大学生创新性实验项目申报书.docx

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大学生创新性实验项目申报书

长沙理工大学“大学生创新性实验计划项目”申请表

填表时间：

2011年6月15日

项目名称

哈密瓜果醋研究工艺中发酵技术的研究

申请经费

1.0000万元

起止时间

2011年6月至2012年5月

申请团队

项目负责人

姓名

年级

所在学院、专业

联系电话

E-mail

2009级

化学与生物工程学院生物工程

项目组成员

姓名

年级

所在学院、专业

联系电话

E-mail

2009级

化学与生物工程学院生物工程

2009级

化学与生物工程学院生物工程

2009级

化学与生物工程学院生物工程

2009级

化学与生物工程学院生物工程

导师

姓名

职务/职称

所在学院、专业

联系电话

E-mail

一、申请理由（包括自身具备的知识条件：

自己的特长、兴趣等）

随着生活水平的不断提高，人们对食品的要求已经从温饱型向营养型和保健型转变，保健果醋是当今世界饮食消费的新潮流。

现代生物技术的飞速发展，为提升果醋的品质与内涵注入了新的活力。

哈密瓜果醋不仅具有人们喜爱的独特风味，而且因其富含功能成分、保健功效，具有着广阔的市场发展潜力。

并且哈密瓜果醋的开发生产对于充分利用哈密瓜资源，特别是能够对品质不好的哈密瓜进行深加工，提高果农收入，丰富醋酸饮料市场，节约粮食，促进地方经济的发展有着重要的意义。

但目前国内哈密瓜果醋的生产工艺不够成熟，其加工技术仍处于实验室阶段或中试阶段，尚未进行大规模生产，因此完善哈密瓜果醋生产工艺，提高产品质量，扩大生产规模是亟待解决的难题。

项目组5位同学对生物技术与实验研究有着浓厚的兴趣，自大一以来就组成了科研项目兴趣小组，多次参加科研比赛，其参与的项目“野生石蒜鳞茎膨大剂的研制”已进入校级科技立项，并且在第四届节能减排竞赛中其参加项目荣获二等奖，三等奖。

项目成员均为长沙理工大学生物工程专业09级学生，已先后完成了对《无机及分析化学》、《有机化学》、《生物化学》、《细胞生物学》、《化工原理》等基础课程的学习。

项目组成员均具有扎实的理论基础、素养好、勤于思考、动手能力强。

项目组成员中岳乾阳同学曾获得校二等奖学金，张春丽同学曾获得国家励志奖学金、校三等奖学金，覃熙媛同学曾获得校三等奖学金。

二、立项背景（研究现状、趋势、研究意义等，参考文献和其他有关背景材料）

1、研究现状及趋势

（1）国内果醋的开发及研究现状

食醋酿造在我国有两千多年的历史。

目前国内应用于纯培养生产液态粮食醋及果醋的醋酸菌基本都是中科1.41和沪酿1.01两株。

食醋组成是以醋酸为主，以乳酸、琥珀酸、苹果酸、延胡索酸等多种有机酸为辅，还包含有由菌种发酵后形成的各种醋类，因而使得食醋成为具有酸、香、绵、甜特色的食品，但由于所用菌种的不同，形成的食醋风格和口味各异。

随着新产品新工艺技术的出现，为提高醋酸发酵的产酸速率和产酸浓度，满足市场食醋质量尤其是风味质量的要求，很多学者进行了新菌种的筛选和应用研究，以便选出适宜果醋的专用菌种。

我国最早的果醋专利是1989年山西太原的颜丹等人利用生料醋浸泡梨、姜后添加糖、蜜所得的一种保健醋，因其具有浓郁的梨香也可归于果醋类。

国内最早的果醋实验报告是1986年《中国调味品》第11期中刊登的“果醋及果醋饮料的研究”；最早的果醋论文是1991年《江苏调味品》第2期刊登的一篇有关液态发酵信阳梨醋的报道，截至2009年年底，各类专业刊物中有关果醋的研究报告和工艺试验技术文献共有近200篇。

