活性氧在血管紧张素Ⅱ诱导ECV304细胞增殖中的作用.docx
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活性氧在血管紧张素Ⅱ诱导ECV304细胞增殖中的作用
活性氧在血管紧张素Ⅱ诱导ECV304细胞增殖中的作用
【摘要】目的探讨活性氧在血管紧张素Ⅱ诱导ECV304细胞增殖中的作用。
方法体外培养人脐静脉内皮细胞株(ECV304),实验分为AngⅡ处理组、NAC干预组和正常对照组。
采用改良MTT法、Fenton反应和硝酸酶还原法分别观察AngⅡ处理组、NAC干预组和正常对照组的ECV304细胞的增殖率和细胞产生ROS(·OH)的量。
结果一定浓度的AngⅡ(~1μmol/L)作用12h时ECV304细胞增殖率增加,明显高于正常对照组();AngⅡ可诱导ECV304细胞产生ROS(·OH),ROS(·OH)的含量与ECV304细胞增殖率呈显着负相关;10mmol/LNAC可抑制1μmol/LAngⅡ对ECV304细胞的增殖作用,与正常对照组相比差异无显着性()。
结论AngⅡ可诱导ECV304细胞产生ROS(·OH),ROS(·OH)含量与AngⅡ呈时间和剂量依赖性;NAC可抑制AngⅡ对ECV304细胞的增殖作用,这可能与减少ROS(·OH)的含量有关;ROS(·OH)可能是AngⅡ诱导的ECV304细胞增殖的主要信号转导分子之一。
【关键词】N-乙酰半胱氨酸血管紧张素Ⅱ活性氧ECV304细胞增殖
【Abstract】ObjectiveToexploretheroleofreactiveoxygenspeciesintheproliferationofECV304inducedbyAngⅡ.MethodsThelinesofhumanumbilicalveinendothelialcell(ECV304)culturedinvivoweredividedintothreegroupswhichweretreatedbyAngⅡ,AngⅡ+N-acetyl-L-cysteine(NAC),andnormalculture weobservedtheproliferouseffectofECV304inducedbyAngⅡatdifferentconcentrationwithimprovedMTTand thecontentsofROS(·OH)inthreegroupsweredetectedby ECV304incubatedwithAngⅡ(~1μmol/L)for12hoursincreasetheproliferationrate(vscontrolgroup);ItissignificantthatthenegativecorrelationbetweenproliferationrateandthecontentofROS(·OH);NAC(10mmol/L)caninhibittheproliferationofECV304inducedbyAngⅡ(vscontrolgroup).ConclusionECV304inducedbyAngⅡcanproduceROS(·OH),andthecontentsofROS(·OH)increasewiththeprolongationoftimeandtheenlargementofdose;AntioxidantNACcaninhibittheproliferationofECV304inducedbyAngⅡ,thiseffectmayberelatedwithreducingthecontentofROS(·OH);ROS(·OH)maybeoneofthemajormoclecularswhichplayanimportantroleinthesignaltransductionofECV304proliferation.
