伴有69染色体易位急性髓系白血病患者DEKCAN融合基因表达分析.docx
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伴有69染色体易位急性髓系白血病患者DEKCAN融合基因表达分析
伴有6;9染色体易位急性髓系白血病患者DEK-CAN融合基因表达分析
汪亚伦,王彤,许凤,冮岩,王杰
【摘要】本研究旨在探讨急性髓系白血病(AML)患者6;9染色体易位与DEK-CAN融合基因表达之间的关系及临床意义。
患者骨髓细胞短时间培育后按常规方式制备染色体,采纳R显带技术进行染色体核型分析。
用逆转录巢式聚合酶链反映(RT-nest-PCR)对4例AML患者的骨髓或外周血单个核细胞DEK-CAN融合基因表达进行了分析,并对其中3例行异体骨髓移植(allo-BMT)患者进行动态随访。
结果说明:
4例急性髓系白血病患者为t(6;9)(p23;q34)易位;4例初诊、再发及完全减缓期患者均不同程度检出DEK-CAN融合基因,占100%;其中初诊、再发期表达明显增强,完全减缓期减弱;3例患者allo-BMT后1-24个月均表达DEK-CANmRNA。
临床资料显示4例AML患者中2例于CR后1-24个月复发(其中1例同意异体骨髓移植)、死亡,其余2例完全减缓,在医治中前后同意异体骨髓移植,现仍然生存。
结论:
DEK-CAN基因是AML发病的分子基础,检测DEK-CAN融合基因关于AML的诊断、疗效观看及预后判定有重要意义。
【关键词】急性髓系白血病
AnalysisofDEK-CANFusionGeneExpressioninAcuteMyeloidLeukemiaPatientswith6;9ChromosomeTranslocation
AbstractThisstudywasaimedtoexploretherelationshipof6;9chromosometranslocationwithDEK-CANfusiongeneexpressioninpatientswithacutemyeloidleukemia(AML)anditsclinicalsignificance.Chromosomespecimenswerepreparedbyroutinemethodaftershort-termcultureofbonemarrowcells;karyotypeanalysiswasperformedbyRbandingtechnique;theexpressionoffusiongeneDEK-CANwasanalyzedbyRT-nested-PCRinmononuclearcellsofbonemarroworperipheralbloodof4AMLpatients,for3patientsreceivedallo-BMToutof4patientsthedynamicfollow-upwasresultsindicatedthatt(6;9)(p23;q34)wasconfirmedbychromosomekaryotypeanalysisinthefourAMLDEK-CANfusiongenewasfoundduringinallfourdenovo,relapsedandCRpatients(100%).AndtheexpressionofDEK-CANfusiongeneenhancedapparentlyindenovoandrelapsedpatients,andweakenedinCRmRNAwasfoundinthethreepatientsduring1-24monthsafterdatashowed2patientsrelapsedanddiedafterCRfor1-24months;theothertwopatientsreceivedallo-BMTgotCRandstillisconcludedthatDEK-CANfusiongeneisthemolecularbasisinpathogenesisofdetectionofDEK-CANfusiongeneissignificantfordiagnosisofAML,evaluationofcurativeeffect,andpredicationofprognosis.
