κ受体参与羟考酮后处理对家兔心肌缺血再灌注损伤的保护.docx
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κ受体参与羟考酮后处理对家兔心肌缺血再灌注损伤的保护
摘要
目的通过以往的研究证明表示如果想缓解由于心肌受损时血量减少为避免其的二次损伤要对它进行缺血(IscemiaPostconditioning)处理。
本文章就具体论述了时当给受伤缺血时的家兔注入盐酸羟考酮注射液( OxycodoneHydrochlorideInjection)后家兔的反应。
本实验就是要具体探明该注射液起到的保护作用,和分析了解κ受体在经过羟考酮后处理中能够产生的作用。
方法四肢灵动,活泼康健的雄性家兔,2.5~4月龄,体重2.1~3.0kg,将家兔调整到心肌缺血并需再灌注的状态,给家兔进行开胸,并在30分钟后对左前肢进行结扎并在180分钟后进行再注射,把它们任意分成五组:
1)非进行手术组(sham组,n=8)只给左前肢穿线,并不进行结扎;2)缺血再灌注组(I/R组,n=9):
左前降支结扎心肌缺血30min,再灌注180min;3)缺血后处理组(Ipoc组,n=9):
等再进行灌注的时候重复做三次,使得保证每次至少有30s的缺血和30s的注射;4)羟考酮后处理组(Oxpoc组,n=9):
可以在下一次注射前的五分钟左右给家兔的静脉缓慢注射羟考酮(0.3mg/kg);5)nor-binaltorphimne+羟考酮后处理组(BNI+Oxpoc组,n=10):
于再灌注起始前10min给予κ受体拮抗剂nor-binaltorphimne(3mg/kg),余处理同Oxpoc组。
最后再统计数据并测出此时家兔的血清浓度,通过相关法则测出家兔已经坏死的心肌面积,并计算出所占总体面积的百分比。
取一些心肌组织部分,并使用免疫组化染色法的原理来检测出存在细胞缝隙中的蛋白成分,从而推导出它的平均光密度OD值是多少。
结果与Sham组比较,其余四组血清CK-MB、cTn-I浓度升高(P<0.05),I/R组、Oxpoc组、IPOC组、BNI+Oxpoc组Cx43OD值降低(P<0.05);与I/R组进行比较,发现Ipoc组和Oxpoc组的心肌梗死面积减少,所占比例也降低了(P<0.01),Ipoc组、Oxpoc组血清CK-MB、cTn-I浓度降低(P<0.05),Ipoc组、Oxpoc组Cx43OD值升高(P<0.05);与Ipoc组或Oxpoc组比较,BNI+Oxpoc组心肌梗死面积百分比和血清CK-MB、cTn-I浓度升高(P<0.05),Cx43OD值降低(P<0.05)。
结论1.羟考酮在经过处理后能在一定程度上减轻心肌缺血的症状,它与缺血后进行心肌在注射有等同的功效。
而根据κ受体拮抗剂nor-binaltorphimne消除羟考酮后产生的效果可以得出,经过羟考酮的处理后,产生的保护作用的机制与κ受体是否激活有关。
2.通过激活κ阿片受体并调节Cx43的表达机制就有可能是羟考酮产生作用的途径。
关键词:
羟考酮;缺血后处理;再灌注损伤;心肌;κ受体;缝隙连接蛋白43
Abstract
Objective:
ToevaluatetheeffectofoxycodonepostconditioningingonmyocardialIschemia-reperfusioninjuryinducedbymyocardialischemia-reperfusioninrabbitsandtheroleofκopioidreceptors.
