血细胞培养及核型分析.docx
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血细胞培养及核型分析.docx
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血细胞培养及核型分析
人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析
一.实验目的
1.掌握人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体组型的分析方法;
2.了解人类染色体的特征。
二、实验原理
人体的1mL外周血中含有1×106~3×106个小淋巴细胞,它们几乎都处于G0期或G1期,一般情况下不分裂,采用人工离体培养的方法,在培养基中加入,植物血球凝集素(PHA)能刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂,经过短期培养,秋水仙素处理、低渗和固定,就可获得大量的中期有丝分裂细胞。
最后经空气干燥法制片,便可得到质量较好的染色体标本。
核型:
是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
正常细胞的核型能代表个体的核型。
核型模式图,是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来,再按长短、形态等特征排列起来的图像。
组型:
是以模式图的方式表示,它是通过许多细胞染色体的测量取平均值绘制而成,是理想的、模式化的染色体组成,代表一物种染色体组型的特征。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著,所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置不同,可将染色体分为中部着丝粒染色体(m),亚中部着丝粒染色体(sm),亚端部着丝粒染色体(st),端部着丝粒染色体(t)。
对于任何一个染色体的基本形态特征来说,重要的参数有以下3个:
(1)相对长度:
指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍体染色体总长之比,以百分率表示。
相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%
(2)臂指数:
指长臂同短臂的比率。
按Levan的划分标准,臂指数在1.0到1.7之间称中部着丝粒染色体,臂指数在1.7到3.0之间称亚中部着丝粒染色体,臂指数在3.0到7.0之间称亚端部着丝粒染色体,臂指数大于7.0者为端部着丝粒染色体。
臂指数=长臂/短臂(反映着丝粒位置的指数)
(3)着丝粒指数:
指短臂占该染色体长度的比,用百分率表示。
它决定着丝粒的相对位置,按Levan的划分标准,着丝粒指数在50%到37.5%之间称中部着丝粒染色体,着丝粒指数在37.5%到25.0%之间称亚中部着丝粒染色体,着丝粒指数在25.0%到12.5%之间称亚端部着丝粒染色体,着丝粒指数在12.5%到0.0%之间者为端部着丝粒染色体。
着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%
人类体细胞的正常核型是含有23对染色体,共46条。
其中22对是男女共有的常染色体,一对为男女所不同的性染色体,男XY,女XX。
表-1人类染色体组型
群组号
染色体号
形态大小
着丝粒位置
随体
次缢痕
鉴别程度
A
1-3
最大
M
无
常见1号
可鉴定
B
4-5
次大
Sm
无
不易
C
6-12+X
中等
Sm
无
常见9号
难鉴定
D
13-15
中等
St
有
偶见13号
难鉴定
E
16-18
较小
16m,17m和18m
无
常见16号
可鉴定
F
19-20
小
M
无
不易
G
21-22+Y
最小
st
有、Y无
难鉴定
三、实验材料、试剂、仪器和方法:
1、实验材料:
人外周静脉血(男女)
2、实验试剂:
完全RPMI-1460培养基(含双抗和小牛血清)、植物血球凝集素(PHA):
每毫升培养液加入100—200ugPHA粉剂、秋水仙素:
50ug/ml、低渗溶液:
0.075mol/L氯化钾、Carnoy固定液:
酒精:
冰醋酸=3:
1(现配现用)、姬姆萨染液、磷酸缓冲液(PH6.8)
3、实验仪器:
细胞培养瓶、超净工作台、37℃恒温培养箱、高压灭菌锅、酒精灯、橡皮瓶塞、75%酒精棉球、移液枪、记号笔、离心机、37℃恒温水浴锅、尖底刻度离心管:
常用的容量为15ml、吸管、橡皮头、量筒、试剂瓶、载玻片、试管架、手术镊子、标本片架。
四、实验方法:
1 血样本的采集
在医院作静脉穿刺,抽取外周静脉血男女各5ml。
2 接种
将所取血样,送入超净工作台,在火焰旁分别将45ulPHA滴入4个盛有3ml培养液的培养瓶内,再加入血液,每瓶0.18ml。
盖上橡皮塞,轻轻摇动以混匀。
放入37℃恒温箱内培养,每天轻轻震荡混匀2次。
3 培养
贴好标签,将培养瓶放在37℃恒温箱内静置培养68~72h。
4 秋水仙素处理
分别向经恒温培养的每瓶外周血淋巴细胞培养液中加入18ul秋水仙素,其终浓度为0.8ug/ml轻轻将液体摇匀,继续恒温培养3个小时。
5 离心
从培养箱中取出培养瓶,用吸管充分吹打瓶壁,吸取培养物移入离心管内,相对离心管平衡后放入离心机,离心7min(1000转/分),吸去上清液,留下沉淀物。
6 低渗处理
向离心管中加入1ml的0.075mol/LKCl低渗液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀悬浮于低渗液中,再补加6mlKCl,置于37°C水浴锅中20分钟.
