腺病毒载体操作手册中文版解析.docx
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腺病毒载体操作手册中文版解析
腺病毒载体操作手册中文版解析
腺病毒载体操作手册中文版
AdEasyTM操作手册
目录
缩写英文全称中文全称
AdAdenovirus腺病毒
Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒
AdVAdenoviralVector腺病毒载体
AmpAmpicillin氨苄青霉素
β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶
bpBasePair碱基对
BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白
cDNAComplementaryDNA互补DNA
cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA
CPECytopathicEffect细胞病理效应
CsClCesiumChloride氯化铯
DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基
DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜
DTTDithiothreitol二硫苏糖醇
EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸
EtBrEthidiumBromide溴化乙锭
FBSFetalBovineSerum胎牛血清
HrHour小时
ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复
KanKanamycin卡那霉素
kbKilobases千碱基对
KDaKiloDaltons千道尔顿
LBLuria-Bertani(broth)LB培养基
MCSMultipleCloningSite多克隆位点
MinMinute分钟
MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数
mRNAMessengerRNA信使RNA
MWCOMOIecularWeightCut-off
PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳
PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液
PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位
piPostInfection感染后
RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒
RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复
SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠
TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸
TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量
TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白
TETris/EDTATE溶液
wtWildType野生型
X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
第一章简介
当今基因输送技术的发展日趋复杂,一些治疗药物(生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物)和诊断性蛋白(单克隆抗体)的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。
为解决这一问题,基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展,致力于生产基因表型药物。
重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。
1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。
迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒,它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮(Fields等,1996)。
1977年,FrankGraham博士建立了一种细胞株,可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒(Graham等,1977)。
此后,腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用,尤其是在基因治疗相关领域。
迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表,我们给感兴趣的读者推荐以下文章:
Hittetal,1999和Wiveletal,1999。
腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白(Massieetal,1998A,B)。
但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。
昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司,这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。
现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞(Heetal,1998),使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。
重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。
AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA,目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。
这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则,并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤,包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。
AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂,所有成分购买后即可使用。