KeywordsAML;6;9translocation;DEK-CANfusiongene
t(6;9)(p23;q34)是造血系统罕有的随机染色体异样,国外文献中只有为数很少的病例记载[1-4],国内尚无报导。
该染色体易位要紧见于急性髓系白血病和骨髓增生异样综合症(MDS),患者多见于年轻人,预后不良[1,2]。
另外,由于染色体易位,6号染色体上的DEK基因与9号染色体上的CAN基因结合形成DEK-CAN融合蛋白[5]。
该蛋白与白血病的发生有紧密关系。
咱们曾报导了采纳常规细胞遗传学和巢式PCR技术,成功检出1例急性粒-单细胞白血病(AMMOL,FAB分型M4)患者具有t(9;12)(q22;p13)易位并存在有DEK-CAN融合基因[6]。
本次咱们利用巢式PCR技术对4例新发觉的伴有该染色体异样的AML患者DEK-CAN融合基因的表达进行了研究,以探讨其在恶性血液病发病中的作用。
材料和方式
病例
4例急性髓系白血病患者均为日本东京大学附属医院收治的初发病例,其中男2例,女2例,年龄别离为6,13,14,39岁。
临床诊断依照患者的临床表现、血常规、骨髓象和细胞化学检测结果并参照免疫分型结果确信,其中急性髓系白血病M23例,急性粒-单核细胞白血病M41例。
4例患者均依照高危方案化疗,完全减缓(CR)后,交替利用中剂量阿糖胞苷、鬼臼乙又甙(VP16)或米托蒽醌等药物巩固强化医治。
经医治后2例死亡,2例存活中。
死亡患者中1例给予ATRA+As2O3医治后获完全减缓,但13个月后血象、骨髓显示复发,同意异体骨髓移植,3个月后死亡,活存期30个月;另外1例CR后1-3个月后2次复发,医治中死亡,活存期16个月。
2例活存的患者中,1在确例诊5个月后同意异体骨髓移植并结合化疗,在术后3个月和5个月复查血象,骨髓为完全减缓状态,己生存5个月。
另1例化疗后2次复查为完全减缓,医治7个月后同意异体骨髓移植,现已生存12个月,临床资料见附表。
染色体核型分析
医治前抽取骨髓标本,采纳短时间培育法制备染色体标本,应用R显带技术进行核型分析[7]。
每例至少分析20个中期细胞:
核型异样按“人类染色体同际命名体制(ISCN1995)”进行识别和描述。
DEK-CAN融合基因的检测
采纳巢式RT-PCR方式检测。
引物
PCR引物设计见图1。
第一轮PCR反映引物DEK-1和CAN-1的序列别离为5′-CCTACAGATGAAGAGTTAA-3′和5′-TCTTCCTCTGTTGGTTGATG-3′。
第二轮PCR反映引物DEK-2和CAN-2的序列别离为5′-GGCCAGTGCTAACTTGG-3′和5′-GTGTCTCTCGCTCTGG-3′。
RNA提取
取患者骨髓血1ml,淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂产品)分离单个核细胞,依照TRIzoL产品说明书进行总mRNA提取[8]。
抽提的RNA用DEPC水溶解,实验选用样本为经紫外分光光度计测定其RNA溶液A260/280>,且经RNA酶消化以后在1%琼脂糖凝胶上进行电泳,在紫外灯下观看未发觉有RNA及其它条带存在。
-20℃保留备用。
逆转录反映
依照MMLV逆转录酶产品说明书,将细胞总RNA逆转录为cDNA。
标本总RNA2μg,6核苷酸随机引物100ng,加DEPC处置水至20μl,72℃变性5分钟,另加5×合成第一链缓冲液8μl,10mmol/LdNTP1μl,RNA酶抑制剂RNasin50U,AMVRTase10U,总反转录体系40μl,37℃反映60分钟,4℃保留。
PCR反映
50μl反映体系,第1轮PCR反映30个循环(95℃预变性5分钟,94℃变性60秒,56℃退火60秒,72℃延伸90秒)。
第2轮PCR反映25个循环(95℃预变性5分钟,94℃变性60秒,50℃退火45秒,72℃延伸2分钟),最后72℃10分钟终止反映。
andlaboratorydataofAMLpatientswitht(6;9)chromosometranslocation(略)
电泳取PCR产物13μl,加溴化乙锭2μl,于2%琼脂糖凝胶上电泳20分钟,PBR322(HindⅢ)作为标志物,用紫外投射仪分析图像并照相。
结果
染色体核型
对4例AML进行了染色体核型分析,20个中期割裂相的所有细胞均显示t(6;9)(p23;q34)染色体异样(图2)。
DEK-CANmRNA的转变
第2次PCR扩增产物电泳时在268bp有特异条带,表达CANmRNA,在182bp有特异条带为DEKmRNA,4例初发或常规医治AML患者中,DEK-CAN融合基因检测结果均呈阳性,阳性率为100%(图3)。