近几年，国内果醋研究也己成为食醋领域研究的热点问题之一。

例如，山东粮食科学研究所以地产部分果蔬为原料对果醋进行一定的研究并已开发出独特的果醋产品。

山西省提出通过以果代粮等途径来调整和完善食醋行业的产业结构，去占领国内外食醋大市场。

一些科研工作者以葡萄原酒为原料生产葡萄醋，大米糖化醪为主要原料添加菠萝生产带肉果汁醋，以残次风落苹果和高粱为主要原料酿成苹果高粱保健饮料醋。

果醋生产在我国已成为调味品行业和饮料行业的发展方向。

早在1998年，国内市场上就出现了醋饮，醋酸饮料被誉为是继碳酸饮料、饮用水、果汁和茶饮料之后的“第四代”饮料。

随着人们生活水平的提高和营养保健意识的不断增强，食醋产业的专业技术人员也在调整产业结构，拓宽专业思路，不同品种、不同档次的各色果醋应运而生，满足了不同口味、不同层次广大消费者的需求。

借助于科学技术的飞跃发展，全国各地区纷纷就固态发酵、表面发酵、深层培养等食醋生产工艺技术，实现机械化、自动化以及菌种筛选、改良，酶的应用等方面做出了大量努力，充分发挥各种技术的潜力，从而不断提高生产效率，提高产品质量，增加花色品种，显著提高了食醋生产的科技水平。

据分析,哈密瓜含糖在8%~17%之间,纤维素在0.45%~0.8%之间,还有维生素A、B1、B2、C以及苹果酸、尼克酸和铁、钙、磷等元素。

其中铁的含量,比鸡肉多2倍,比鱼肉多3倍,比牛肉多17倍,对人体造血机能有显著的促进作用。

目前,新疆哈密瓜除了外销内食外,每年还有相当一部分哈密瓜因得不到及时处理而浪废掉。

另外,新疆人少,荒地较多,很适合扩大哈密瓜的种植,基于以上原因,我们利用吐鲁番独特的资源来生产哈密瓜果醋,满足国内外消费需要,是十分必要的,也是完全可行的。

哈密瓜果醋不仅口感新鲜,瓜香纯正,爽顺幽雅,醇厚柔美,还有一定的保健功能，如止渴、解除疲劳，增进食欲，促进消化等，很受广大消费者的欢迎。

（2）国外果醋的开发及研究现状

目前国外的食醋大多是采用液态发酵法酿制的果醋，液体发酵制醋是醋酸发酵时物料呈液态的一种酿醋工艺。

既酒醪或淡酒液接入醋酸菌后，以深层通气或表面静止发酵法酿制。

它的工艺包括：

表面发酵法、速酿法和液体深层发酵法。

液态发酵法的优点在于发酵周期短、劳动强度小、发酵过程易控制，减少了杂菌污染的机会，但是由于是纯种培养，且发酵时间有限，因此液态发酵法形成的风味物质少，其风味和口感较固态发酵法要差。

