实验室常规试剂配制.docx
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实验室常规试剂配制
实验室常规试剂配制
实验室常用试剂、缓冲液的配制
1MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)
组份浓度1MTris-HCl
配制量1L
配制方法1.称量121.1gTris置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。
4.将溶液定容至1L。
5.高温高压灭菌后,室温保存。
注意:
应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温
度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
1.5MTris-HCl(pH8.8)
组份浓度1.5MTris-HCl
配制量1L
配制方法1.称量181.7gTris置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.用浓盐酸调节pH值至8.8。
4.将溶液定容至1L。
5.高温高压灭菌后,室温保存。
注意:
应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温
度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
10×TEBuffer(pH7.4,7.6,8.0)
组份浓度100mMTris-HCl,10mMEDTA
配制量1L
配制方法1.量取下列溶液,置于1L烧杯中。
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,均匀混合。
3.将溶液定容至1L后,高温高压灭菌。
4.室温保存。
3M醋酸钠(pH5.2)
组份浓度
配制量
配制方法
PBSBuffer
组份浓度137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,2mMKH2PO4
配制量1L
配制方法1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.滴加浓盐酸将pH值调节至7.4,然后加入去离子水将溶液定容至1L。
4.高温高压灭菌后,室温保存。
注意:
上述PBSBuffer中无二价阳离子,如需要,可在配方中补充1mMCaCl2和0.5mMMgCl2。
10M醋酸铵
组份浓度10M醋酸铵
配制量100ml
配制方法1.称量77.1g醋酸铵置于100~200ml烧杯中,加入约30ml的去离子水搅拌溶解。
2.加去离子水将溶液定容至100ml。
3.使用0.22mm滤膜过滤除菌。
4.密封瓶口于室温保存。
注意:
醋酸铵受热易分解,所以不能高温高压灭菌。
Tris-HCl平衡苯酚
配制方法
1.使用原料:
大多数市售液化苯酚是清亮无色的,无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。
但有些液化苯酚呈粉红色或黄色,应避免使用。
同时也应避免使用结晶苯酚,结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物,这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。
因此,苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要,我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。
2.操作注意:
苯酚腐蚀性极强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜等。
所有操作
均应在通风橱中进行,与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇。
3.苯酚平衡:
因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相,因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡
使其pH值达到7.8以上,苯酚平衡操作方法如下:
①液化苯酚应贮存于-20℃,此时的苯酚呈结晶状态。
从冰柜中取出的苯酚首先在室温下
放置使其达到室温,然后在68℃水浴中使苯酚充分融解。
②加入羟基喹啉(8-Quinolinol)至终浓度0.1%。
该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完
全抑制剂及金属离子的弱螯合剂,同时因其呈黄色,有助于方便识别有机相。
③加入等体积的1MTris-HCl(pH8.0),使用磁力搅拌器搅拌15分钟,静置使其充分分层
后,除去上层水相。
④重复操作步骤③。
⑤加入等体积的0.1MTris-HCl(pH8.0),使用磁力搅拌器搅拌15分钟,静置使其充分分
层后,除去上层水相。
⑥重复操作步骤⑤,稍微残留部分上层水相。
⑦使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。
⑧将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存。
苯酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)
1.说明:
从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)。
氯仿可使蛋白
质变性并有助于液相与有机相的分离,而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。
2.配制方法:
将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24:
1)混合均匀后,移入棕色玻