第二章应用重组腺病毒的优点
1.宿主范围广,对人致病性低
这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。
腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞,因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。
2.在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因
逆转录病毒只能感染增殖性细胞,因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行,而必须使细胞处于持续培养状态。
腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型,除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。
腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统,它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。
3.能有效进行增殖,滴度高
这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml,浓缩后可达1013VP/ml,这一特点使它非常适用于基因治疗。
4.无需辅助病毒,可容纳7.5kb外源DNA
为提供克隆空间,此腺病毒缺失了E1和E3早期区。
此外,此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子(105%)。
这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。
5.与人类基因同源
该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体,以人类细胞作为宿主,因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。
大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。
6.不整合到染色体中,无插入致突变性
逆转录病毒可随机整合到宿主染色体,导致基因失活或激活癌基因。
而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中,因此不会干扰其它的宿主基因。
在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。
7.能在悬浮培养液中扩增
293细胞可以适应悬浮培养,这一调整可使病毒大量扩增。
大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。
8.能同时表达多个基因
这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。
最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中,或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。
测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
第四章主要流程
4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体
AdEasyTM系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建:
pShuttle和pShuttle-CMV,这2个载体都含有多克隆位点(MCS)供插入基因。
pShuttle不含有启动子和多聚腺苷酸位点(polyA),允许插入含特定启动子和polyA位点的表达盒。
pShuttle-CMV含有单拷贝CMV启动子和polyA位点供基础表达和高表达重组蛋白,你只需将目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位点。
表1提供了各转移载体的特性。
表1AdEasyTM转移载体特性
载体名称克隆能力启动子polyA位点克隆位点线性化位点说明
pShuttle7.5kb——MCS共转化位点PmeI(ECoRI)
转染位点(PacI)将完整的表达盒装入多克隆位点(MCS)
pShuttle-CMV6.6kbCMV+MCS共转化位点PmeI(ECoRI)
转染位点(PacI)CMV启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白
℃20℃震荡培养60分钟。
7.将转化物铺3~5块LB/Kan(50ug/ml)培养板,37℃℃振荡培养60分钟。
7.培养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5α(1:
10、1:
100和1:
1000)
8.取100ul转化液铺在LB/Kan(50ug/ml)板上,37℃培养24小时。
未用的转化液可在4℃℃CO2
第五章常用技术
5.1QBI-293A细胞培养
昆腾公司的293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆,具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感,当细胞超过70%汇合时,一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下,QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293作为第一代,则30代内能得到最佳结果。
一旦到了30代,最好复苏一管细胞开始新的培养。
所以,我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞库。
QBI-293A细胞在DMEM培养液中培养,该培养液还含有4.5g/LL-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。
血清浓度为2%~10%,视实验需要来调节细胞生长速度。
为简化此操作说明,培养基描述为DMEM后加血清浓度(如:
DMEM5%表示:
含有4.5g/LL-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、终浓度为2mM的谷氨酰胺和终浓度为5%的热灭活胎牛血清)。
QBI-293A细胞需按标准的细胞培养规程进行操作,在健康状态时,它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。
被感染的细胞则变圆脱落,即所谓的细胞病理效应(CPE)。
所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则,这一点是至关重要的。
抗生素可用可不用,但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。