但是以液态法生产的果醋以其独特的优越性正在逐步被人们所接受。

在菌种方面，国外主要是利用醋酸杆菌（A.schuenbachii），这是国外有名的酿醋菌种。

还有一个菌种是奥尔兰醋酸杆菌（A.orleanense）是法国奥尔兰地区用的葡萄醋生产菌种，这个菌种能产生大量的酯，产醋酸能力弱，但耐酸性强。

欧美的食醋主要是红、白葡萄醋，苹果醋，麦芽醋，酒精醋。

随着深层发酵技术的进步，高浓度酿造醋因减轻储存负担也受到相当重视。

在欧美和德国、日本，麦芽醋等高浓度醋的食用量日趋增加。

目前，果醋产品在欧美，东南亚等地颇受欢迎。

进入九十年代以来，美国人推出了苹果醋，法国人推出了葡萄醋，英国人则推出啤酒醋，日本人对果醋更是情有独钟推崇备至。

在国外，人们对果醋的价值认识、产品开发己相当深入。

据调查，90年代美国的醋产量为5.6亿升，其中蒸馏醋4.3亿升，苹果醋0.93亿升，占总醋产量的16.7%；加拿大年产0.65亿升醋。

在发达工业国家，每年每人平均消费2升醋（5%醋酸含量）。

特别是在欧美、日本等发达国家，有关果醋调味品、果醋保健品等产品种类较多，用途广泛。

人们己习惯将果醋作为调味品，例如，醋在法国鱼、肉、蔬菜的烹饪中，己是不可缺少的调味料。

西式泡菜就是用果醋将蔬菜浸泡后加入辅助调料做成，其清脆沁香的果醋味颇能勾起人们的食欲。

西式沙拉也是靠果醋来调味，深受中外食客欢迎。

日本从20世纪70年代末就开始将果醋纳入国家标准，果醋生产已有了一定的规模，并于80年代掀起保健醋热潮。

据报道，仅在1982至1986年5年间就至少有39种62个品牌的新品果醋上市，而哈密瓜果醋作为一个新品种也必然会受到大众的欢迎。

由此可见，世界发达国家的果醋市场较成熟，规模较大且发展较快，哈密瓜果醋作为一种营养、保健型调味品，将得到广大消费者的认可与青睐。

2、研究意义

（1）果醋开发的意义

我国新疆，甘肃，内蒙古一带盛产哈密瓜，新疆哈密瓜有180多个品种及类型，又有早熟夏瓜和晚熟冬瓜之分。

但就目前我国的情况来说，水果的综合利用率很低，远远低于发达国家的水平。

在水果产区，每年都有大量不能用于销售和加工的残次水果和落地果，如果将这些水果进行发酵制成果醋，即可变废为宝，实现大幅度增值，从而有效的提高水果种植和加工的经济效益，充分地利用水果资源。

其次由于水果中含有丰富的人体所必需的钾、锌等元素，用哈密瓜酿制而成的哈密瓜果醋，溶解了哈密瓜中全部的营养成分，补充了粮食醋中钾、锌等微量元素的不足，特别是哈密瓜果醋中含有丰富的蛋白质、膳食纤维、胡萝卜素、果胶、糖类、维生素A、维生素B、维生素C，大大提高了其营养价值及保健功能。

通过现代医疗科学的验证，以果代粮通过微生物发酵可将粮食发酵中缺乏的钾、锌离子等导入果醋中，饮用后具有良好的医疗保健作用：

促进新陈代谢，调节体内酸碱平衡，消除疲劳;美容养颜、延缓衰老；促进血液循环、调节钙质代谢；提高机体的免疫力，具有防癌抗癌作用；预防高血压、高血脂、脑血栓、动脉硬化；降低胆固醇；开胃消食、解酒保肝等等功效，有助于我国人民身体素质的提高。

传统食醋以大米、糯米、高梁、薯干、鼓皮等淀粉类为主要原料，经糖化、酒精发酵、醋酸发酵等工艺酿制而成。

传统的酿酒、酿醋工艺每年要消耗2000万吨以上的粮食，约占全国粮食总产量的l/10。

若能以果代粮生产食醋，则可节约大量粮食，据报道，如果将果类资源每年累计损失的一半用于酿制果醋，就可以节粮20多万吨，具有很高的社会效益和经济效益。

（2）我国果醋生产及开发存在的问题

目前我国的果醋系列产品刚刚进入市场导入期，相关的调味品与饮料行业还没有制定出果醋及果醋饮品国家标准，这就使得产品在激烈的竞争市场上无章可循，产品质量相差悬殊，有些产品质量很好，有些产品则粗制滥造，这样从一定程度上影响了果醋的消费也影响了果醋的开发与研制。