3例进行allo-BMT患者,在初诊后1-14个月用巢式RT-PCR分析动态转变。
以病例3为例,初诊及复发期DEK-CANmRNA表达明显增强,完全减缓期时减弱(图4)。
讨论
血液系统恶性疾病病程中,常显现某种非随机性染色体异样,这些染色体的彼此易位大部份与恶性血液疾病的某一组织学或免疫学亚型或与特异的临床特点相联系,可能在人类白血病的发病机理中起着关键作用。
染色体易位t(6;9)(p23;q34)是造血系统罕有的随机染色体异样,国外文献中只有为数不多的病例记载,国内尚无报导。
Shapira等[9]报导,该染色体易位要紧发生于AML(M1,M2或M4)中,发生率为%-4%。
因此,t(6;9)与AML之间有着紧密相关性。
据报导,在骨髓增生异样综合征(MDS)RAEB型亦可发觉t(6;9)易位[9]。
多数报导显示,AML血液学的特点要紧表现为初诊时骨髓中嗜碱细胞增加[10],但也有一些未见增加的报导,在咱们的4例患者中均未见嗜碱细胞增加。
随着急性白血病化疗方案的改善和造血干细胞移植技术的进展,急性白血病的完全减缓(CR)率明显提高。
但是仍有许多CR患者在数年内复发,其要紧缘故是血液学CR后体内仍残留l06-109白血病细胞,称为微小残留病(MRD)。
有学者以为,MRD是血液学CR乃至持续完全减缓(CCR)期间白血病复发的本源[11]。
RT-nested-PCR方式关于检测AML残留白细胞是一种相当灵敏和靠得住的方式。
据文献报导灵敏度可高达106-107水平,比染色体技术加倍灵敏[12]。
在预实验中咱们利用RT-nested-PCR扩增试探了染色体t(6;9)易位的最低检出值。
结果显示样本中提取的总mRNA稀释至10pg,仍能够检测到DEK-CANmRNA(结果未发表)。
总之,由于PCR能够扩增小于l0pg的基因总mRNA,从而大大提高了检测的灵敏性,可使白血病微小残留疾病的初期诊断成为可能。
咱们在4例患者中成功检测到DEK-CAN融合基因,说明RT-nested-PCR方式能够检出白血病患者常见的染色体畸变产生的融合基因,它能够用于AML患者CR后微小残留病变(MRD)的检测。
t(6;9)(p23;q34)易位AML患者除必要的化疗之外,是不是需要同时进行骨髓移植或外周血干细胞移植的报导很少,医治上尚无定论[13]。
但从单纯化疗的医治成效不良来看,在第1次完全减缓期后,骨髓移植也应看成为一个重要的医治手腕。
最近几年来,分子生物学研究发觉的癌基因在染色体上定位使肿瘤发病机制研究有了一些进展。
研究发觉,t(6;9)易位为6号染色体上的DEK基因与9号染色体上的CAN基因交互易位所致,6p23上的DEK基因为40kb,而9号染色体上的基因超过130kb[14]。
对17例伴t(6;9)的病例分析显示,断裂点别离集中于DEK基因1个特异的9kb内含子(introncontainingbreakpointsonchromosome6,称icb-6)和CAN基因的1个kb的内含子(称ich-9)中[15]。
由于染色体易位,产生的DEK-CAN融合基因可能在伴有t(6;9)易位的AML的发病机制中扮演一个重要的角色。
本实验中,咱们应用巢式RT-PCR方式检测了4例伴有t(6;9)(p23;q34)染色体易位的急性髓系白血病患者DEK-CAN融合基因的表达,发觉DEK-CAN融合基因不仅存在于初发期,在医治后的完全减缓期也有表达。
目前所有相关研究均显示,初发期及完全减缓期伴有DEK-CAN融合基因表达的急性白血病患者对医治反映差,患者生存期短,预后极差,再发后死亡为100%。
咱们的4例中2例复发后均在短时间内死亡,与文献一致,说明DEK-CAN融合基因可作为患者预后判定的重要参考指标。
染色体易位是恶性肿瘤最多见的分子遗传学改变,最近几年的研究令人们对染色体易位与肿瘤的发生的关系有了更深人的熟悉。
一方面,染色体易位可使原癌基因异样表达;另一方面,染色体易位使易位后相邻基因融合形成新的融合基因。
尽管融合基因在恶性肿瘤发生中的作用和机制尚未完全清楚,但很多学者以为,融合基因的形成及其表达产物可能是某些恶性肿瘤发生的重要缘故。
目前已发觉很多血液系统和软组织恶性肿瘤可形成肿瘤特异的融合基因。
尽管t(6;9)(p23;q34)的分子生物学研究取得了重大进展,但尚不完全清楚DEK-CAN融合基因对肿瘤发生行为有如何的生物学阻碍,和编码的蛋白在AML发生进程中发挥何种作用,这些都有待于进一步研究。
相信t(6;9)(p23;q34)染色体易位机制的研究将为说明白血病发病机制及最终攻克癌肿奠定基础。
【参考文献】
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