璃瓶中4℃保存。
10%(W/V)SDS
2NNaOH
组份浓度2NNaOH
配制量100ml
配制方法
1.量取80ml去离子水置于100~200ml塑料烧杯中(NaOH溶解过程中大量放热,有可能使玻璃烧杯炸裂)。
2.称取8gNaOH小心地逐渐加入到烧杯中,边加边搅拌。
3.待NaOH完全溶解后,用去离子水将溶液定容至100ml。
4.将溶液转移至塑料容器中后,室温保存。
2.5NHCl
组份浓度2.5NHCl
配制量100ml
配制方法1.在78.4ml的去离子水中加入21.6ml的浓盐酸(11.6N),均匀混合。
2.室温保存。
5MNaCl
组份浓度5MNaCl
配制量1L
配制方法1.称取292.2gNaCl置于1L烧杯中,加入约800ml的去离子水后搅拌溶解。
2.加去离子水将溶液定容至1L后,适量分成小份。
3.高温高压灭菌后,4℃保存。
20%(W/V)Glucose
组份浓度20%(W/V)Glucose
配制量100ml
配制方法
1.称取20gGlucose置于100~200ml烧杯中,加入约80ml的去离子水后,搅拌溶解。
2.加去离子水将溶液定容至100ml。
3.高温高压灭菌后,4℃保存。
SolutionI(质粒提取用)
组份浓度25mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA,50mMGlucose
配制量1L
配制方法1.量取下列溶液,置于1L烧杯中。
2.高温高压灭菌后,4℃保存。
3.使用前每50ml的SolutionI中加入2ml的RNaseA(20mg/ml)。
SolutionII(质粒提取用)
组份浓度
配制量
配制方法
SolutionIII(质粒提取用)
组份浓度3MKOAc,5MCH3COOH
配制量500ml
配制方法1.称量下列试剂,置于500ml烧杯中。
2.加入300ml去离子水后搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至500ml。
4.高温高压灭菌后,4℃保存。
0.5MEDTA(pH8.0)
组份浓度0.5MEDTA
配制量1L
配制方法1.称取186.1gNa2EDTA·2H2O,置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌。
3.用NaOH调节pH值至8.0(约20gNaOH)。
注意:
pH值至8.0时,EDTA才能完全溶解。
4.加去离子水将溶液定容至1L。
5.适量分成小份后,高温高压灭菌。
6.室温保存。
1MDTT
组份浓度1MDTT
配制量20ml
配制方法1.称取3.09gDTT,加入到50ml塑料离心管内。
2.加20ml的0.01MNaOAc(pH5.2),溶解后使用0.22mm滤膜过滤除菌。
3.适量分成小份后,-20℃保存。
10mMATP
组份浓度10mMATP
配制量20ml
配制方法1.称取121mgNa2ATP·3H2O,加入到50ml塑料离心管内。
2.加20ml的25mMTris-HCl(pH8.0),搅拌溶解。
3.适量分成小份后,-20℃保存。
组份浓度10mMATP
配制量20ml
配制方法1.称取121mgNa2ATP·3H2O,加入到50ml塑料离心管内。
2.加20ml的25mMTris-HCl(pH8.0),搅拌溶解。
3.适量分成小份后,-20℃保存。
蛋白质电泳相关试剂、缓冲液的配制方法
30%(W/V)Acrylamide
组份浓度30%(W/V)Acrylamide
配制量1L
配制方法1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
2.向烧杯中加入约600ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至1L,用0.45mm滤膜滤去杂质。
4.于棕色瓶中4℃保存。
注意:
丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用具有积累性,配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成份。
40%(W/V)Acrylamide
组份浓度40%(W/V)Acrylamide
配制量1L
配制方法1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
2.向烧杯中加入约600ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至1L,用0.45mm滤膜滤去杂质。
4.于棕色瓶中4℃保存。
注意:
丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用具有积累性,配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成份。
10%(W/V)过硫酸铵
组份浓度
配制量
配制方法
5×Tris-GlycineBuffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)
组份浓度0.125MTris,1.25MGlycine,0.5%(W/V)SDS
配制量1L
配制方法1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水,搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至1L后,室温保存。
5×SDS-PAGELoadingBuffer
组份浓度
配制量5ml
配制方法1.量取下列试剂,置于10ml塑料离心管中。
2.加去离子水溶解后定容至5ml。
3.小份(500ml/份)分装后,于室温保存。
4.使用前将25ml的2-ME加到每小份中。
5.加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。
考马斯亮蓝R-250染液
组份浓度0.1%(W/V)考马斯亮蓝R-250,25%(V/V)异丙醇,10%(V/V)冰醋酸
配制量1L