Methods:
Malerabbits,aged2~3months,weighing2.2~2.8kg,establishingthemodelofmyocardialischemia-reperfusioninjurybyocclusionoftheleftanteriordescendingbranchofcoronaryarteryfor30minfollowedby180minreperfusion, wererandomlydividedinto5groupsusingarandomnumbertable:
1)shamoperationgroup(groupSham,n=8):
leftanteriordescendingbranchthreadonly,notligated;2)ischemia-reperfusiongroup(groupI/R,n=9):
30minischemiaand180minreperfusiononlywithoutotherintervention;3)IschemiaPost-conditioninggroup(groupIpoc,n=9):
Atthefirstthreeminutesofreperfusion,threecyclesofa10sreperfusioninterspersedwitha10sischemiapreceded180minreperfusion;oxycodonepostconditioning(groupOxpoc,n=9):
oxycodone,0.3mg/kg,wasinjectedintravenouslyat5minbeforereperfusion.;κreceptorantagonistnor-binaltorphimne+oxycodonepostconditioninggroup(groupBNI+Oxpoc,n=10):
BNIwasgiven10minpriortoreperfusionandtherestof treatmentsasthesameasOxpocgroup.
VenousbloodsampleswerecollectedattheendofreperfusionformeasurementoftheplasmacTnIandCK-MBconcentrations.Therabbitswerethensacrificedandthehearttissuewasadoptedforthelaterdetermination.TTCstainingwasusedtodetectthemyocardialinfarctsizeandimmunohistochemicalstainingwasusedtodetecttheexpressionofCx43proteininmyocardialcells.
Results:
ComparedwithShamgroup,theplasmacTn-IandCK-MBconcentrationsintheotherfourgroupswereincreased(P<0.05)andthevalueofCx43ODweredecreased(P<0.05);ComparedwithI/Rgroup,Ipoc,Oxpocareapercentagereducemyocardialinfarctiongroup(P<0.01),Ipoc,concentrationofserumcTn-iOxpocgroupreduced(P<0.05),Ipoc,OxpocCx43ODvalue(P<0.05);ComparedwithI/Rgroup,theinfarctareasinIpocgroupandOxpocgroupweredecreased(P<0.01),theplasmacTn-IandCK-MBconcentrationsinIpocgroupandOxpocgroupweredecreased(P<0.05),thevalueofCx43ODandtheexpressionofCx43mRNAinIpocgroupandOxpocgroupwereincreased(P<0.05);ComparedwithIpocgrouporOxpocgroup,theinfarctareas,theplasmacTn-IandCK-MBconcentrationswereincreasedandthevalueofCx43ODweredecreasedinBNI+Oxpocgroup(P<0.05).
Conclusions:
