植物DNA和RNA提取方法.docx

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植物DNA和RNA提取方法

实验一植物基因组DNA的提取

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。

学习根据不同的植物和实验要求设计和改进植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强复原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS）等离子型外表活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要试剂配方

2%CTAB抽提缓冲溶液:

CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml（PH8.0）

EDTA8ml，先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,冷却后0.2-1%2-巯基乙醇

〔400ul〕

氯仿-异戊醇〔24：

1〕：

先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1.DNA的提取

〔1〕2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

〔2〕取少量叶片〔约1g〕置于研钵中，用液氮磨至粉状；

〔3〕加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

〔4〕将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

〔5〕置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；

〔6〕冷却2min后，加入氯仿-异戊醇〔24：

1〕至满管，剧烈振荡2~3min，使两者混合均匀；

〔7〕放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；

〔8〕10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

〔9〕10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；

〔10〕60sec后，直立离心管，加入720µl的75%乙醇及80µl5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

〔11〕放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；

〔12〕10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800µl75%的乙醇，将DNA再洗30min；

〔13〕10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA〔自然风干或用风筒吹干〕；

〔14〕加入50µl0.5×TE（含RNase）缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解；

〔15〕置于-20℃保存、备用。

2.DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、注意事项

〔1〕叶片磨得越细越好。

〔2〕移液器的使用。

〔3〕由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

思考题：

1.本实验中所用到的各试剂的作用是什么?

CTAB,氯仿,异丙醇,75%乙醇,EDTA

2．提取基因组DNA的方法有哪些？

各有何优缺点？

实验二多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

一、实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。

二、实验原理

PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。

基本原理及过程如下：

PCR循环过程中有三种不同的事件发生：

〔1〕模板变性；〔2〕引物退火；〔3〕热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1．变性：

加热使模板DNA在高温下〔94-95℃〕变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2．退火：

在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。

3．延伸：

体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕，按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：

DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。

琼脂糖凝胶电泳的原理：

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。

不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。

琼脂糖凝胶电泳法别离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。

溴化乙锭〔EB〕为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。

EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。

用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。

三、实验材料及相关试剂

基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等

四、实验步骤

1．模板DNA的抽提：

实验一所得的水稻基因组DNA。

2．PCR操作（在冰上操作）：

〔1〕PCR反应混合液的配制：

反应体系25µL,在无菌的0.2mL离心管中按以下操作程序加样：

反应物

加样顺序

体积/µL

终浓度

ddH2O

1

×n

10xBuffer

2

×n

1x

25mmol/LMgCl2

3

×n

1.5mmol/L

10mmol/LdNTP

4

×n

200µmol/L

10µM上游引物

5

1×n

0.4µmol/L

10µM下游引物

6

1×n

0.4µmol/L

DNATaq聚合酶

7

×n

1U

〔2〕将反应混合液混匀,然后每个PCR管中分装24µL反应混合液，再加1µL模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发,然后稍离心。

〔3〕将PCR管放到PCR热循环仪中，按以下程序开始循环：

94℃4min（预变性）94℃30sec,60℃30sec,72℃2min72℃7min

35个循环

〔4〕注意事项

由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。

a.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。

b.操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。

c.每加一种反应物，应换新的枪头。

3．PCR产物的检测：

琼脂糖浓度〔1.2%〕；EB浓度〔5µl/100mlTBE〕

〔1〕制胶〔以150mL为例〕

a.称取1.8g琼脂糖，加入150ml的TBE缓冲液〔〕，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。

b.电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量;

c.用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖〔约50℃〕，倒入其中，直至厚度为4～6mm〔如有气泡要把气泡赶出〕，在室温下冷却凝固（约30~45min）；

d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。

〔2〕点样

a.将2.0µl溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；

b.每孔点样10.0µl，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。

〔3〕电泳

打开电源开关，调节电压至3~5V/cm（约100V），可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。

〔4〕染色

将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中,染色15-20分钟。

〔5〕观察

将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。

如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

〔6〕注意事项

a.煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。

b.煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的时机。

c.倒胶注意厚度〔4-6mm〕，充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。

也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。

d.加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。

e.一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。

凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。

思考题：

1．PCR反应液中主要成分是哪些？

在PCR反应过程中各起什么作用？

2．为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？

3．用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

实验三植物总RNA的提取

一、实验目的

通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法

二、实验原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。

高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸别离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。

