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蛋白芯片抗体检测及RTPCR技术研究不同HCV感染人群的解析
【文章编号】1672-3619(2005)06一0747-03
蛋白芯片、抗体检测及I汀.PCR技术研究不同
HCV感染人群的病原学差异
舒欣,李
刚,代志琰,陈伟,姚集鲁
(中山大学附属第三医院感染病科,广州510630)
・747・
・论著・
【摘要】目的采用多种不同的检测方法探讨静脉吸毒人群与非静脉吸毒人群中丙型肝炎病原学的差异。
方法89份静脉吸毒人员血清及40份非静脉吸毒HCV感染者血清分别应用分片段蛋白质芯片、酶联免疫吸
附试验(EusA)及荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT.PcR)进行检测丙型肝炎病毒(Hcv)抗体及RNA,比较两种不同人群中HcV感染的病原学差异及三种检测方法在以上两种样本中检测结果的差异。
结果
在静脉吸毒
人群中HcV感染率为88.76%(79/89),感染者血清HCVRNA载量较非吸毒HCv感染者血清HcvRNA载量高,前者为1×10t”拷贝/毫升,后者为1×1舻”拷贝/毫升(t=1.986,P-0.049)。
应用HcV分片段蛋白芯片技术检
测的敏感性为98.23%。
结论静脉吸毒人群中HcV感染率较高,感染者中血清HcvRNA载量较非静脉吸毒
者高。
研究显示,蛋白芯片技术是一种高效的检测技术,具有临床应用价值。
【关键词】丙型肝炎;静脉吸毒者;蛋白芯片
中图分类号:
R512.63
文献标识码:
A
Study
on
theDifferentHCVInfectionGroupsbyProteinClIips,ELISA
andRT.PCR
SHUXin,UGang,DAIZhi—yan,CHENWei,YAOJi—lu
(Dep们撇眦旷删备c踟凇D括e傩es,£矗e3耐A历Zi以ed日。
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【Abs灯act】
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RT—PCR.
Method
The
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non-injectiondmgs
users
were
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polymerasechainreaction(RT—PCR)usingestablishedprimersforHCV,enzymelinkediIImluosorbentassay(EuSA)for
HCV-Abandproteinchipforpeptide
antibodyforHCV.Itesulb
HCVinfectionwas
detectedin88.76%(79,89),the
sera
dowIlload
ofHCV-RNAiIl山e
injection
drugs
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HCVis
highertllan
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copys/lIll柚d1×102省copy,lIll,respectively.111ere
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112
semdetectedposivebypmteincllipforpeptideantibodyforHCVin
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sera
thatwas
detectedpositivebyEUSA.
Conch坞ion
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users
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protein
chipforpeptideaIltibodyforHCVwas
an
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used
clinically.
【Keywords】hepatitiscvinls;proteinchip;injectiondmg
user
近年来.静脉吸毒已成为丙型肝炎传播的一种重要途径,在该人群中有较高的HCV感染率。
本文应用丙肝病毒分片段蛋白质芯片、EuSA及荧光定量RT—PCR三种不同方法检测静脉吸毒人员中HCV的抗体及RNA状况.并与非静脉吸毒
作者简介:
舒欣(1972~),男,主治医师,在读博士生,研
究方向为病毒性肝炎.导致师为姚集鲁教授。