1.Oxycodonecanprotecttheheartfrommyocardialischemia/reperfusioninjurywhenadministeredattheonsetofreperfusionandjustaseffectiveasischemiapost-conditioningandthcmechanismmaybeassociatedwiththeactivationofκreceptors.2.ThemyocardialprotectionofoxycodonepostconditioningmayregulatedtheexpressionofCx43throughactivatedκopioidreceptors.
Keywords:
Oxycodone;Ischemicpostconditioninging;reperfusioninjury;myocardial;Connexin43;kappaopioidreceptors
中英文缩略词表
缩略词英文全称中文全称
I/RIschemiareperfusioninjury缺血再灌注损伤
PCIPercutaneouscoronaryintervention经皮冠状动脉介入术
TTC2,3,5,-TriphenylTetrazoliumchloride氯化三苯基四氮唑
IPOCIscemiaPostconditioning缺血后处理
PPOCPhannacologicpost-conditioning药物后处理
MAPMeanarterialpress平均动脉压
HRHeartRate心率
CX43Connexin43细胞缝隙连接蛋白43
MIRIMyocardialischemia-reperfusioninjury心肌缺血再灌注损伤
序言1
第1章实验材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1主要仪器与设备2
1.1.2主要试剂与药物3
1.1.3实验动物3
1.2实验方法3
1.2.1实验动物分组3
1.2.2实验步骤4
1.2.2.1实验动物模型制备与监测4
第2章实验结果7
第3章讨论9
3.1家兔心肌缺血再灌注模型的制备9
3.2心肌再灌注损伤与缺血后处理10
3.3κ阿片受体在羟考酮后处理中的角色11
3.4Cx43与心肌缺血再灌注损伤11
第4章结论12
参考文献13
综述15
致谢26
攻读学位期间取得的科研成果27
目录
序言1
第1章实验材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1主要仪器与设备2
1.1.2主要试剂与药物3
1.1.3实验动物3
1.2实验方法3
1.2.1实验动物分组3
1.2.2实验步骤4
1.2.2.1实验动物模型制备与监测4
第2章实验结果7
第3章讨论9
3.1家兔心肌缺血再灌注模型的制备9
3.2心肌再灌注损伤与缺血后处理10
3.3κ阿片受体在羟考酮后处理中的角色11
3.4Cx43与心肌缺血再灌注损伤11
第4章结论12
参考文献13
综述15
致谢26
攻读学位期间取得的科研成果27
序言
随着21世纪人们生活水平质量的普遍提升,餐桌上的肉类食物也频频出现,身体健康的安全问题成为人们意识中的关键。
老龄化的加剧,环境的不断变更,致使我国的心脏病患者增多,因为缺血而造成的心脏病的患病率也再不断上升。
而导致心肌受损的原因有两大方面:
缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,I/R),它是由于冠状动脉堵塞而造成的心肌缺血并伴有冠状动脉重新注射后的损伤。
[1]对于一些急性的心肌缺血现象,对它进行在注射后会出现很多问题。
比如,心肌细胞的代谢会受到阻碍减缓,甚至造成凋亡等问题,还会影响心肌细胞的收缩和扩张,心跳异常等现象,所以说,人们十分关注由于缺血导致的心脏病的疾病。
近些年来,通过皮冠状动脉介入术(percutaneouscoronaryintervention,PCI)及溶栓治疗等心肌再注射技术的推进,我国对于心肌缺血再注射的治疗大有改善,与之前相比,只有很少的方法才能对再注射起到好的作用[2]。
所以说如果想让临床的效果好一些,就应当降低再次注射的频率,使之造成的损害减少,这样才会对患者的健康有更大的改善。
不管是预防还是保养都很重要。
心肌缺血后处理是一种减轻心肌受损的方法,他在心肌缺血后,长时间缺血之间的处理方法,通过一次或几次重复缺血再灌输,重复以上操作来提高心肌的耐受性。
但由于通过反复开通罪犯血管达到缺血后适应的措施,在临床应用上仍存在较多风险,所以说对于这种安全、便利还能控制住病情的药物方法的预防和治疗广为好评,受到了研发人员们的重视。
