转基因大豆检测实验设计.docx
- 文档编号:25310767
- 上传时间:2023-06-07
- 格式:DOCX
- 页数:9
- 大小:18.35KB
转基因大豆检测实验设计.docx
《转基因大豆检测实验设计.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《转基因大豆检测实验设计.docx(9页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
转基因大豆检测实验设计
转基因大豆的检测
实验设计
生物技术安全评估09
2012年5月
前言………………………………………………………………3.
实验一大豆样品的准备………………………………………4
实验二大豆DNA的提取和纯化………………………………4
实验三靶标基因的扩增………………………………………6
实验四反应产品检测…………………………………………10
实验五结果分析………………………………………………12
参考文献…………………………………………………………12
前言
随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用,转基因生物(GeneticallyModifiedOrganism)及其产品的种类越来越多,含有的外源基因类型也越来越多。
抗草甘膦(glyphosate)大豆(商品名,roundupreadysoybean)是在传统大豆株VarietyA5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。
它是目前使用最广的转基因作物之一,每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。
因此,研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。
基于核酸的检测技术主要有PCR方法和基于PCR原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR等
等。
普通PCR方法已经成为转基因检测中常用的方法,通常是作为定性检测方法,早在2003年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。
这些标准涉及的转基因作物有大豆(SN/T1195-2003)、玉米(SN/T1196-2003)、棉花(SN/T1199-2003)、油菜籽(SN/T1197-2003)、烟草(SN/T1200-2003)和马铃薯(SN/T1198-2003)。
目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。
随后在2004年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T19495.4-2004),该国标中用的方法还是普通
PCR。
因此,普通PCR方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。
本实验以三种大豆为材料进行比较,通过对其DNA的提取和纯化,靶标基因的获取及琼脂糖电泳分析,从而鉴定所检测大豆样品。
采用PCR检测转基因大豆的方法,主要是采用琼脂糖凝胶电泳法,首先检测CAMV-35S启动子进行筛选,然后检测EPSPS抗草甘膦基因。
实验一 大豆样品的准备
一样品来源:
(原始样品最小质量为:
11200克)
1、阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质(IRMM-410R,Fluka公司)
2、进口转基因大豆样品
3、非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。
二样品加工过程:
1、构成原始样品(原始样品不得低于试验样品的4倍)
2、样品的初步处理(去皮、去壳、除水、除油等应记录初步处理前后样品的质量变化)
3、破碎和研磨
4、缩分
5、实验室样品的制备(实验室样品的最小质量不能小于原始样品最小质量的1/16)
6、存查样品和式样的制备
实验二大豆DNA的提取和纯化
(CTAB法)
一实验目的
掌握用CTAB法提取真核细胞总DNA的原理、步骤和注意事项。
二实验原理
1、CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注:
CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此,在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
2、CTAB提取缓冲液各成分的作用:
(1)Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏
(2)EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性
(3)NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中
(4)Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因 组DNA
(5)主要作用物质就是氯仿,所以它占有的比例较大,而异戊醇的主要就是防止起泡 泡。
三实验仪器和实验试剂
1.仪器:
水浴锅离心机EP管电泳仪研钵
2.试剂:
去离子水乙醇 氯仿-异戊醇液氮
CTAB缓冲液:
CTAB20g/L,Tris-HCI0.1mol/L(pH8.0),EDTA 0.02mol/L.
TE缓冲液:
lommol/LTris.,1mmol/I, EDTA,pH8.0).
酶溶液:
5μg/μl.
材料:
阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质(IRMM-410R,Fluka公司)、进口转基因大豆样品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。
四实验步骤(三种材料分别进行)
1、洗干净大豆叶片,用75%的酒精表面消毒3min,用去离子水冲洗3~4次
2.称取1g叶片放入灭过菌的研体中,加入液氮捣碎,迅速转入2ml离心管中。
3.加入600μlCTAB缓冲液,震荡均匀,65℃温育30min.