HCV感染者进行比较.探讨两种人群HCV感染者中HCV病原学差异、三种检测方法检测HCV的差异及蛋白芯片技术的临床应用价值。
1材料与方法
1.1
研究对象
2005年1月在广东省某强制戒毒所的静脉吸
毒人员89例,其中男性82例,女性7例,平均年
万方数据
・748・
龄30岁(20~47岁),使用毒品期限平均2年(10d~12年):
非静脉吸毒HcV感染者为在我院就诊的患者,其中男性32例,女性8例,平均年龄44岁(29~66岁),均有输血、血浆史。
1.2标本采集与保存
戒毒人员及非静脉吸毒HCV感染者于清晨采空腹静脉血5m1.及时分离血清,一70℃低温冷冻保存待检。
1.3丙型肝炎病毒抗体的检测
采用中山生物工程公司的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒,使用EuSA方法检测,操作按说明书进行。
1.4血清HCV—RNA定量的检测
采用中山大学达安基因公司荧光定量PCR检测试剂盒,操作按说明书进行。
1.5
丙肝病毒分片段蛋白质芯片的检测采用深圳益生堂公司的丙型肝炎分片段抗体
检测蛋白芯片试剂盒,操作按说明书进行。
结果判断:
核心、NS3、NS4、NS5任一片段阳性,则检测结果不能确定,为可疑阳性;两个或两个以上片段抗体阳性,则检测结果为阳性。
1.6统计学分析
采用SPssll.O统计软件进行分析统计,率的比较使用x2检验,均数比较使用t检验。
2
结果
2.1
静脉吸毒人员中HCV感染状况和检测结果分别应用丙肝病毒分片段抗体检测蛋白质芯
片、EuSA及荧光定量PCR进行检测(表1)。
结果显示。
在静脉吸毒人员中抗.HCV阳性79例(88.76%),HCV.RNA阳性57(64.04%)。
而应用丙肝病毒分片段抗体检测蛋白质芯片检测结果示,阳性77例,其中抗一c(+)十抗一Ns3(+)+抗一NS4(+)+抗一NS5(+)59例,抗.C(+)+抗一NS3(+)+抗.NS4(十)13例,抗一C(+)+抗一NS3(+)+抗.Ns5(+)1例,抗.C(+)+抗.NS3(+)2例,抗.C(+)+抗.NS4(+)2例,抗.Ns3(+)+抗.NS4(+)1例,阴性8例,不确定3例。
抗.C阳性1例,抗.NS3阳性1,抗一Ns4阳性l例。
2-2非静脉吸毒HCV感染者的检测结果
结果显示在门诊病人中,抗.HCV阳性为35例,其中18例检测HcVRNA阳性,而应用丙肝病毒分片段抗体检测蛋白质芯片检测结果显示阳性34例,其中其中抗一C(+)+抗一NS3(+)+抗.NS4
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表1静脉吸毒人员中HCV检测结果
Tab.1
TheHCVdetectedr略lll忸iIltheinjectiond11lg
u鼹rs
阳性组合抗.C抗.Ns3抗.NS4抗.NS5抗.HcVHcVIINA
例数(%)
(+)+抗一Ns5(+)20例,抗.C(+)+抗.NS3(+)+抗一NS4(+)9例,抗一c(+)+抗.Ns3(+)4例,抗一Ns3(+)+抗一NS4(+)1例,阴性3例,不确定3例。
抗.c阳性1例,抗一NS3阳性1,抗一NS4阳性l例(表2)。
表2非静脉吸毒HCv感染者的检测结果
Tab.2
The
HCVdetectedr鲻llltsiIIn弛non—inj∞廿on
drIlgu∞r谢tllHCV
阳性组合抗.c抗-Ns3抗.NS4抗.NS5抗-HCV
HcV-RNA
例数(%)
2.3
两组人员HCV感染者HCVRNA检测结果比较
静脉吸毒人群HCV感染者其血清HCV
RNA
阳性率比非静脉吸毒HCV感染者血清HCVRNA阳
性率高(xz=5.277,一0.022),而两组人群感染者中
血清HCVRNA载量比较显示。
静脉吸毒人群HCV感染者中其血清HCvRNA载量较非静脉吸
万方数据
毒HCV感染者高(£=1.986,P_0.049;表3,表4)。
性2例。
表3两组人员HcV感染者HcVRNA阳性率比较
Tab.3
The
HCVRNAiIIthe
two帮伽ps
表4
两组人员HcV感染者血清HCV砌qA载量的比较
Tab.4
,I'he
HCVRNAsemdowIlloadinttletwogroups
2.4三种不同检测方法的比较(表5)
表5三种不同检测方法检测结果比较
Tab.5
Thec蛐lpari∞nofthe3differenttechIIiquesforHCV
阳性组合抗.C抗.NS3抗.NS4抗-NS5抗.HcVHcv.RNA
例数(%)
129份血清中,EUSA检测HCV抗体阳性114例,RT.PCR检测HCVRNA阳性75例,而应用丙肝病毒分片段抗体检测蛋白质芯片检测阳性112例,其中抗.c(+)+抗。
NS3(+)+抗一Ns4(+)+抗一Ns5(+)79例,抗.C(+)十抗。
NS3(+)+抗.Ns4(+)22例.抗.C(+)+抗一NS3(+)+抗一Ns5(+)1例,抗一C(+)+抗.NS3(+)6例,抗.NS3(+)+抗.Ns4(+)2例,抗.C(+)+抗一NS4(+)2例,阴性11例,不确定6例。
抗.C阳性2例,抗.NS3阳性2例,抗一Ns4阳
3讨论
・749・