QBI-293A细胞生长的相对密度见下表:
表2:
汇合率与细胞数量
汇合率(%)60mm培养皿100mm培养皿
501.60×1063.5×106
752.40×1065.25×106
1003.20×1067.00×106
℃水浴轻轻晃动融化。
2.融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。
3.将细胞转入15mL无菌离心管中,加入10mLDMEM10%,600×g离心5分钟使细胞沉淀。
4.弃去上清。
5.将细胞用10mLDMEM10%重悬,轻轻打匀
6.转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。
7.在5%CO2孵箱中37℃℃储存24小时。
这一简便措施可保持约1℃/分钟的降温速率,适于冻存细胞。
8.第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150℃℃保存。
2.使用之前先在微波炉中融化5%SeaPlaque琼脂糖(避免沸腾),然后冷至45℃。
防止琼脂糖沸腾最好的办法是在沸水浴中加热,如果没有完全融化的话再在微波炉中加热数秒。
3.加入30mL预平衡至37℃的DMEM5%后充分混匀,这样琼脂糖的终浓度为1.25%。
立即使用。
覆盖QBI-293A细胞:
在进行下一步操作之前,请确认细胞是否已贴壁完好。
1.移去培养液,用1.25%琼脂糖/DMEM混合物覆盖单层细胞。
2.沿着培养板的边缘将琼脂糖轻轻加入,加入的具体体积参考表3,然后放回CO2孵箱培养。
表3:
不同培养器皿应用的琼脂糖体积
培养皿大小首次量追加量
100mm10mL5mL
60mm5mL3mL
6孔板3mL1.5mL
℃预热的PBS冲洗一遍,然后加入足量固定液(戊二醛或多聚甲醛)以覆盖细胞,0.05%戊二醛室温孵育5~15分钟或2%多聚甲醛室温孵育60分钟。
2.弃去固定液,室温下用PBS彻底洗3遍:
第一遍将冲洗液立刻弃去,第二、第三遍则让冲洗液保留5分钟。
3.加入最小体积的X-gal溶液。
4.37℃孵育1至12小时(过夜),阳性细胞将被染成蓝色。
染色完成后可将培养板置于4℃保存。
溶液:
a)戊二醛固定液
使用前将戊二醛用PBS稀释至终浓度为0.05%。
b)多聚甲醛固定液
1.将2g多聚甲醛溶解在50mL预热至55℃的水中。
2.加入2滴10NNaOH,溶液将变澄清。
3.待多聚甲醛溶解后,加入10mL0.2M磷酸二氢钠(2.76g/100mL)和40mL0.2M磷酸氢二钠(无水,3g/100mL)。
4.固定液在37℃条件下加入,在室温下固定。
多聚甲醛固定液可在4℃最长保存一个星期。
c)X-gal溶液
用PBS制备(PH7.4):
20mM氰铁酸钾(K3Fe(CN)6)
20mM氰亚铁酸钾(K4Fe(CN)6•3H2O)
2mMMgCl2或MgSO4
使用前加入X-gal储存液(20mg/mL溶于N,N-二甲基甲酰胺),终浓度为1mg/mL。
上述三种X-gal染色用的溶液可在室温下保存数月,溶于N,N-二甲基甲酰胺的X-gal储存液则可于-20℃表4:
各种筛选方法的特性
筛选方法优点缺点
Western杂交显示表达蛋白的完整性
显示插入基因的蛋白表达水平
需要表达蛋白的抗体可以用与其它蛋白有交叉反应的抗体,因为蛋白会在胶上得到分离
得到最终结果需两个星期
Southern杂交
或点杂交使用克隆基因作为探针,无须特殊试剂
通过信号强弱间接测定每个细胞内的病毒数量需从病毒储存液中额外扩增,整个流程需要一周时间
仅能检测克隆的基因
PCR迅速,使用扩增病毒的储存液只需1天时间仅能检测克隆的基因且无法定量
可能需要优化克隆基因的PCR条件
免疫测定相对快速,总共需要3天时间
需要与细胞蛋白无交叉反应的特异性抗体显示插入基因的蛋白表达水平
功能测定直接显示蛋白的完整性和功能需从病毒储存液中额外扩增,整个流程需要一周时间
℃病毒24小时。
4.铺一块每孔含1×105QBI-293A细胞的24孔板。
5.移去培养液,轻轻加入100μL步骤3中清洗的病毒(约103病毒颗粒),切勿将细胞吹起,十字型轻轻晃动3次,转入CO2孵箱37℃培养90分钟。
6.加入DMEM5%,使总体积为1mL,轻轻混匀。
7.37℃CO2孵箱培养直至完全出现CPE,在此MOI值下一般需要5~10天。
如果10天后还没出现CPE,说明此克隆的病毒量太低,需要进行第二轮扩增。
8.为从细胞中释放病毒,在-20℃和37℃中充分冻融细胞3次。
9.收集细胞,在15mL离心管中打碎。
台式离心机上以最大转速离心10分钟,收集上清并储存于-80℃。
这一冻存液中大约有5×107VP/mL。
如步骤7中所述,如果在第一次扩增后CPE不完全,则进行第二轮扩增。
由于QBI-293A细胞含有腺病毒基因组的E1区,因此E1区缺失的腺病毒与人染色体发生同源重组而产生有增殖能力的腺病毒(RCA)的机率很低。
发生这种回复突变的机率大约为1/107,这种腺病毒的增殖速度比重组腺病毒快。
首轮扩增产生的腺病毒保存液是十分重要的,因为它含有RCA的可能性最低。
这种保存液必须节约使用,并保存好所有低代病毒,以便进行大量扩增,不可用已传过数代的病毒进行大量扩增。
低代病毒DMEM5%溶液可在-80℃℃℃孵育2小时。
5.加入5MNacl储存液至终浓度为1M。
6.冰浴3小时以上,或4℃过夜。
7.14000×g4℃℃℃。
4.800rpm离心5分钟,弃上清,将沉淀用20ulPBS重悬,用P20移液器使细胞充分混匀,重悬。
此时,可按照能保留蛋白功能的操作方法提取蛋白。
注意,细胞抽提物含有大量病毒DNA,从而会提高溶液的粘滞度。
如果粘稠性影响操作,可用超声降解DNA或用20G针头将DNA打碎。
但细胞浆抽提物则不存在此问题。
对于DNA结合蛋白,蛋白功能测定通常是观察其迁移,对某些酶则进行比色测定。
5.6病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增
一旦重组病毒已被纯化和鉴定,即可在QBI-293A细胞中进行大量扩增。
本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法,按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。
由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000,因此1L培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。
如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化,则必须至少3×108的细胞,这样才能正确分辨出病毒带。
对于蛋白表达,则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止,离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。
为优化时间进程,每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。
如果由于各种原因不能同步,则必须将病毒冻存,直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。