配制方法1.称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中。
2.量取250ml的异丙醇加入上述烧杯中,搅拌溶解。
3.加入100ml的冰醋酸,搅拌均匀。
4.加入650ml的去离子水,搅拌均匀。
5.用滤纸除去颗粒物质后,室温保存。
考马斯亮蓝染色脱色液
组份浓度10%(V/V)醋酸,5%(V/V)乙醇
配制量1L
配制方法1.量取下列溶液,置于1L烧杯中。
2.充分混合后使用。
凝胶固定液(SDS-PAGE银氨染色用)
组份浓度50%(V/V)甲醇,10%(V/V)醋酸
配制量1L
配制方法1.量取下列溶液,置于1L烧杯中。
2.均匀混合后室温保存。
凝胶处理液(SDS-PAGE银氨染色用)
组份浓度
配制量
配制方法
凝胶染色液(SDS-PAGE银氨染色用)
组份浓度0.4%(W/V)AgNO3,1%(V/V)浓NH3·H2O,0.04%(W/V)NaOH
配制量100ml
配制方法1.量取下列试剂,加入100~200ml的试剂瓶中。
2.均匀混合。
该溶液应为无色透明状。
如氨水浓度过低时溶液会呈混浊状,此时应补加浓氨水,直至透明。
3.本染色液应现用现配,不宜保存。
显影液(SDS-PAGE银氨染色用)
组份浓度0.005%(W/V)柠檬酸,0.02%(V/V)甲醛
配制量1L
配制方法1.称量下列试剂,置于1L试剂瓶中。
2.加入1L去离子水后,摇动混合溶解。
3.室温保存。
核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法
50×TAEBuffer(pH8.5)
组份浓度2MTris-醋酸,100mMEDTA
配制量1L
配制方法1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.加入57.1ml的醋酸,充分搅拌。
4.加去离子水将溶液定容至1L后,室温保存。
10×TBEBuffer(pH8.3)
组份浓度
配制量
配制方法
10×MOPSBuffer
组份浓度200mMMOPS,20mMNaOAc,10mMEDTA
配制量1L
配制方法
1.称量41.8gMOPS,置于1L烧杯中。
2.加约700mlDEPC处理水,搅拌溶解。
3.使用2NNaOH调节pH值至7.0。
4.再向溶液中加入下列试剂。
5.用DEPC处理水将溶液定容至1L。
6.用0.45um滤膜过滤除去杂质。
7.室温避光保存。
注:
溶液见光或高温灭菌后会变黄。
变黄时也可使用,但变黑时不要使用。
溴乙锭(10mg/ml)
组份浓度10mg/ml溴乙锭
配制量100ml
配制方法
1.称量1g溴乙锭,加入到100ml容器中。
2.加入去离子水100ml,充分搅拌数小时完全溶解溴乙锭。
3.将溶液转移至棕色瓶中,室温避光保存。
4.溴乙锭的工作浓度为0.5mg/ml。
注意:
溴乙锭是一种致癌物质,必须小心操作。
Agarose凝胶
1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5×TBE或1×TAE)。
2.根椐制胶量及凝胶浓度,准确称量琼脂糖粉,加入适当的锥形瓶中。
3.加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。
注:
用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。
4.在锥形瓶的瓶口封上保鲜膜,并在膜上扎些小孔,然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。
加热过
程中,当溶液沸腾后,请戴上防热手套,小心摇动锥形瓶,使琼脂糖充分均匀熔化。
此操作重复数次,直至琼脂糖完全熔化。
必须注意,在微波炉中加热时间不宜过长,每次当溶液起泡沸腾时停止加热,否则会引起溶液过热暴沸,造成琼脂糖凝胶浓度不准,也会损坏微波炉。
熔化琼脂糖时,必须保证琼脂糖充分完全熔化,否则,会造成电泳图像模糊不清。
5.使溶液冷却至60℃左右,如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度0.5mg/ml),并充分混匀。
注:
溴乙锭是一种致癌物质。
使用含有溴乙锭的溶液时,请戴好手套。
6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中,然后在适当位置处插上梳子。
凝胶厚度一般在3~5mm之间。
7.在室温下使胶凝固(大约30分钟~1小时),然后放置于电泳槽中进行电泳。
注:
凝胶不立即使用时,请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存,一般可保存2~5天。
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
6×LoadingBuffer(DNA电泳用)
组份浓度
配制量
配制方法
10×LoadingBuffer(RNA电泳用)
组份浓度
配制量10ml
配制方法1.称量下列试剂,置于10ml离心管中。
2.向离心管中加入约4ml的DEPC处理水后,充分搅拌溶解。
3.加入5ml的甘油(Glycerol)后,充分混匀。
4.用DEPC处理水定容至10ml后,室温保存。
核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法
20×SSC
组份浓度3.0MNaCl,0.3M柠檬酸钠
配制量1L
配制方法1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.滴加14NHCl,调节pH值至7.0后,加去离子水将溶液定容至1L。
4.高温高压灭菌后,室温保存。
20×SSPEBuffer
组份浓度3.0MNaCl,0.2MNaH2PO4,0.02MEDTA
配制量1L
配制方法
1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.加NaOH调节pH值至7.4(约6.5ml的10NNaOH)。
4.加去离子水将溶液定容至1L。