4.加入500ul酚:
三氯甲烷:
异戊醇(25:
24:
1),振荡均匀,12000r/min,离心15min。
5.吸取上清液,放入另一新管中,加入等体积的异丙醇,12000r/min,离心10min。
6.弃去上清液,加入70%乙醇溶液洗涤,12000r/min,离心1min。
7.弃去上清液,干燥,用50μlTE溶液溶解沉淀。
8.加入5μlRNA酶溶液,37℃温育30min。
9.加入400μl的CTAB溶液,振荡均匀。
10.加入250μl的三氯甲烷:
异戊醇,振荡均匀,12000r/min,离心15min。
11.吸取上清液,放入另一个新管中,加入200μl的异丙醇,12000r/min,离心10min。
12.弃去上清液,干燥,用50μlTE缓冲液溶解沉淀。
五实验结果
获取大豆的DNA。
六注意事项
1.研磨组织块用于DNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。
2.整个抽提过程,要尽量避免DNA酶的污染,全程配戴一次性手套,皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染DNA的抽提并成为DNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯,预防微生物污染。
本实验亦可用试剂法。
(takara公司:
首页-产品分类目录 -DNAExtractionKitforGMODetection)
实验三 靶标基因的扩增
一大豆内源基因lectin的检测
1、范围
本方法规定了大豆物种特异性单拷贝基因序列的常规检测程序。
本方法适用于评价从大豆加工产品中提取的DNA质量,并可判断是否有足量的DNA用于基因成分检测。
2、原理
通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为118bp的大豆Lectin基因片段。
3、检测下限
本方法能检测0.1ng的大豆DNA。
4、试剂
一般要求
按照GB/T19495.1—2004的要求执行。
水
10XPCR缓冲液(不含氯化镁)
氯化镁溶液:
25mmol/L.
dNTP溶液:
各2.5mmol/L.
引物:
A、正向引物
大豆Lectin基因(GeneBank?
编号:
K00821)
5’-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3’
B、反向引物
大豆Lectin基因(GeneBank?
编号:
K00821)
5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3’
Taq酶:
5IU/μL
5、仪器:
PCR仪、电泳仪
6、PCR扩增
PCR反应体系
本方法中中,PCR反应的总体积为25μL,反应体系见表A.1。
可以在不改变试剂浓度的情况下,适当扩大反应体系。
表(A?
)B.1 PCR反应体系
试剂
终浓度
加样体积/μL
样品DNA
10ng~50ng
1
水
15.9
10xPCR缓冲液(不含氯化镁)
1x
2.5
氯化镁溶液(25mmol/L)
1.5mmol/L
1.5
dNTP溶液(10mmol/L)
0.8mmol/L
2
正向引物(5μmol/L)
0.2μmol/L
1
反向引物(5μmol/L)
0.2μmol/L
1
Taq酶(5IU/μL)
0.5IU
0.1
注:
如PCR缓冲液中已经含有氯化镁,则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5mmol/L.
PCR反应参数
PCR反应参数见表A.2。
使用不同的PCR仪,可对参数作适当地调整。
表B(A?
).2 PCR反应参数
预变性
10min,95°C
扩增
20s,95°C
40s,60°C
40s,72°C
循环数
40
最终延伸
3min,72°C
7、结果判断
如果PCR产物通过电泳确证,可表述样品DNA溶液中含有来源于大豆的可扩增的DNA。
二转基因大豆DNA(CaMV35S启动子)筛选检测方法
1、范围
本方法规定了CaMV35S启动子不同拷贝数的定性PCR检测方法。
本方法适用于转基因大豆CaMV35S启动子的筛选检测。
2、原理
通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为195bp的CaMV35S启动子基因片段。
3、检测下限
本方法未确定绝对检测下限。
相对检测下限可以检测含有0.1%(质量分数)转基因抗草甘磷大豆粉(IRMM-410)。
4、试剂
一般要求
按照GB/T19495.1—2004的要求执行。
水
10XPCR缓冲液(不含氯化镁)
氯化镁溶液:
25mmol/L.
dNTP溶液:
各2.5mmol/L.
引物:
A、正向引物
CaMV35S启动子(GeneBank?
编号:
V00141)
5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’
B、反向引物
CaMV35S启动子(GeneBank?
编号:
V00141)
5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’
Taq酶:
5IU/μL
限制性内切酶XmnI(=Asp700)
5、仪器:
PCR仪、电泳仪
6、PCR扩增
PCR反应体系
本方法中中,PCR反应的总体积为25μL,反应体系见表B.1。
可以在不改变试剂浓度的情况下,适当扩大反应体系。
表B.1 PCR反应体系
试剂
终浓度
加样体积/μL
样品DNA
10ng~50ng
1
水
15.9
10xPCR缓冲液(不含氯化镁)
1x
2.5
氯化镁溶液(25mmol/L)
1.5mmol/L
1.5
dNTP溶液(10mmol/L)
0.8mmol/L
2
正向引物(5μmol/L)
0.2μmol/L
1
反向引物(5μmol/L)
0.2μmol/L
1
Taq酶(5IU/μL)
0.5IU
0.1
注:
如PCR缓冲液中已经含有氯化镁,则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5mmol/L.
PCR反应参数
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 转基因 大豆 检测 实验设计