注意每次扩增都将会剩下一些病毒,这些病毒先不必丢弃,以便下一步扩增失败时备用。
每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒,这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。
操作步骤:
1.在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10mlDMEM5%培养5×106QBI-293A细胞。
2.取0.5ul首次扩增的病毒保存液,加入DMEM5%至1ml,混匀,这样稀释应得到的MOI值约为5。
3.移去培养液,小心加入病毒混合液,切勿破坏细胞单层,十字形慢慢晃动3次,37℃CO2孵箱中培养90分钟。
4.加入9mlDMEM5%。
5.再培养72小时,这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒,进行MOI测定以估计病毒颗粒(5.3)。
如果此时得到的病毒量已足够,可立即进行病毒滴度测定(5.8)。
收集细胞,600×g离心5分钟沉淀细胞,去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。
-20℃/37℃冻融3次,台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片,收集上清,然后按5.8进行病毒滴定。
6.-20℃/37℃冻融3次。
7.转入15ml无菌离心管中,台式离心机上以最大速率离心10分钟,收集上清冻存于-20℃或-80℃。
8.3个175cm2培养瓶中各加入107QBI-293A细胞进行培养。
9.将3ml细胞裂解液上清加入12mlDMEM5%中,混匀。
移去细胞培养液,每瓶小心加入5ml混合液,十字形慢慢晃动混匀3次,37℃CO2孵箱中培养90分钟。
此时MOI值约为25。
10.加入DMEM5%至30ml。
11.再培养48~72小时。
此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。
若需要,进行MOI测定(5.3)以估计病毒滴度。
此时如果病毒量已足够,则可立即进入病毒滴定步骤(5.8)。
600×g离心5分钟收集细胞,弃上清,加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。
-20℃/37℃冻融3次,台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片,收集上清,按5.8章中所述进行病毒滴定。
12.移入50ml离心管中,台式离心机上最大速率离心10分钟,取出上清保存。
13.30瓶175cm2培养瓶中每瓶各加入107QBI-293A细胞。
14.将45ml细胞裂解液上清加入105mlDMEM5%混匀,从培养瓶中移去培养液,加入5ml混合液感染细胞,十字形缓慢晃动3次混匀,37℃培养90分钟。
此时MOI值约为25。
15.加入DMEM5%至30ml/瓶。
16.再培养48-72小时,此时约有3×1011~3×1012个病毒。
若需要,进行MOI测定估计病毒滴度。
如果要收集病毒颗粒,先收集被感染细胞,然后重悬在5mlDMEM5%中。
-20℃/37℃冻融3次,离心沉淀细胞碎片。
此时5mlDMEM5%中3×1011~3×1012个病毒颗粒,浓度为6×1010~6×1011vp/ml。
然后按5.8章中所述滴定病毒储存液,或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。
在109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液,而在1010细胞中扩增则有一定技术性。
切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞,因这会大大增加RCA产生量。
有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量。
如果已没有纯化的空斑,那么就不得不重新空斑纯化重组病毒,鉴定克隆后再进行扩增。
如果需要大于扩增4轮后的病毒量,注意请用早期的病毒作为扩增源。
比如,用第2代病毒产生第3代病毒。
如果没有第2代病毒,那么必须用第1代病毒来产生新的第2代病毒。
按这个原则进行扩增可使RCA水平尽可能低。
如果用于表达蛋白,则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。
细胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白,建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间,然后再大量扩增蛋白。
表5:
腺病毒扩增
第一代第二代第三代第四代
每瓶细胞数1×1055×1061×1071×107
培养瓶大小
(cm2) 75175175
培养瓶数24孔板1孔1330
感染来源稀释的空斑首次扩增后的病毒保存液第二代病毒第三代病毒
每瓶接种量0.1mL0.5mL或
2.5×107 1mL1.5mL
总培养体积1mL10mL90mL900mL
MOI0.0152525
滴度(VP/mL)1×108~95×108~93.3×108~93.3×108~9
总病毒量1×108~95×109~103×1010~113×1011~12
℃。
2.在离心管中缓慢加入8ml1.4g/ml氯化铯(53g+87ml10mMTrz-HCL,PH7.9),再非常轻缓地加入6ml1.2g/ml氯化铯26.8+92ml10mMTris-HCL,PH7.9)。
病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。
3.超净台中在不连续梯度顶部加入20mlDMEM5%病毒保存液,病毒量必须少于109细胞中所得的,否则将超过密度梯度负荷量。
如果保存液的体积少于20ml,用PH7.910mMTris-HCL调至20ml。
4.平衡离心管,100000×g(SW28转子上为23000rpw)4℃℃℃透析,去除氯化铯盐。
由于病毒分子量较大,大小约90nm,因此不能穿过透析膜。
缓冲液的体积应为病毒溶液的200倍,每次透析一小时,然后更换缓冲液,3次更换缓冲液后应已无痕量氯化铯。
透析后的病毒溶液可在-80℃中长期保存,-20℃中则可保存较短时间。
需要注意的是腺病毒在反复冻融后感染力将减弱,因此可将病毒分装成小份,一部分进行滴度测定(5.8:
病毒滴度测定),剩下的用于以后的实验。
如果透析后病毒溶液太稀,Millipore公司的超纯浓集柱可将病毒浓度提高10倍。
这个过程中所丢失的病毒量小于10%。
纯化柱在使用前必须用70%乙醇消毒,然后在加入病毒前再去除痕量乙醇(比如用病毒缓冲液)。
5.8病毒滴度测定
有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1.VP(病毒颗粒)或OPV(光学颗粒单位)
2.GTU(基因转移单
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