【Keywords】NACAngⅡROSECV304proliferation
血管内皮是心血管疾病危险因子的靶点,其功能障碍构成许多心血管疾病的病理基础。
目前认为血管自稳态的调节取决于血管内皮自身的氧化还原状态[1,2]。
大量研究表明,氧化应激产生的各种活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)对血管内皮具有细胞毒性作用,是许多心血管疾病发生的重要机制[3,4]。
然而,新近文献报道氧化应激产生的ROS在一定量时,可作为血管内皮信号转导分子,参与调节细胞功能[5]。
本研究以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为血管氧化应激的诱导剂,观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对人脐静脉内皮细胞株(ECV304)增殖作用的影响,探讨活性氧在血管紧张素Ⅱ诱导ECV304细胞增殖中的作用,为心血管疾病的防治提供新的理论依据,启示新药研发和应用的新途径。
1材料与方法
材料ECV304(人脐静脉内皮细胞株)购自中国科学院上海药物研究所;AngⅡ、NAC和MTT(批号9710)购自Sigma公司;特级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所(批号20020114);·OH测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号20030625)。
方法
实验分组
(1)AngⅡ处理组:
a.不同作用时间(4h、12h和24h);b.不同浓度(AngⅡ终浓度分别为,μmol/L、μmol/L、μmol/L、μmol/L、μmol/L和1μmol/L);
(2)NAC干预组:
AngⅡ1μmol/L+NAC10mmol/L;(3)正常对照组:
加入等量完全培养基。
ECV304细胞传代培养ECV304细胞在含20%小牛血清的RPMI1640完全培养基中,37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中培养。
台盼蓝染色后计算细胞存活率(Via=99%),调整细胞悬液浓度为1×106个细胞/ml备用。
改良MTT法测定ECV304细胞增殖率将备用的细胞悬液接种于96孔板,90μl/孔,每组设4个复孔。
4h细胞完全贴壁后加入受试药物,10μl/孔(倍比稀释AngⅡ,使其终浓度为1μmol/L、μmol/L、μmol/L、μmol/L、μmol/L和μmol/L)。
置于培养箱中分别培养4h、12h和24h,之后每孔加入MTT液(5mg/ml)10μl,4h后分别在每孔加入三联液[10%十二烷基硫酸钠-5%异丁醇-/L盐酸(w/v/v)]100μl/孔,置于培养箱中12h后,用EL340酶联免疫仪在570nm单波长下测定每孔的OD值。
细胞增殖率(%)=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%
ECV304细胞光镜形态学观察分别用含有AngⅡ(浓度分别为、1μmol/L)、NAC(1μmol/LAngⅡ+10mmol/LNAC)的培养基和完全培养基培养,12h后置倒置显微镜下观察细胞形态学变化。
ECV304细胞内·OH含量测定将上述所得的细胞悬液与不同浓度的AngⅡ分别共同培养12h和24h,应用检测试剂盒,按试剂盒说明书进行操作。
统计学处理应用软件包进行分析,分别对各个实验组进行单因素方差分析,当时,进一步作任一两均数的比较用q检验;对不同时间(12h和24h)的ROS(·OH)含量相比进行配对t检验;对ROS(·OH)的含量与ECV304细胞增殖率的关系进行相关分析,结果用均数±标准差(x±s)表示,以判定为差异有显着性。
2结果
AngⅡ对ECV304细胞增殖作用的影响不同浓度的AngⅡ作用ECV304细胞4h时,细胞增殖不明显,与正常对照组相比差异无显着性();作用时间为12h时,不同浓度AngⅡ(~1μmol/L)均可促细胞增殖,与正常对照组相比差异有显着性(),μmol/LAngⅡ促细胞增殖率达到最大,随AngⅡ浓度的增大,细胞增殖率反而逐渐减小;作用时间为24h时,细胞呈负增殖,随AngⅡ浓度的增大,增殖率逐渐降低。
AngⅡ作用细胞12h时,与相同浓度组作用时间4h相比,细胞增殖率差异有显着性(),见表1。
表1AngⅡ在不同时间对ECV304细胞增殖作用的影响(x±s)
注:
与正常对照组相比,▲;与4h相同浓度组相比,*
NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞增殖的抑制作用与AngⅡ处理组相比细胞增殖率差异有显着性(),10mmol/LNAC可抑制1μmol/LAngⅡ对ECV304细胞的增殖作用,而与正常对照组相比差异无显着性(),见表2。
表2NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞增殖的抑制作用(x±s)
注:
AngⅡ处理组:
AngⅡ浓度为1μmol/L;NAC干预组:
1μmol/LAngⅡ+10mmol/LNAC与AngⅡ处理组相比,**
AngⅡ对ECV304细胞形态学变化的影响正常对照组培养的ECV304细胞,4h后大部分细胞贴壁。
早期细胞呈小多角,球形,少数细胞伸展,12h时,细胞逐渐生长呈梭形,有些细胞鱼贯状相连。
μmol/LAngⅡ作用ECV304细胞12h后,可诱导细胞增殖,核清晰,呈圆形或椭圆形,核分裂象多见,胞浆丰富,内含小颗粒,细胞呈单层铺路石状排列。
1μmol/LAngⅡ作用ECV304细胞12h后,核分裂象减少,部分细胞变圆,贴壁力减弱甚至消
失。
NAC干预组培养的ECV304细胞,核分裂象不明显,细胞生长与正常对照组相当。
NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞·OH含量的抑制作用不同浓度的AngⅡ作用于ECV304细胞12h时,AngⅡ作用ECV304细胞产生·OH的含量与AngⅡ呈剂量和时间依赖性,随着浓度的增大和时间的延长,ECV304细胞的·OH含量逐渐增加,与正常对照组相比差异有显着性()。
相同浓度AngⅡ作用12h与24h时·OH含量相比,差异有显着性()。
NAC干预组与AngⅡ处理组的·OH含量相比,差异有显着性(),而与正常对照组相比差异无显着性(),见表3、4。
表3AngⅡ对ECV304细胞·OH含量的影响(x±s)注:
与正常对照组相比,▲;与24h相同浓度组相比,*
表4NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞·OH含量的抑制作用(x±s)
注:
AngⅡ处理组:
AngⅡ浓度为1μmol/L;NAC干预组:
1μmol/LAngⅡ+10mmol/LNAC与AngⅡ处理组相比,△
ECV304细胞的·OH含量与细胞增殖率关系的评价不同浓度AngⅡ(~1μmol/L)作用于ECV304细胞12h时,·OH的含量与细胞增殖率呈显着负相关(r=-,P=),见图1。
图1ECV304细胞·OH含量与细胞增殖率的相关性
3讨论
血管内皮细胞发生氧化应激反应,在其特定的组织位点上氧化作用和抗氧化作用的平衡失调,蓄积产生ROS;AngⅡ被认为是血管氧化应激的主要诱导剂,可通过NADPH氧化还原酶诱导血管内皮细胞产生O2-,经自由基链反应,产生·OH[6,7]。
新近文献报道氧化应激产生的ROS在一定量时,可作为血管内皮信号转导分子,参与调节细胞功能[5]。
研究表明,AngⅡ可诱导血管平滑肌细胞产生内源性ROS引起细胞增殖,在心血管疾病的发生发展中具有重要作用[8]。
但AngⅡ是否通过一定的氧化还原敏感信号转导途径促进血管内皮细胞增殖,以前的研究尚未证实。
本实验结果发现:
不同浓度的AngⅡ作用ECV304细胞4h时,细胞增殖不明显;作用时间为12h时,不同浓度AngⅡ(~1μmol/L)均可促细胞增殖,μmol/LAngⅡ促细胞增殖率达到最大,随AngⅡ浓度的增大,细胞增殖率反而逐渐减小;作用时间为24h时,细胞呈负增殖。
在AngⅡ诱导血管内皮细胞增殖过程中,伴随有ROS(·OH)含量的变化,并且与内皮细胞的增殖率呈显着负相关。
结果表明,AngⅡ是ECV304细胞氧化应激产生ROS(·OH)的诱导剂,可诱导ECV304细胞产生ROS(·OH),ROS(·OH)含量与AngⅡ呈时间和剂量依赖性,一定量的ROS(·OH)有促进细胞增殖作用,随着ROS(·OH)含量的增多,细胞呈负增殖,提示ROS(·OH)在调控细胞增殖中起重要作用。
NAC常被用于研究自由基在体内外的生物化学作用。
NAC对细胞具有抗氧化保护作用[9,10]。
本研究结果发现,抗氧化剂NAC明显减少AngⅡ诱导的ECV304细胞产生的ROS(·OH)含量,并且明显抑制AngⅡ诱导的ECV304细胞增殖。
这提示ROS(·OH)可能是AngⅡ诱导的ECV304细胞增殖的主要信号转导分子之一。
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