尤其是对果醋原料的要求没有统一的规定，这就导致了在原料的使用上，“食”与“药”不分，品质不一，从而使消费者在选购和食用时产生误解，不利于果醋市场的良性发展。

对某种果醋饮料的功能性许多厂家并未提出明确的论证，在宣传上也存在一些夸大其词的现象，这样也难以规范市场。

并且近年来出现的一些名不副实的产品及假冒伪劣产品冲击市场，损害消费者利益，又侵犯正常生产厂家的权益，造成极坏的影响。

这需要各有关部门制定出相关的生产和质量标准，采取严厉措施，查处和制止假冒伪劣产品的生产，为果醋市场的健康发展创造一个良好的环境。

关于果醋生产技术，有液态发酵和固态发酵两种。

固态发酵法与液态发酵法相比具有风味佳、口感好等优点，但是也存在着发酵周期长、劳动强度大、发酵过程难以控制、易被杂菌污染等缺点。

而液态发酵法的优点在于发酵周期短、劳动强度小、发酵过程易控制，减少了杂菌污染的机会，但是由于是纯种培养，且发酵时间有限，因此液态发酵法形成的风味物质少，其风味和口感较固态发酵法要差。

目前，还没有很好的方法生产果醋，有关完善果醋的生产技术我国仍在探索阶段。

2工艺及操作要点

2.1哈密瓜果醋发酵工艺流程

哈密瓜原料→预处理→成分调整←调酸调糖

↓

酵母菌的活化→酒精发酵

↓

醋酸菌的复活→纯化→扩大培养→醋酸发酵

↓

成品醋←瓶装，杀菌←陈酿←成分调配←过滤

2.2主要操作要点

2.2.1果汁的制备用清水洗净哈密瓜，并去表皮、果柄、种子，切成大小均等的小块，在打浆机中进行破碎，用0.01%~0.02%果胶酶进行酶解，并且添加一定量的VC以防止果汁发生酶促褐变，然后过滤。

2.2.2果汁成分的调整榨汁后，果汁根据其糖含量用白砂糖调整最终果汁的浓度于8%~14%不等，用柠檬酸调节pH值在4.5左右。

2.2.3酵母菌的活化活性干酵母1.5g（以100g水计算）先在35℃恒温水浴锅中复水30min，然后加入2g的白砂糖（以100g水计算），搅拌均匀后，在30~35℃条件下活化1h备用（每20min搅拌1次）。

2.2.4酒精发酵阶段

（1）温度对酒精发酵的影响。

在此试验中采用静态液体发酵法进行酒精发酵，将过滤好的果汁400mL调整糖度在10%，pH值在4.5，分别取100mL放入3个三角瓶（250mL）中，然后在无菌条件下分别接种10mL的酵母活化液，分别置于20℃、30℃、40℃的恒温箱中发酵6天。

每隔24h测定其糖浓度，确定发酵的适宜温度。

（2）接种量对酒精发酵的影响。

将过滤好的果汁400mL调整糖度在10%，pH值在4.5，分别取100mL放入3个三角瓶（250mL）中，在无菌条件下接种分别接入5、10、15mL的酵母活化液。

