夹心测抗原的方法,选用了高特异性的单克隆抗体进行包被,其基本原理与多数厂家一致。
同时我公司开发的试剂操作简便,结果快速准确,适合广大临床医院使用。
3临床应用情况
大多数染色体非整倍体胎儿能引起母体血HCG水平的改变,因而可用检测母体血清HCG浓度来筛查染色体数目异常的遗传疾病,如Down综合征或21-三体综合征,以减少先天性缺陷患儿出生。
这已成为产前筛查的一项重要指标。
Free-β-HCG比HCG更具有分辨性,且游离β-HCG在产前血清筛查中具有稳定性好,灵敏度高的优点,可同时用于母体孕早期和孕中期唐氏综合症的筛查。
β-HCG可用于异位妊娠。
在异位妊娠诊断中,Freeβ-HCG有100%的灵敏度和79%特异度,在有症状的患者中血清Freeβ-HCG测定可识别异位妊娠,有利于密切随访和减少输卵管妊娠破裂的危险性。
滋养细胞疾病患者血清中Freeβ-HCG大幅度升高。
Freeβ-HCG还可用来区分部分性葡萄胎和完全性葡萄胎,以及葡萄胎和侵蚀性葡萄胎。
唐氏综合症在新生儿中的发病率约为1/600~1/800,占小儿染色体病的70%~80%。
据估计我国目前大约有60万以上的唐氏综合征患儿,每年出生的唐氏综合征患儿可多达27万例左右,平均每20分钟就有1例唐氏综合征患儿出生。
因此,母体血清中人绒毛膜促性腺激素游离β亚单位的检测对产前Down氏综合征患儿筛查有非常重要的意义,有很大的市场空间。
六、参考文献
1.徐晓姹,人绒毛膜促性腺激素在体内的存在形式及其临床应用[J].国外医学临床生物化学与检验学分册,2005,11,26(11):
815-818。
2.Spencer,K.(1991):
Evaluationofanassayofthefreeβ-subunitofchoriogonadotropinanditspotentialvalueinscreeningforDown’ssyndrome.clin.chem.37,809-814.
3.Spencer,K.,Coombes,E.J.,Mallard,A.S.andWard,A.M.(1992):
freebetahumanchoriogonadotropininDown’ssyndromescreening:
amulticentrestudyofitsrolecomparedwithotherbiochemicalmarkers.Ann.clin.Biochem.29,506-518.
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- Free HCG 综述
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)