临床免疫学检验实用标准操作程序SOP.docx
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临床免疫学检验实用标准操作程序SOP.docx
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临床免疫学检验实用标准操作程序SOP
临床磁酶免疫学定量检验
Ⅰ可调式移液器的标准操作程序(SOP)
实验室名称
项目
编号
制定日期
内分泌检验室
可调式移液器的标准操作程序
000001
05年01月03日
【目的】
规范仪器设备的操作程序,保证加样器的正常状态。
【适用范围】
本实验室加样器的操作。
【操作人员】
本实验室实验人员。
【操作步骤】
1.设定容量值:
转动加样器的调节旋钮,反时针方向转动旋钮,可提高设定移液量。
顺时针方向转动旋钮,可降低设定移液量。
在调整设定移液量的旋钮时,不要用力过猛,并应注意使移液器显示的数值不超过其可调范围。
2.预洗:
当装上一个新吸头时应预洗吸头,先吸入一次液体并将之排回原容器中。
3.吸液:
[1]选择合适的吸头安放在移液套筒上,稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙。
[2]取液之前,所取液体应在室温(15℃-25℃)平衡。
[3]把按钮压至第一停点,垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮,吸入液体,等一秒钟,然后将吸头提离液面,贴壁停留2-3秒,使管尖外侧的液滴滑落。
4.放液:
[1]将吸头口贴到容器内壁底部并保持100~40°倾斜。
[2]平稳地把按钮压到第一停点,等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体。
[3]压住按钮,同时提起加样器,使吸头贴容器壁擦过。
[4]松开按钮。
[5]按吸头弹射器除去吸头。
5.加样器吸嘴为一次性使用。
【加样器的维护保养程序】
加样器应根据使用频率进行维护,但至少应每3个月进行一次,具体方法如下:
1.一般维护可用中性洗涤剂清洁,或者用60﹪的异丙醇,然后用蒸馏水反复洗涤,去除洗涤剂或异丙醇,晾干。
清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。
2.如果有液体进入加样器内的严重污染,可将加样器拆开后进行清洁,具体拆开步骤参照加样器说明书。
3.高压消毒,有的加样器的吸管部分可高压消毒,但需注意的是消毒时不可超温超时,也不能挤压放置,以免造成变形。
4.可调式移液器在不使用时应妥善地竖立放于支架上,远离潮湿及腐蚀性物质。
5.在移液操作过程中为防止液体进入加样器套筒内,必须注意:
压放按钮时保持平稳;加样器不得倒转;吸头中有液体时不可将加样器平放。
6.每天开始工作之前应检查移液器的外表面是否有灰尘或污物,若有则小心抹去。
操作人员部门主管质量负责人
姓名杨晋红王雅萍杨晋红
日期05年01月03日
Ⅱ洗板机的标准操作程序(SOP)
实验室名称
项目
编号
制定日期
******
洗板机的标准操作程序(BI0-RAD)
******
**年**月**日
【目的】
规范洗板机的操作程序,保证洗板机的正常状态。
【适用范围】
本实验室洗板机的操作。
【操作人员】
本实验室实验人员。
【操作步骤】
1.拔掉废液瓶口的塞子(接有与洗板机相连的废液管),倒掉废液瓶的废液,再把塞子安紧在废液瓶口上。
注意不要让废液管拧劲,以保证废液管的通畅。
2.拧开洗液瓶的盖子(接有与洗板机相连的洗液管),倒掉前一天洗液瓶里剩余的洗液,倒进新配的洗液。
拧紧盖子,注意不要让洗液管拧劲,以保证洗液管的通畅。
3.保证待洗反应板所有的孔处于同一水平位置,以免孔边缘过高碰到洗板机的吸液针。
4.插上电源,打开电源开关(按后面板POWER键),出现如下界面:
SELECT:
RUN
↑↓INYESOUT
5.按“OUT”键,载板台弹出。
将待洗反应板放在载板台上。
6.按“YES”键后再按↑或↓键以选择相应程序,然后按再“YES”键,此时屏幕显示“LASTSTRIP12”。
LASTSTRIP12
↑↓YESESC
7.再按↑或↓键以选择待洗板条的数目。
然后按“YES”键即可。
RUN:
P01
STRIP12YESESC
8.清洗完成后,重新出现4的界面。
拿下已洗好的反应板,按“IN”键,载板架弹进。
再按后面板POWER键关闭电源。
9.若中途退出,按“ESC”键。
【洗板机的维护保养】
1.平常不用时,拔掉电源插头。
2.每天洗板机工作结束时,要对内外其进行清洁,用湿抹布擦洗洗板机的外壁及载物台,以保证其洁净。