将它们置于30℃的恒温箱中发酵120h，每隔24h测定其糖浓度，确定发酵适宜的接种量。

（3）初始糖浓度对酒精发酵阶段的影响。

将果汁调整糖浓度为8%、10%、14%的3种，然后分别取100mL放入3个三角瓶中，在无菌条件下分别接入10mL的酵母活化液，置于30℃恒温培养箱中发酵6天。

每隔24h测定其糖浓度，确定发酵适宜的果汁糖浓度。

2.2.5醋酸菌的扩大培养醋酸菌初次培养：

将筛选出的醋酸菌接种到灭菌液体培养基中，于30℃150r/min摇培3~4天，要注意液体培养基要在灭菌后接入醋酸菌前添加无水乙醇，以防止酒精挥发。

醋酸菌二次培养：

将初次培养的培养液按10%的接种量接入灭菌后的哈密瓜果汁中，30℃150r/min摇培3~4天。

2.2.6醋酸发酵醋酸菌为好氧菌，最适温度为27~33℃，pH值为3.5~6.5，当醋酸含量达到4.5%~5.0%的环境中并且食盐浓度超过1.0%时就停止。

酒精发酵完全后进行醋酸发酵，此试验中控制温度分别在20，30，40℃，pH分别为3.0，4.5，6.0；接种量分别为5%、10%、15%。

发酵到酸度不在上升时终止发酵，一般发酵周期在10~20天，分析各因素对发酵过程的影响。

经过实验,可知哈密瓜果醋酒精发酵最佳的条件为：

温度为30℃，接种量为10%，初始糖度为10%，发酵时间为120h；醋酸发酵最佳条件是温度为30℃，接种量为10%，pH值为4.5，发酵时间为16天。

3、关于粟酒裂殖酵母和生物降酸

一般苹果的营养成分当中都会含有一定的苹果酸，如果苹果酸残留在苹果醋中就会影响成品果醋的口感和品质，并容易招致细菌污染，一般都要设法去除苹果酸，降低酸度。

降酸有多种方法，生物降酸便是常用的方法之一。

生物降酸除了利用乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵的方法外，也有利用酵母菌来分解苹果酸的。

本研究就是利用粟酒裂殖酵母来分解苹果酸。

（1）粟酒裂殖酵母

粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）属于裂殖酵母属，最早分离自非洲粟米酒，所以称为粟酒裂殖酵母。

粟酒裂殖酵母可进行苹果酸一乙醇发酵，即在厌氧条件下分解苹果酸生成乙醇和CO2的过程。

在该过程中苹果酸首先在苹果酸酶的作用下脱羧形成丙酮酸和CO2，然后在厌氧条件下丙酸酸脱梭还原乙醛生成乙醇。

在20世纪90年代初，对粟酒裂殖酵母苹果酸代谢的生理生化途径已经有了较清晰的认识。

研究表明，参与粟酒裂殖酵母苹果酸降解的酶除了苹果酸外还有苹果酸脱氢酶和苹果酸通透酶。

苹果酸脱氢酶催化苹果酸转变为草酰乙酸。

苹果酸通透酶是一种苹果酸运载蛋白，把苹果酸从细胞外通过氢离子泵通道运输到胞质内。

在厌氧条件下苹果酸独自可以进行苹果酸代谢，但效率没有与苹果酸脱氢酶共同作用时高；在有氧条件下需苹果酸脱氢酶和苹果酸酶共同作用完成苹果酸代谢。

Taillandier的研究表明苹果酸被分解为丙酮酸后，在厌氧条件下继而又在乙醇脱氢酶的作用下完全代谢为乙醇和CO2。

且苹果酸的降解无论是有氧代谢还是厌氧代谢都依赖于葡萄糖，进而表明，苹果酸代谢是一个耗能过程。

各种研究数据都表明了粟酒裂殖酵母和酿酒酵母的苹果酸有着完全不同的生理作用。

有氧的情况下，苹果酸被酿酒酵母线粒体内的苹果酸脱氢酶脱氢后，经TAc循环被彻底氧化为C02和水；在厌氧情况下，苹果酸被苹果酸酶催化生成丙酮酸和NADPH，用于酵母生物合成。

而粟酒裂殖酵母在有氧的情况下，苹果酸被氧化为C02和水；在厌氧情况下生成乙醇和CO2，并不参与酵母生物合成。

其生理作用还不完全清楚，可能与维持细胞内的氧化还原电位有关，即在苹果酸脱梭的过程中NAD+被还原为NADH，而在厌氧条件下丙酮酸的还原过程又伴随着NADH被氧化为NAD+。

另外，在有氧情况下，苹果酸脱梭生成的丙酮酸由线粒体输送到胞质中发挥作用，丙酮酸是生物合成的重要物质。

（2）生物降酸

目前，国内外研究开发对果酒降酸的方法通常包括化学降酸、物理降酸和生物降酸三个途径。

化学降酸方法包括酸碱中和、离子交换等;物理降酸包括膜分离、电渗析等；生物降酸则利用微生物降解或转化有机酸。

前两种方法对酒质的负面影响较大，使用不当时，有可能引起果酒瓶内发酵。

因此现代果酒降酸的研究和发展方向主要是微生物降酸法。

这些微生物包括能够进行苹果酸一乳酸发酵（Malolacticfermentation，MLF）的乳酸菌和能够进行苹果酸一酒精发酵（Maloalcohohcfermentation,MAF）的裂殖酵母。