细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

三、仪器、药品与试剂配方

（一）仪器

1．低温离心机

2．分光光度计

3．琼脂糖胶电泳系统，用前先用1%NaOH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸泡冲洗。

4．高压灭菌锅

5．研钵、剪刀、一次性手套等

（二）药品

1.焦碳酸二乙酯（DEPC）

2.吗啉代丙烷磺酸（MOPS）

3.异硫氰酸胍

4.醋酸钠（NaAc）

5.氯仿

6.苯酚

7.甲醛

8.乙醇

9.乙二胺四乙酸（EDTA）

10.琼脂糖

11.异丙醇

（三）试剂配方

1．0.1%DEPC水

1.1mlDEPC加入100ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。

2.2mol/LNaAc、0.5mol/LEDTA、4mol/L异硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。

3.5ΧMOPS电泳缓冲液（pH7.0）

MOPS0.1mol/L

NaAc40mmol/L

EDTA5mmol/L

四、实验步骤

（一）总RNA的提取〔方案一〕

1.实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2g幼叶。

放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10mL离心管。

加入

4mol/L异硫氰酸胍4mL

苯酚3mL

2mol/LNaAc（pH4.8）0.3mL

氯仿0.6mL

混匀，冰浴放置30min。

2.4℃，8000r/min，离心13min。

3.弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。

4.加入2倍体积无水乙醇，-70℃，0.5h。

5.4℃，8000r/min，离心13min。

6.弃上清，在沉淀中加入1mL4mol/LLiCl，使其溶解。

7.移入1.5mL离心管中，冰浴2h。

8.4℃，13000r/min，离心15min。

9.弃上清，在沉淀中加入400uLDEPC水，再加入400uL氯仿，混匀。

10.4℃，13000r/min，离心6min。

11.取上清,并加入1/10体积3mol/LNaAc〔〕，2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min。

12.4℃，13000r/min，离心20min。

13.将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。

14.将沉淀RNA室温下稍干燥。

15.加30uLDEPC水溶解，-70℃保存。

（二）总RNA的提取〔方案二〕

利用TRIzol提取液抽提RNA，具体步骤如下：

1.取幼叶约250mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5ml离心管；

2.加入1mlTRIZOL提取液震荡摇匀；

3.室温放置5min后，加入0.5ml的氯仿，剧烈摇动离心管5min；

4.在8℃条件下，12000rpm离心15min；

5.溶液分为两层，下层为酚－氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管，加入0.5ml异丙醇在15~30℃条件下，沉淀10min；

6.然后在,2~8℃条件下，12000rpm离心10min，RNA沉淀管壁和底部；

7.去掉液体部分，加入1ml75%酒精洗2次；

8.风干后，加入25µlDEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80℃冰箱备用。

〔三〕甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA

1．配制1.2%变性琼脂糖凝胶（40mL）

称取0.48g,加入DEPC水25.2mL,5X电泳缓冲液4mL,加热使溶解，稍冷却加入甲醛3.4mL,混匀，室温凝固0.5-1h.

2.RNA电泳检测样品制备

RNA

2μl

甲醛

2.5μl

甲酰胺

7.5μl

10×MOPS

2μl

RNALoadingBuffer

2μl

灭菌的DEPC水

4μl

混合液轻轻混匀并离心，放于65℃下温育5min后，置于冰上。

3.电泳检测

将1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1×MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约1mm。

将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5V/cm条件下电泳30min，然后在EB中染色15-20min，在紫外灯下观察提取的RNA的质量。

五、注意事项

1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。

2．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。

思考题：

1.实验中所用到的各试剂的作用是什么?