5.高温高压灭菌后,室温保存。
50×Denhardt's溶液
组份浓度
配制量500ml
配制方法
1.称量下列试剂,置于500ml烧杯中。
2.加去离子水约400ml,充分搅拌溶解
3.加去离子水将溶液定容至500ml。
4.用0.45mm滤膜过滤后,分装成每份25ml。
5.-20℃保存。
1.5M磷酸盐Buffer
组份浓度0.5MNa2HPO4
配制量1L
配制方法
1.称量134gNa2HPO4·7H2O置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水充分搅拌溶解。
3.加入85%的H3PO4(浓磷酸)调节溶液pH值至7.2。
4.加去离子水定容至1L。
5.高温高压灭菌后,室温保存。
组份浓度10mg/mlSalmonDNA
配制量约100ml
配制方法
1.称取鲑鱼精DNA2g置于500ml烧杯中,加入约200ml的TEBuffer。
2.用磁力搅拌器室温搅拌2~4小时,溶解后加入4ml的5MNaCl,使其终浓度为0.1M。
3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。
4.回收水相溶液后,使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次,以切断DNA。
5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。
6.离心回收DNA后,溶解于100ml的去离子水中,测定溶液的OD260值。
7.计算溶液的DNA浓度后,稀释DNA溶液至10mg/ml。
8.煮沸10分钟后,分装成小份(1ml/份)。
-20℃保存。
9.使用前在沸水浴中加热5分钟后,迅速冰浴冷却。
组份浓度
配制量
配制方法
组份浓度
配制量约100ml
配制方法1.称量下列试剂,置于200ml烧杯中。
组份浓度
配制量100ml
配制方法1.称量下列试剂,置于200ml烧杯中。
2.充分混匀后,使用0.45um滤膜滤去杂质后使用。
组份浓度39mMGlycine,48mMTris,0.037%(W/V)SDS,20%(V/V)甲醇
配制量1L
配制方法1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
2.向烧杯中加入约600ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至800ml后,加入200ml的甲醇。
4.室温保存。
组份浓度20mMTris-HCl,150mMNaCl,0.05%(V/V)Tween20
配制量1L
配制方法
1.称量下列试剂,置于1L烧杯中。
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.加入0.5mlTween20后充分混匀。
4.加去离子水将溶液定容至1L后,4℃保存。
组份浓度5%(W/V)脱脂奶粉/TBSTBuffer
配制量100ml
配制方法
1.称量5g脱脂奶粉加入到100ml的TBSTBuffer中,充分搅拌溶解。
2.4℃保存待用(本封闭液应该现配现用)。
实验室常用培养基的配制方法
Ampicillin(100mg/ml)
组份浓度100mg/mlAmpicillin
配制量50ml
配制方法
1.称量5gAmpicillin置于50ml离心管中。
2.加入40ml灭菌水,充分混合溶解后,定容至50ml。
3.用0.22mm过滤膜过滤除菌。
4.小份分装(1ml/份)后,-20℃保存。
IPTG(24mg/ml)
组份浓度24mg/mlIPTG
配制量50ml
配制方法
1.称量1.2gIPTG置于50ml离心管中。
2.加入40ml灭菌水,充分混合溶解后,定容至50ml。
3.用0.22mm过滤膜过滤除菌。
4.小份分装(1ml/份)后,-20℃保存。
X-Gal(20mg/ml)
组份浓度
配制量
配制方法
-20℃避光保存。
组份浓度
配制量
配制方法
组份浓度
配制量1L
配制方法
1.称取下列试剂,置于1L烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.滴加5NNaOH(约0.2ml),调节pH值至7.0。
4.加去离子水将培养基定容至1L。
5.高温高压灭菌后,冷却至室温。
6.加入1mlAmpicillin(100mg/ml)后均匀混合。
7.4℃保存。
组份浓度
配制量1L
配制方法
1.配制磷酸盐缓冲液(0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4)100ml。
溶解2.31gKH2PO4和12.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌。
2.称取下列试剂,置于1L烧杯中。
3.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
4.加去离子水将培养基定容至1L后,高温高压灭菌。
5.待溶液冷却至60℃以下时,加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。
6.4℃保存。
组份浓度
配制量1L
配制方法
组份浓度
配制量1L
配制方法
1.配制250mMKCl溶液。
在90ml的去离子水中溶解1.86gKCl后,定容至100ml。
2.配制2MMgCl2溶液。
在90ml去离子水中溶解19gMgCl2后,定容至100ml,高温高压灭菌。
3.称取下列试剂,置于1L烧杯中。
4.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
5.量取10ml250mMKCl溶液,加入到烧杯中。
6.滴加5NNaOH溶液(约0.2ml),调节pH值至7.0。
7.加入去离子水将培养基定容至1L。
8.高温高压灭菌后,4℃保存。
9.使用前加入5ml灭菌的2MMgCl2溶液。
组份浓
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- 实验室 常规 试剂 配制