有相关的研究结果证明,可以通过罂粟、大麻、美沙酮等阿片受体激动剂来处理心肌缺血现象,来缓解对家兔造成的注射损伤[3]。
羟考酮(oxycodone)是一种为半合成的蒂巴因类衍生物,有强烈的止痛阵痛的功效,最近还研究出它可以帮助大鼠由于再注射引发的肝损坏[4]等问题,但对于其他的有没有缓解作用还不能下定论。
本篇文章就具体模拟羟考酮后处理对家兔缺血再进行注射后有什么影响。
第1章实验材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要仪器与设备
无菌手术包:
止血钳2把,元针1把、皮针1把、线剪1把、洞巾1块、辅料,镊子,小单2块、纱布、玻璃分针、6-0缝合线等。
24G密闭式静脉留置针(BDIntimaⅡTM竸瑪TM,天津罗兰医疗器械有限公司);
20G动脉留置针(BDIntimaⅡTM竸瑪TM,天津罗兰医疗器械有限公司);
BL-420S多功能生物机能实验系统(重庆市达亿科技有限公司);
-20℃低温冰箱(W255型,DW-40青岛海尔集团);
低温高速离心机(CT15REHITACHI,日本);
电热恒温水浴箱(S.HH.W21.600-S型,湖南向上医疗仪器厂);
数码照相机(Olympus-CH公司,日本);
包埋机(BMJ-Ⅲ型,福州市银河医疗仪器有限公司);
切片机(型号:
RM2015,莱卡公司,德国);
光学显微镜(Olympus-CH公司,日本);
制冰机(SIM-F140型,日本SANYO公司);
微波炉(广东顺德路美的电器有限公司);
Image-ProPlusv6.0图象分析软件(MediaCybernetics公司,美国)。
CK-MB试剂盒、cTnI试剂盒、UniCelDxI800免疫分析系统(贝克曼.库尔特公司,美国);
1.1.2主要试剂与药物
盐酸羟考酮注射液(批号:
BJ940,Hamol公司,英国);
nor-binaltorphimine(批号:
10A/121841,Tocris公司,英国);
氯化三苯基四氮唑TTC(批号:
T20150911,美国AMERSCO公司);
一抗:
小鼠抗大鼠Cx43单克隆抗体(CQ公司,英国)
二抗:
山羊抗小鼠抗体(中杉金桥),SP9002生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒(中杉金桥),
DAB显色剂(迈新试剂),
无水酒精、二甲苯、苏木素等均由河北大学附属医院中心实验室提供。
1.1.3实验动物
四肢健全、活泼康健的洁净雄性家兔60只,2.5~4月龄,体重2.1~3.0kg,具体实物由河北大学动物实验中心提供。
将家兔分开放置饲养,让它们能够自由饮水,并对它们进行标准的喂养。
保持它们的生活环境安全,适宜生存,使它们的身体状况符合健康实验动物的标准。
1.2实验方法
1.2.1实验动物分组
60只家兔随机分为5组:
(1)假手术组(Sham组):
左前降支只穿线,不结扎;
(2)缺血再灌注组(Ischemia/Reperfusion,I/R组):
左前降支结扎心肌缺血30min,再灌注180min;
(3)缺血后处理组(IschemiaPost-conditioning,Ipoc组):
保证3分钟内进行三次注射,使得保证每次至少有30s的缺血和30s的注射;
(4)羟考酮后处理组(OxycodonePost-conditioning,Oxpoc组):
保证在下一次注射前的五分钟左右给家兔的静脉缓慢注射羟考酮(0.3mg/kg)
(5)κ受体拮抗剂nor-binaltorphimne+羟考酮后处理组(BNI+Oxpoc组):
再灌注起始前10min给予κ受体拮抗剂nor-binaltorphimne3mg/kg,余处理同Oxpoc组。
1.2.2实验步骤
1.2.2.1实验动物模型制备与监测
在家兔的耳边的静脉上注射25%氨基甲酸乙酯4ml/kg,观察它的呼吸变化,可以根据实际的情况判断是否需要使用麻醉剂。
将麻醉后的家兔放好,使之位置固定,便于手术,将需要进行手术的部分清理干净,做好消毒处理,使用针扎入皮下组织记录它的胸导心电图。
并通过家兔右侧的静脉对其进行药物补充,并在它的左侧总动脉处放上压力换能器,以便于测试出它的平均动脉压(MAP)和心率(HR)。
实验过程中保持家兔直肠温度在36.5~37.5,℃,并以8m1/kg/h的速率静脉输注生理盐水维持液体平衡。
参考文献[5]具体可以制备心肌缺血的模型方法:
把家兔的左胸去毛,对其进行消毒处理,并在家兔第3,4肋间距离左边胸骨大约0.5cm处逐层剖开胸部,把心包膜剪开,暴露出它的心脏,此步骤中需要保持胸腔膜的完好无损,以便于家兔本身能够进行自主呼吸。