在以注射方式吸食毒品者中,HCV感染率的报道均有不同。
Botti等[1]报道抗HCV阳性率是
65.5%(80/122),Baozhang等[2】报道抗HCV阳性率
是35.8%(63,176),而在本组静脉吸毒人员中,HCV感染率高达88.76(79/89)。
这说明静脉吸毒人员中由于共用注射器及注射针头是HCV传播的主
要危险因素,而在静脉吸毒人员中感染HCV后其血清Hcv—RNA阳性率较门诊HCV感染者血清HCV—RNA阳性率为高。
而且其血清HcV—RNA载量较门诊HCV感染者高,其原因有可能是因为静脉吸毒人员中感染HCV的时间较短,其平均吸毒时间为2年。
而门诊HCV感染者的感染时间较
长,大部分是在10年以上通过输血或血制品感染。
而是否由于静脉吸毒人员感染HcV后其自身免疫力较低而导致病毒血清载量较高则难以定论。
目前.检测丙肝病毒的方法有检测HCV抗体和检测HCVRNA两类[3|。
由于检测RNA的实验室条件要求比较高,操作复杂,易产生假阳性反应并且价格昂贵。
及对实验人员要求高等原因.限制了其在临床上的广泛应用。
蛋白质芯片是伴随着基因芯片发展起来的一项新技术,已开始应用于多个方面,如蛋白质与蛋白质的相互作用,蛋白质的亚细胞定位,蛋白质的功能等["]。
用丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片试剂盒对114份EuSA法检测为阳性的血清进行检测,112份为阳性(分片段抗体检测结果),2份标本阴性;15份ELISA法检测为阴性的标本,应用蛋白芯片的方法检测,有2份标本阳性。
6份分片段抗体检测蛋白质芯片试剂盒检测可疑阳性标本,应用EuSA法检测2份标本阳性;11份分片段抗体检测蛋白质芯片试剂盒检测阴性标本,应
用EUSA法检测1份标本阳性.而且HCV
RNA
检测结果也确证为阳性。
结果说明丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片对检测具有较好的敏感性及特异性。
应用丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片检测结果显示,以抗一C(+),抗.NS3(+),抗.Ns4(+),抗.NS5(+)组合的阳性率最高,在抗.HcV阳性的血清中其阳性率达到66.4%,而在这些阳性的血清中HCVRNA阳性率达到(下转第770页)
万方数据
・770・
科分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南及头孢他啶两种抗生素耐药率维持在10%以下。
本调查鲍曼不动杆菌对亚胺培南的敏感性还很高,替卡西林/克拉维酸、氨卞西林/舒巴坦及头孢哌酮/舒巴坦等复合药物可提高鲍曼不动杆菌的敏感性,但本调查头孢哌酮/舒巴坦的中介率较国内众多报道高。
综合上述,神经科住院病人发生感染以条件致病菌为主,感染部位以下呼吸道感染为主,是医院感染的高度易感人群。
脑梗塞、脑出血患者以61—70岁年龄段为发病与感染高检出年龄,脑外伤却以31~40岁年龄段最多。
神经科感染菌对常用抗菌药物耐药性较严重,尤其神经外科。
调查发现神经外科使用抗生素较神经内科普遍。
如本院某季统计神经外科使用抗生素的病人达73.3%、神经内科为37.5%。
其中预防用药神经外科是18.2%、神经内科为零,经验用药神经外科达90.9%、神经内科为66.7%,单独用药神经内科73.3%比神经外科59.15高,但联合用药神经内科26.7%比神经外科40.9%低。
另外神经外科多选择如头胞哌酮/舒巴坦、头胞硫脒、头胞曲松、头胞他啶及氧哌嗪/舒巴坦等较高档品种。
广谱、超广谱抗菌药物的大量或不合理使用会导致耐药菌株大量的产生以及出现由耐药菌株引起的感染[】0】,这应是神经外科耐药性较神经内科严重的原因之一。
因此,
』Q坚望堂丛堂Q匹壁塑丛鲴地i塑yQ!
:
兰盟Q:
鱼望塑:
2鲤三对以收治脑梗塞和脑出血、脑外伤为主的脑血管病的神经科,在进行各种医疗接触或治疗过程中尽量减少各种感染的交叉传播及合理使用和防止滥用抗菌药物是遏止细菌耐药性传播和蔓延的重要措施。
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(收稿日期:
2005一05.16;修回日期:
2005.07一06)
(上接第749页)77.2%。
说明这种组合检测阳性在一定程度上可反映病毒复制的水平。
HcV抗体蛋白质芯片检测试剂具有操作简便、样品用量少、结果可量化显示等优点。
该试剂盒使用了生物芯片这一新技术,具有较强的扩充整合能力,是未来诊断试剂的发展方向。
然而,蛋白芯片检测的关键在于将各种抗原、抗体反应的条件统一(因血清中各种抗体的含量不同),如果能在实验中解决这一因素,则可在蛋白芯片上同时检测更多的病原体抗体,充分发挥蛋白芯片的优越性。
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(收稿日期:
2005.07.02;修回日期:
2005.08.16)
万方数据
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