同时，现代发酵工程技术的进展，如固定化细胞（酶）技术的应用，生物反应器的开发已使果酒的微生物降酸技术朝着更可控、易操作的方向发展。

国外在对果酒生物降酸方面已经有了很大的发展，而国内在对果酒降酸方面进步比较缓慢，但是也有相应的发展，如陈继峰和BillK采用化学降酸法和生物降酸方法，即向葡萄汁之中加入化学试剂K2C03、Ca（HCO3）:

和CaC03同时接种乳酸菌进行苹果酸一乳酸发酵的降酸方法达到降低酸度的目的。

张伟民用裂殖酵母对称猴桃半干酒降酸进行了试验，虽然降酸率达20%以上，降酸效果显著，但是降酸后酒有异味；用CaCO3、K2（CO3）和酒石酸钾进行物理化学进行降酸，比较后以酒石酸钾对酒的品质影响最小。

张春晖用微生物降酸技术对葡萄酒的降酸进行了研究，认为国外生产的优质红葡萄酒大部分采用MLF降酸效果好，MAF降酸在干白葡萄酒中运用具有优势。

Crapisi用固定的短乳杆菌、嗜果糖乳杆菌及酒明串珠菌进行连续的MLF，发现苹果酸一乳酸准换率可达51.5%一53.9%，果酸和总酸分别下降了62.1%一74.7%和16.4%一27.3%。

Vaillant等则通过固定化苹酸一乳酸酶（MLF）技术进行了MLF，但是由于固定化酶技术需要分离酶，并且需要辅酶的再生，故该技术的应用的应用受到限制。

Cianl采用海藻酸钠固定裂殖酵母进行MAF降酸的研究结果表明，该技术不仅降酸效果明显，而且裂殖酵母对酒质不产生负面影响。

Vdi筋ant将提取纯化的MLE制成生物反应器进行MLF，苹果酸的分解率可达70%以上。

Ogbonna等用固定有裂殖酵母的生物板制成可置换的多相生物反应器进行连续的MAF，可使L一苹果的分解率达58%~76%，总酸下降17%一38%。

在果酒生产中，通常需对原酒的酸度进行调整。

若原酒酸度过低，则可通过添加果酒含有的相应的酸来调节，如酒石酸、柠檬酸、苹果酸等酸度调节剂；若原酒酸度太高，则需选用适宜的降酸剂降酸。

后者在生产中发生的情况更普遍，也更难操作。

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[8]娄锦培,刘志金.真空冷冻干燥哈密瓜试验研究.制冷学报,2002（4）:

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[9]刘福林,王洪新,肖建.哈密瓜饮料的研制.食品工业科技,2008（8）:

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林业调查设计,2007,4:

62-63.

三、项目方案

1、主要研究内容

（1）哈密瓜酒精发酵最佳工艺条件的确定

（2）哈密瓜醋酸发酵最佳工艺条件的确定

（3）哈密瓜果醋发酵工艺流程及主要操作要点的确定

2、实验方案

（1）粟酒裂殖酵母分解苹果酸条件的优化：

●影响粟酒裂殖酵母作用的因素结果与分析

通过设定3个不同水平的粟酒裂殖酵母接种量、发酵温度和发酵时间，进行正交试验得到9个样品，测定不同条件下的降酸幅度，以此来确定素酒裂殖酵母发酵降酸的最佳条件。

●粟酒裂殖酵母降酸最佳工艺的验证试验

由于从试验得到的最佳工艺条件组合很有可能并未包括在正交表的9个试验内，有必要进一步确定所得最佳工艺条件组合和正交表中的最佳工艺条件组合做一次验证试验，以最后发酵液中的苹果酸减少量为验证指标。

（2）哈密瓜酒精发酵最佳工艺条件的确定：

●影响哈密瓜酒精发酵的因素结果与分析

在酒精发酵阶段，分别控制温度为20、30、40℃，哈密瓜果汁糖含量8%、10%、14%以及接种量5%、10%、15%，研究以上各种因素在酒精发酵阶段对酒精发酵的影响，以确定酒精发酵的最佳条件。

粟酒裂殖酵母降酸最佳工艺的验证试验

●哈密瓜酒精发酵最佳工