用蒸馏水将所有的管道清洗一遍,防止洗液的结晶堵塞管道。
3.及时倒弃废液,以免废液瓶过满致使废液回流而造成洗板机的故障。
4.保证待洗的反应板的孔边缘不要过高且水平,以免造成吸液针损伤。
5.定期将洗液及废液管道拆卸下来进行冲洗,以保证管道的通畅。
【编制洗涤程序】
1.插上电源,打开电源开关(按后面板POWER键),出现如下界面:
SELECT:
RUN
↑↓INYESOUT
按“↑”“↓”键使RUN变成EDIT后按“YES”键进入如下界面:
SELECT:
EDIT
↑↓INYESOUT
然后,根据自己的需要选择适合的洗涤方式,一般选择整板洗涤且8孔模式,每一洗涤循环包括吸液(根据自己的需要设定吸液的速度)、注水(根据自己的需要设定注水量)、再吸液(根据自己的需要设定吸液的速度)三步,设定5或6个循环即可。
编程完成后,按EXIT回到1的界面。
操作人员部门主管质量负责人
姓名******************
日期**年**月**日
Ⅲ酶标仪的标准操作程序(SOP)
实验室名称
项目
编号
制定日期
******
酶标仪的标准操作程序
******
**年**月**日
【目的】
规范仪器设备的操作程序,保证酶标仪的正常状态。
【适用范围】
本实验室加样器的操作。
【操作人员】:
本实验室实验人员。
【操作步骤】:
1.插上电源,打开电源开关(按后面板POWER键),出现如下界面:
Th01Jan00:
00
﹤Measure﹥
此时按“﹤”或“﹥”键可选择Measure或quick及其它操作(如编程、查找前面的测试结果等)。
若通过标准曲线进行定量检测的项目用Measure;若只是需要反应的光密度值,则用quick。
2.在1的界面时,按面板上的“∨”键弹出载物台。
3.将待测板放置于载物台上
4.按“ENTER”键后再按“﹤”或“﹥”键以选择待测项目的相应程序(每个通道存放的程序已由本室人员根据试剂盒的要求事先输入)。
SelectTest1
《项目名称》
5.连按“ENTER”键3次即可。
6.打开打印机电源,放上A4纸,打印出测试结果。
7.测试完毕后,若Measure测试则酶标仪自动弹出载物台;若quick测试则需按面板上的“∨”键弹出载物台。
拿下测试完的反应板,再按“∧”键将载物台弹进酶标仪内。
8.关闭酶标仪及打印机电源。
【酶标仪的维护保养】
1.平常不用时,拔掉电源插头。
2.使用完毕,一定要拿下测试完的反应板,千万不要将反应板留在载物台上,并且要把载物台弹进酶标仪内。
3.若有液体溅到载物台或酶标仪外壁,应用湿抹布及时擦去。
4.每次使用完毕用湿抹布擦拭酶标仪,以保持其洁净。
【编制测试程序】
1.插上电源,打开电源开关(按后面板POWER键),出现如下界面:
Th01Jan00:
00
﹤Measure﹥
2.此时按“﹤”或“﹥”键可进入如下界面
Th01Jan00:
00
﹤testdata﹥
3.按ENTER确认这个选择,再按“﹤”或“﹥”键可进入如下界面
testdata
﹤define﹥
4.按ENTER确认这个选择,再按“﹤”或“﹥”键选择程序号,并按。
ENTER确认。
Selecttest
﹤ⅩⅩⅩ﹥
definetest
﹤testname﹥
输入实验名称,利用﹤”或“﹥”键选择所需参数。
definetest
﹤filter﹥
此指令用于进入测试滤光片和参比滤光片的波长。
确定所虚波长后,按EXIT键返回此界面,再利用﹤”或“﹥”键进入如下界面:
definetest
﹤shanking﹥
此指令用于选择振摇时间、方式和位置。
确定需求后,按EXIT键返回此界面,再利用﹤”或“﹥”键进入如下界面:
definetest
﹤layout﹥
此指令用于定义盘孔分布及输入各标准品相应浓度。
本室一般把标准品定义在反应板的第一列。
确定需求后,按EXIT键返回此界面,再利用﹤”或“﹥”键进入如下界面:
definetest
﹤evalmode﹥
此指令用于选择被执行的报告方式,定性、定量或其他报告方式。
确定需求后,按EXIT键返回此界面,再利用﹤”或“﹥”键进入如下界面:
definetest
﹤validations﹥
校验公式,此指令用于检查结果是否正确。
确定需求后,按EXIT键返回此界面,再利用﹤”或“﹥”键进入如下界面:
definetest
﹤exict﹥
按此键退出,编程结束。
操作人员部门主管质量负责人
姓名******************
日期**年**月**日
ⅣHBsAg检测的标准操作程序
实验室名称
项目
编号
制定日期
******
ELISA方法
******
**年**月**日
【目的】
保证检测结果准确可靠.