焦碳酸二乙酯（DEPC）,吗啉代丙烷磺酸（MOPS）,异硫氰酸胍,醋酸钠（NaAc）,氯仿,

苯酚,甲醛,乙醇,乙二胺四乙酸（EDTA）,异丙醇

动植物组织mRNA提取实验方法

一、材料

　　水稻叶片或小鼠肝组织。

　　二、设备

　　研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

　　三、试剂

　　1、无RNA酶灭菌水：

用将高温烘烤的玻璃瓶〔180℃2小时〕装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC〔体积/体积〕，处理过夜后高压灭菌。

　　2、75%乙醇：

用DEPC处理水配制75%乙醇，〔用高温灭菌器皿配制〕，然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

　　3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/LTris·Cl（pH7.6），0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA（pH8.0），0.1%SDS。

　　4、洗脱缓冲液：

10mmol/LTris·Cl（pH7.6），1mmol/LEDTA（pH8.0），0.05%SDS。

　　四、操作步骤

　　〔一〕动植物总RNA提取-Trizol法

　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。

用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。

RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly（A）+别离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

　　1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

　　2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

　　3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

　　4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

　　5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。

然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。

RNA可进行mRNA别离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

　　[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

　　2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

　　〔二〕mRNA提取oligo（dT）纤维素。

　　2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

　　3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

　　4、将〔一〕中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

　　5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

　　6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。

　　7、加入1/10体积的3MNaAc（pH5.2），2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

　　8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

　　9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

　　10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成〔或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃〕。

　　[注意]1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

　　2、oligo（dT）纤维素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠〔NaN3）冰箱保存，重复使用。

每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

RNA提取流程

RNA〔totalRNA〕和信使RNA（mRNA）的抽提

RNA的提取

RNA和无RNA酶的环境

原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA,信使RNA（mRNA）,核糖体RNA（rRNA）,转运RNA（tRNA）.而真核生物则能产生四种,还有一种为真核生物所持有的小RNA.mRNA是由基因转录而来的,它运送编码蛋白所需的信息.由于mRNA代表了基因表达的水平,因此mRNA的别离,定量和检测极为重要.

应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍.RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中.由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA,因此,RNA的别离通常是决定实验结果质量的第一步,也是关键的一步.

提取RNA过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤

RNA别离的实用方法既有简单直接的方法（如别离rRNA和tRNA）,也有困难和涉及复杂步骤的方法（如别离mRNA）.在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用,它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量,或用于RNA的生化研究,处理RNA样品时必需仔细小心,其程度取决于样品的用途和来源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏,固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要.

方案:

工作区域应与进行普通微生物实验的区域别离好,特别是那些用于细菌接种,培养基和试剂配制的区域,那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.

如有可能,使用标有"无RNA酶"的商品试管,吸头,溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶,

3）双蒸水（ddH2O）和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC（焦碳酸二乙酯）进行处理:

每100mL溶液或水中加入0.1mLDEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.

4）用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶.

5）别离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300℃烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理.

从组织中提取RNA则要注意:

动物器官的解剖器械

存放组织块的玻璃器皿

冻存组织块所用的器皿

组织器官的冲洗液

人汗含有RNA酶,故在所有步骤中均应戴手套并经常更换.

一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶.因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施.

别离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整.rRNA（18s和28s）条带模糊可能说明由RNA酶引起的RNA的降解.

一步法别离RNA

应用

从组织或细胞中别离细胞的总RNA

从液体样品中别离RNA

TRIREAGENT（Tripure）是一种用于RNA别离的商品溶液.该法源于chomc-zynski的RNA别离一步法.它更便于使用并且结果更加可靠.对于来源有限的样品,我们推荐使用这种试剂.这种试剂能从同一样品中同时别离RNA,DNA,蛋白质.

方案.

用lmLTripure/50-100mg（组织）匀浆组织样品.对于细胞,每10cm2面积（贴壁的单层细胞）或每106个细胞（细胞沉淀）使用1mL.将样品转至1.5mLEP管中.（-70℃可保存1月）

室温下放置样品5min.每1mLTripure中加入0.2mL氯仿并摇动15s,置于室温下2—15min.

4℃下12000g离心15min.

将水相（上部）转至一个新EP管.每1mLTripure加入0.5mL异丙醇沉淀RNA.将样品置于室温下5—10min.

4℃,12000g离心10min.凝胶样沉淀物为RNA.

吸出上清并用1mL75%乙醇在涡旋振荡器上洗涤RNA沉淀一次,