将左冠状动脉主干为中心,将针扎入约1.5mm,再将缝线两端穿过内径0.1cm,长2cm的硅胶管,稳定10min后束紧结扎线,然后松开结扎线进行再灌注180min。
Sham组仅穿线不结扎。
成功致使家兔缺血的表现:
被结扎住的心肌组织发干,由ECG示胸导联ST段加以抬高并大于0.3mV;成功进行再次注射的表现:
心肌组织部分显示出局部充血,并且ECG示胸导联示抬高的ST段下降1/2以上。
需要保证实验过程中的所有操作都需要合理,符合对动物伦理学的要求。
1.2.2.2心肌梗死面积测定
把已经进行再次注射了三个小时的家兔处死,并取出它的心脏,用冰的生理盐水对其进行清洁记录此时心脏的质量,并将心脏的心房、右心室和大血管迅速剪掉,将左心室置于-20℃冰箱冷冻15min,将心脏冷冻,从心尖到心底,垂直心室的长轴方向,切五片左右,片厚2mm,置1%TTC的PBS溶液中温育15min(避光,振荡,37℃,pH值7.4),并把它们放在10%中性福尔马林溶液中进行固定,大约20min后进行观察,肉眼见到的白色区域即为组织坏死区。
可以通过Image-ProPlus6.0图像软件进行计算分析,然后算出IS的面积,具体面积测定的方法为:
以坏死面积之和占总面积的百分比为心肌梗死面积比(IS/LVS),同一标本、同一测量者每次测量3次取均值。
1.2.2.3血清cTn-I、CK-MB浓度的测定
对已经进行再次注射的家兔三小时后在它的颈静脉出用EDTA抗凝管进行血样采集,约2毫升左右,4℃4000转/min,离心10min,离心半径8cm,取上层血清,采用UniCelDxI800免疫分析系统,通过磁粒子化学发光法的原理,检测出此时家兔的血清cTnI和CK-MB浓度。
1.2.2.4免疫组化染色检测Cx43蛋白表达
把已经进行再次注射了三个小时的家兔处死,并取出它的心脏,用冰的生理盐水对其进行清洁记录此时心脏的质量,并将心脏的心房、右心室和大血管迅速剪掉,并在穿线处的下方横向切取一层心肌片,约两毫米左右即可,并把它放在包埋盒中
(1)固定:
把包埋盒放在福尔马林溶液中进行固定,浓度为10%,呈中性状态,固定时间为24h,取出后用清水冲洗约15分钟,以便把甲醛清洗干净。
(2)梯度乙醇脱水、透明:
80%乙醇1h,95%乙醇30min,无水乙醇Ⅰ30min,无水乙醇Ⅱ30min,二甲苯Ⅰ15min,二甲苯Ⅱ15min。
(3)浸蜡:
石蜡65℃浸润1h,石蜡包埋。
(4)切片:
等到蜡块冷却下来固定住,再把它放在切片机上,整理成厚度约4um的组织切片,然后放入60℃的烤箱中进行烤片过夜。
(5)切片常规脱蜡至水:
二甲苯Ⅰ10min,二甲苯Ⅱ5min,无水乙醇Ⅰ1min,无水乙
醇Ⅱ1min,95%乙醇30″,80%乙醇30″,70%乙醇30″,水洗3次。
(6)热修复抗原:
把切片放在浓度为0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)中进行高压加热,等到缓冲液开始沸腾高压锅也开始喷气计时开始计时,3分钟后关闭,使之自然冷却,在用PBS冲洗三次,每次至少三分钟。
(7)3%过氧化氢去离子水孵育10min,PBS冲洗3min×3次。
(8)用山羊血清进行滴加,使之封闭,然后在室温中进行孵育15分钟左右,不需要进行清洗。
(9)注入一抗(小鼠抗大鼠Cx43单克隆抗体),4℃过夜,再用PBS冲洗三次,每次至少三分钟。
(10)注入二抗(山羊抗小鼠抗体),在室温进行孵育约15min,再用PBS冲洗三次,每次至少三分钟。
(11)找到链霉卵白素并加以识别,注入辣根便于标记。
然后在室温进行孵育约15min,最后用PBS冲洗三次,每次至少三分钟。
(12)DAB显色:
需要用到DAB显色试剂盒,用大约1毫升的蒸馏水,分别滴加到A,B,C三个试剂盒中,每个只滴加一滴,然后等它们混匀后再滴加到切片上,放在室温环境中,容易显色,在镜下控制好显色时间,直到出现特异性染色较强本底染色较浅时再进行清洗。
(13)脱水、透明:
80%乙醇30″,95%乙醇30″,无水乙醇Ⅰ1min,无水乙醇Ⅱ4min,二甲苯Ⅰ1min,二甲苯Ⅱ4min。
(14)中性树胶封片,显微镜下观察。
我们需要通过显微镜来观察CX43的分布,具体选取为在每张切片上选取3个400×不重叠的视野进行拍照,然后利用Image-ProPlus6.0图像分析软件来测定平均光密度值(OD值),作为Cx43表达量的半定量分析。
1.2.2.5统计学处理
我们具体使用SPSS21.0统计学软件进行数据分析,具体的数据资料以平均数±标准差(x±s)来表示,每组间的比较采用某一种因素的方差进行分析,比如假设检验时采
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