【该SOP变动程序】
本标准操作程序的变动,可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字:
专业主管、科主任。
【标本的采取和保存】
随机静脉血2ml,分离血清备用。
也可使用血浆标本进行检测。
标本宜新鲜,无污染,避免无溶血,避免反复冻融,不可用NaN3防腐。
【操作程序】
1.实验准备:
从冷藏环境中取出试剂盒,在室温下平衡30分钟,同时将浓缩洗涤液作1:
20稀释。
2.加待测标本:
加入待测标本每孔0.05毫升,并设HBsAg阳性对照2孔,HBsAg阴性对照2孔,空白对照1孔。
3.加酶结合物:
每孔0.05毫升,空白对照孔不加,充分混匀,置37℃孵育30分钟。
4.洗板:
1)手工洗板:
弃去反应板条孔内液体拍干;用洗涤液注满每孔,静置5—10秒,弃去孔内洗涤液拍干,如此反复5次,拍干。
2)洗板机洗板:
选择洗涤5次的程序洗板,最后拍干。
5.加显色剂:
先加显色剂A,每孔0.05毫升;再加显色剂B,每孔0.05毫升;充分混匀,放置37℃避光孵育15分钟。
6.终止反应:
每孔加入终止液0.05毫升,混匀。
7.测定:
用酶标仪读数,可选择唯波长450nm(以空白孔校零)或双波长450/630nm,读取各孔OD值。
【结果判断】
Cutoff值计算:
COV=阴性对照平均OD值×2.1
标本OD值>COV为阳性,标本OD值 注: 阴性对照OD值低于0.05作0.05计算,高于0.05按实际OD值计算。 【注意事项】 1.试剂使用前应摇匀,并弃去1-2滴后垂直滴加,注意均匀用力。 2.从冷藏环境中取出的试剂盒应置室温平衡30分钟再进行测试,余者应及时封存,置冰箱内贮藏备用。 3.洗板时所用的吸水纸请勿反复使用。 4.不同批号试剂请勿通用。 5.结果判断须在10分钟内完成。 6.封片不能重复使用。 7.用本试剂盒应视为有传染性物质,请按传染病实验室检查规程操作。 操作人员部门主管质量负责人 姓名****************** 日期**年**月**日 Ⅴ免疫学检验室内质量控制的标准操作程序 实验室名称 项目 编号 制定日期 ****** ELISA方法 ****** **年**月**日 【目的】 保证ELISA检测结果准确可靠,充分发挥其方法学的优点。 【该SOP变动程序】 本标准操作程序的变动,可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字: 专业主管、科主任。 【方法】 【分析前质控】 1.人员培训 实验是人操作的,因此检验人员需经过培训,熟练掌握本专业如下几方面的技术知识: [1]检验项目的基本原理(ELISA原理); [2]临床意义; [3]熟悉检测技巧,了解易出差错的环节及难点; [4]熟悉检测试剂性能(包括试剂盒组成,包被片段及其组成); [5]熟悉检测仪器的原理及性能;掌握数据处理的能力和质量控制知识。 [6]某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班,考试合格后持证上岗。 2.室内质控血清的制备: [1]收集阳性血清(无明显溶血、黄胆、脂肪血和污染血清,到一定量(够本室使用3-6个月的量); [2]传染性病毒阳性需经56℃、10小时灭活后使用; [3]过滤,除纤维沉淀物; [4]稀释,用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀释; [5]测定值,与定值参考品进行对比、求值,一般定在CutOff值附近的阳性值; [6]分装小瓶(每日用量),加盖、贴签,-20℃冻存备用 【试剂盒选择】 卫生部规定乙肝试剂,丙肝试剂,艾滋病试剂,梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格,并贴有防伪标签的产品。 【试剂盒评价】 试剂评价需要有权威的血清考核盘(Panel)进行检测,价格昂贵,操作繁琐,一般实验室不易开展,可以通过以下信息,了解试剂质量。 1.根据该试剂生物制品鉴定所的批批检定报告,了解其质量水平,按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂; 2.通过询问试剂包被物的组成,如原料来源(基因工程或合成多肽),片段的组合(按比例混合或化学合成),片段的长短等判断试剂的优劣; 3.参考室间质评报告中对试剂的评价结果,了解不同试剂的质控成绩。 4.根据权威部门发布的试剂评价结果,了解市场上试剂的质量优劣。 【仪器质控】 为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序(SOP),所要控制的仪器包括移液器(加样枪),水浴箱(温箱),洗板机和酶标仪。 1.移液器: ELISA加样量小(5-100ul),其准确性直接影响实验结果,利用称重法检查: 吸取刻度指示量的水,万分之一天平称重后计算吸量是否准确,一般应在±10%以内; 2.水浴箱: 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中(或温箱内)实测温度是否一致,允许有±1℃的误差; 3.洗板机: 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul,人工扣板时,垫纸不湿,定期检查管孔是否堵塞; 4.酶标仪: 经常维护其光学部分,防止滤光片霉变,定期检测校正,使其保持良好的工作性能。 酶标仪的主要性能指标有: 测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。 