7 预固定
向离心管中加入固定液1ml,轻轻吹打均匀,在室温下放置20分钟。
8 再离心
1000转/分离心8min,去上清液。
9 固定
沿离心管壁加入新配固定液3ml,吹打均匀,室温放置20分钟,1000转/分,离心8分钟,去上清液。
10 重复固定一次
11 滴片
加入新配制的0.2~0.5ml固定液,用吸管轻轻吹打细胞团。
吸取细胞悬液,在一定高度(约60cm)下垂直滴2-3滴于冰冻洁净载玻片上,立即用口吹散,在烘箱中烘干。
12 染色
将冷却的标本片立即放入装有Giemsa染色液的染缸,室温染色20分钟。
然后用自来水轻轻冲洗3~5次,至洗净,然后烘干。
13 镜检
在低倍镜下选择染色体形态和分散良好的中期分裂相,移到视野中心。
找到细胞后,换上高倍镜,用细准点螺旋和反光镜把视野调整清晰,直到看清物象为止。
选择染色体分散适度,长度适中的分裂相进行观察。
染色体组型分析:
1)在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄
2)将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条的剪下
3)根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的目测配对
4)测量出每条染色体短臂和长臂长度,计算出个染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数,记录数据
5)根据测量数据校正目测配对结果,然后进行调整排列
6)把染色体按一定顺序一对一对的排列,排列时应注意短臂向上,长臂向下,性染色体单独排列,左后把染色体贴成一完整的染色体核型图
7)将已排列好的染色体核型图翻拍
四、实验结果:
男生染色体原图
男生染色体排序图
男生染色体长度测量表
编号
绝对长度(mm)
相对长度
短臂长度(mm)
长臂长度(mm)
臂指数
着丝粒指数
着丝粒位置
染色体1
52.0
0.0833
25.0
27.0
1.1
0.4808
m
染色体2
45.0
0.0721
20.0
25.0
1.3
0.4444
m
染色体3
37.0
0.0593
18.5
18.5
1.0
0.5000
m
染色体4
35.0
0.0561
10.0
25.0
2.5
0.2857
sm
染色体5
33.0
0.0529
12.0
21.0
1.8
0.3636
sm
染色体6
32.0
0.0513
9.0
23.0
2.6
0.2813
sm
染色体7
30.5
0.0489
12.5
18.0
1.4
0.4098
m
染色体8
29.0
0.0465
9.0
20.0
2.2
0.3103
sm
染色体9
27.5
0.0441
9.0
18.5
2.1
0.3273
sm
染色体10
27.0
0.0433
8.0
19.0
2.4
0.2963
sm
染色体11
26.0
0.0417
7.0
19.0
2.7
0.2692
sm
染色体12
25.0
0.0401
9.0
16.0
1.8
0.3600
sm
染色体13
24.0
0.0385
6.0
18.0
3.0
0.2500
st
染色体14
24.0
0.0385
8.0
16.0
2.0
0.3333
sm
染色体15
22.0
0.0353
5.5
16.5
3.0
0.2500
st
染色体16
22.0
0.0353
7.0
15.0
2.1
0.3182
sm
染色体17
20.0
0.0321
9.0
11.0
1.2
0.4500
m
染色体18
17.0
0.0272
6.0
11.0
1.8
0.3529
sm
染色体19
16.0
0.0256
7.0
9.0
1.3
0.4375
m
染色体20
15.0
0.0240
4.0
11.0
2.8
0.2667
sm
染色体21
14.0
0.0224
2.0
12.0
6.0
0.1429
st
染色体22
9.0
0.0144
0.0
9.0
#DIV/0!
0.0000
t
染色体X
32.0
0.0513
12.0
20.0
1.7
0.3750
sm
染色体Y
10.0
0.0160
2.0
8.0
4.0
0.2000
st
女生染色体原图
女生染色体排序图
女生染色体长度测量表
5、结果分析
本次实验结果并不理想,在我们进行镜检时,我们在显微镜的观察下,只能检测到很少数量的细胞,而且有许多小的碎片物。
在这些可以检测到的细胞中,通过观察细胞的分裂相细胞,得到的结果也不理想,观察不到细胞破碎以后释放出染色体的形态。
在班上其他小组的结果中,也没有较好的结果。
因此在最后的实验结果中,我们采用了其他班级的实验图。
根据实验结果的不理想,从以下几个方面来分析实验失败的原因。
装片上细胞数量太少:
问题一、是我们采集的实验新材料的问题——外周血不够新鲜。
血液的保存是用的抗凝管,当时考虑到取样之后直接回来进行实验,没有使用胆肝,怕胆肝素对细胞造成一定的影响。
但是在采集了血样之后,我们并没有进行及时的处理。
而是放置在室温中一段时间。
导致血样已经开始沉淀,最后只是借助外力晃动抗凝管,使血液混匀。
这儿可能导致许多细胞失去活性,不利于培养。
问题二、是PHA的用量问题。
PHA的用量是人体淋巴细胞培养成败的关键,效价低或用量不足,则培养效果差,但浓度过大红细胞会凝固,从而影响细胞生长。
我们加入的PHA的量是按照书中所给的最大的浓度来添加,经分析有可能是PHA的量过多,导致细胞凝固,影响细胞的生长。
问题三、是在离心处理过程中的问题。
在离心后,我们并没有发现离心管底部是否含有足够的沉淀物,直接进行下一步再次离心,直接倒掉上清液,这样导致的结果是细胞并没有沉淀下来,失去了大量的细胞。
问题四、细胞的培养条件问题,在刚刚接种之后,恒温箱的温度并不是37°C,在培养过程中,我们只进行了摇匀,没有检测其酸碱度,导致细胞的生长环境不佳,细胞的数量不多。
装片的染色效果不好:
在镜检时,观察到许多碎片,影响了实验现象,这是在冲洗过程中,从染缸拿出到去冲洗的时间过长和冲洗时间过短造成的。
装片的颜色也不是预期的,分析得所配制的磷酸缓冲液的PH不是6.8.
染色体的形态不好:
观察到的染色体不仅小且短,表明其浓缩程度过大,原因因为秋水仙素的浓度过大。
六、注意事项
1、要实用新鲜的血样,培养细胞的环境应是无菌环境,而且控制好温度和PH。
2、秋水仙素处理的浓度和时间、离心的转速、低渗处理这些都是影响染色体标本制作质量的关键因素。
3、制片时,调好染液的PH,以及染色的时间及冲洗。
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