优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001,准确性为±1%,重复性达0.5%。 酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。 普通的酶标仪在0.000~2.000,新型号的酶标仪上限拓宽达2.900,甚至更高。 超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。 应注意可测范围与线性范围的不同,线性范围常小于可测范围,比如某一酶标仪的可测范围为0.000~2.900,而其线性范围仅0.000~2.000,这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。 【酶标仪校正程序】 1.滤光片波长精度检查: 将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下,用UV-2201型紫外-可见分光光度计(波长精度±0.3nm)于可见光区对每个滤光片进行扫描,其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。 一般酶标仪无585nm滤光片,可选用550nm或630nm滤光片。 450nm滤光片的检定选用普鲁兰溶液(校正波长为630nm)。 2.通道差与孔间差检测: 通道差检测是取一只酶标板小孔杯(杯底须光滑,透明,无污染以酶标板架作载体,将其(内含200ul甲基橙溶液吸光度调至0.500A左右)置于8个通道的相应位置,蒸溜水调零,于490nm处连续测三次,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性,可用极差值来表示。 孔间差的测量是选择同一厂家,同一批号酶标2板条(8条共96孔)分别加入200ul甲基橙溶液(吸光度调至0.100A左右)先后置于同一通道,蒸溜水调零,于490nm处检测,其误差大小用±1.96s衡量。 3.零点飘移(稳定性观察): 取8只小孔杯分别置于8个通道的相应位置,均加入200ul蒸馏水并调零,于490nm处每隔30分钟测一次,观察各个通道4小时内吸光度的变化。 4.精密度评价: 每个通道3只小杯分别加入200ul高中低3种不同浓度的甲基橙溶解,蒸馏水调零,于490nm作双份平行测定,每日测二次(上下午各一次),连续测定20天。 分别计算其批内精密度,日内批精密度,日间精密度和总精密度及相应的CV值。 5.线性测定: 用电子天平精确称取甲基橙配制5个系列的溶液,于490nm平行测8次,取其均值。 计算其回归方程,相关系数及标准估计误差s,并用±1.96s表示样品测量的误差范围.双波长测定评价: 取一分甲基橙溶液,分别加入3种不同浓度的溶血液(测定波长为490nm,校正波长为585nm),先后于8个通道检测,每个通道测3次,比较各组之间是否具有统计学差异,以考察双波长消除干扰组分的效果。 【标本的采集和保存】 1.标本采集时应尽量避免溶血,因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本会增加非特异性显色造成假阳性。 2.长菌的标本同样的道理也易产生假阳性,因菌体中可能含有内源性HRP也会产生假阳性反应。 3.抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性,建议尽量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝剂。 4.标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深,一般血清置4℃冰箱5天内完成测试。 如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存,冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,融解时应上下颠倒充分混匀,同时避免气泡。 可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。 反复冻融会使抗体效价跌落,如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。 5.ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免,尤其不应与生化试验用同一管标本。 【分析中质控】 ELISA实验的结果受操作影响很大,每个步骤包括加样,温育,洗涤,显色,酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏,强特异的优点。 因此,应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。 1.加样 [1]加样应用微量移液器(加样枪)按规定的量加入微孔板底部,避免加在孔壁上部,不可溅出,不可产生气泡。 [2]每次加样应更换吸嘴,做到一人一吸头,以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。 [3]样本稀释,目的是为了减少非特异性反应,所以一定要先加稀释液后加样本,特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟,同时注意防止液体溢出。 如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。 [4]如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。 2.温育 [1]抗原抗体反应需要在一定温度下(37°C),经过一定的时间才能达到反应的平衡点 [2]ELISA边缘效应是由温育形成的。 所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。 水要浸至板条的1/3处。 [3]反应板不宜叠放,注意温育的温度和时间应按规定控制,一个人操作时,一次不宜多于两块板同时测定。 3.洗涤 [1]手工洗涤一般采用浸泡方法: 1)甩去孔内反应液;2)用洗涤液过洗一遍(即注满孔后即甩去);3)微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟,间歇摇动;4)甩去孔内液体,拍板,用纸吸干。 重复以上操作至少5次。 注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。 [2]洗板机洗板一定要预先把板架放平,使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底,将孔内液体全部吸干,同时要设置一定的浸泡时间。 如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。 关机前要用蒸溜水冲洗管道,避免堵孔。 4.显色 [1]HRP催化底物的一步呈色反应,同样需要一定的时间和温度, [2]一定要按照说明书规定的时间温度(一般为37°C,10-15分钟)恒定反应后终止 [3]或根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间. 5.酶标仪判读结果 1.显色反应终止后应立刻比色(30分钟内)。 2.常见的显色系统有OPD和TMB二种,以后者最为常见,而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。 OPD终止后显棕色,测定波长为490nm;TMB终止后显黄色,测定波长为450nm,二种底物的校正波长均用630nm。 3.使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。 同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色,否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。 【分析后质控】 【报告方式】 1.定性试验: 国内外为便于统一计算,一律按S/COV方式报告,S为标本A值,COV即CutOff值(或COV) [1]夹心法和间接法以S/COV≥1为阳性;竞争法与中和法以S/COV﹤1为阳性 [2]COV的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有: A)COV=2.1×N(当N不足0.05时按0.05计),此公式由P/N>2.1换算而来,常用于夹心法。 B)COV=0.5×N,从抑止率公式换算而来,常用于竞争,中和法。 C)COV=N+C(C为常数),用于间接法。 D)COV=C×P+N(C为常数),用于间接法。 此公式最客观,但对厂家要求很高,阴阳性对照测定值要基本恒定。 2.定量分析: 严禁用定性试剂盒做定量分析。 [1]用已知量的系列标准品,绘制标准曲线,结果以绝对量或单位表示。 ELISA的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。 [2]现有的ELISA定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线,要得到精确的结果实属不易。 【记录】 [1]所有实验的原始资料均应存档;所有的记录均应规范登记在册;原始登记表应记录试剂来源、批号;质控血清的来源及测定值并注明是否在控;签上实验者姓名及审核者姓名。 [2]如试验结果对临床诊断有决定意义,其样本应保留,至少与病历保存期一致 【定性试验】 ELISA定性试验的临床意义在于是否检出病原体,与检出量无关,因此QC要保证试验的灵敏度和特异性。 生化的质控图方法仅能观察灵敏度而无法监控特异性。 建议使用临界值血清界定法: 将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应;另设临界值、高值质控血清,正常人血清作为外对照,与标本同时检测,临界值S/C.O≥1,高值质控血清S/C.O≥10,正常人血清A值在0.05~0.07之间。 阳性质控血清失控(临界值为灵敏度,高值为"HOOK"效应监控)应重做阴性标本;阴性对照失控应重做阳性标本。 以表格式记录每块板的外对照实验结果,作为QC资料存档。 【定量试验】 ELISA定量试验常见于肿瘤因子(如AFP,CEA,CA系列),激素类,免疫球蛋白类,这些物质在体内有一定的量(正常范围),超出这个量才呈病理情况,故需定量测定。 定量试验的质控方法可参考生化方式。 【"即刻性"质控】 在开始进行质控时,只需要有3个质控血清测定值即可进行质控。 当这组数据扩大到20次有效值时就可以计算RCV的X,s。 方法: 1.先将测定值从小到大排列,X1最小,Xn最大; 2.计算X和s; 3.计算SI上限值和下限值。 SI上=(X最小-X)/S,SI下=(X最大-X)/S 4.对照SI表,检查是否出控,SI上
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- 临床 免疫学 检验 实用 标准 操作 程序 SOP