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FISH检测
FISH检测
HER-2的意义
乳腺癌有效的治疗取决于正确的选择治疗方案,肿瘤专家研究发现HER-2的水平是以阿
霉素为基础药物化疗重要而独立的预后因子。
HER-2水平的检测被认为是选择乳腺癌化疗的
标准依据。
HER-2水平的检测对乳腺癌治疗具有指导性意义。
不准确的结果会造成不正确的治疗方案。
导致病人遭受不必要的化疗或者使病人丧失有效的治疗良机。
HER-2/neu也称作CerbB-2,在调节细胞的生长中起着重要的作用,是分子量为185kd
的转膜细胞受体,属于酪氨酸酶家族的成员。
HER-2被证实在乳腺癌、卵巢癌和其它肿瘤上
扩增和过表达。
其扩增和过表达被认为是乳腺癌最重要预后和化疗标记。
大约有25%-30%^
腺癌有HER-2基因扩增。
化疗是乳腺癌术后最重要的治疗方法之一,患者肿瘤HER-2扩增对以阿霉素为基础化疗
的敏感性好,研究表明,HER-2扩增的病人实施强化剂量的化疗后其生存率明显提高。
而对无HER-2扩增的病人没有那么好的效果。
所以对无HER-2扩增的病人没有必要执行这样的化疗。
准确的HER-2水平检测为正确选择治疗方案提供重要依据。
目前用于治疗乳腺癌的单克隆抗体Herceptin理论上只对细胞膜上过多HER-2蛋白表达
的细胞才有作用,所以Herceptin治疗需要筛选HER-2阳性的患者才有可能成功。
目前检测
HER-2基因扩增或HER-2蛋白过度表达的方法有许多种,有南方点墨法、西方点墨法、北方点墨法、免疫组织化学染色法(IHC)和荧光原位杂交法(fluoresceneeinsitu
hybridization;FISH)等。
目前DAKOHerceptintest,VysisPathVysionHER-2DNAProbe
试剂盒和OncorINFORMHER-2/neu已通过美国食品药物管理局(FDA的认证,目前被认为是比较可靠的方法。
IHC和FISH均可以使用福尔马林固定的组织蜡块来检测,和一般病理组织标本处理相同,病理存档的组织块也能用于HER-2的检测,因此目前实验室多数使用IHC和FISH来检
测HER-2。
Herceptintest和FISH相比Herceptintest操作时间比较短,大约4-6个小
时即可完成,而FISH需要隔夜完成。
使用的设备Herceptintest只需要一般光学显微镜,
FISH则需要使用荧光显微镜。
从分子生物学原理上讲FISH检测的是肿瘤细胞的DNA而
Herceptintest(免疫化学法)检测的是细胞膜表面的蛋白质。
实际上真正执行基因功能的物质是蛋白质而不是DNA这要看HER-2基因是否扩增,当然以观察细胞膜表面HER-2蛋白
质的量是否增加最为直接。
也最为可信。
因为有时即使DNA有扩增其结果未必能在蛋白质曾面表现出来。
因为由DAN有表现到蛋白质被制造出来必须经过很多程序,中间可能出现很多
干扰因素。
除此之外,免疫化学检测法比较便宜,省时,可以较普遍的筛选。
FISH的优点在于使用传统分子生物学方法检测肿瘤组织的DNAFISH在荧光显微
镜下可以确认出肿瘤所在的位置,以VysisPathVysionHER-2DNAProbe来说,它会把
HER-2基因部位橘色荧光亮点,还将第17对染色体的中心颗粒(centromere)呈现绿色亮点,我们只要对比橘色和绿色亮点的数目,若橘色点/绿色点大于2,就表示有HER-2扩增,
正常细胞橘色点/绿色点数目比值小于2。
FISH同IHCHER-2水平检测方法相比,IHC检测的准确性不如原位杂交(CISH)和原位
荧光杂交法(FISH)。
就各种检测方法比较FISH为最好,FISH检测的结果可靠,被喻为HER-2水平检测的金标准。
HER-2免疫组织化学+2的意思是肿瘤组织在免疫组织化学染色下着色强度为2价。
多
数认为HER-2+3(3价)具有临床意义,可以作为使用Herceptin治疗的依据。
her-2IHC+2
则必须加作FISH检测是否真的有HER-2扩增。
而HER-2IHC0或+1则表示没有没有HER-2
过表达,不必再作FISH,也不适合使用Herceptin治疗。
FISH检测方法
试剂和仪器
Vysis提供的材料
根据订货该盒内含有大约足够检测20,50和100人份试剂。
限定一份检测22x22mm靶区。
1)
LSIHER2/neu黄色光谱(
lowcopynumberE.colivector)/CEP17绿光谱DNA探针
(E.coliplasmid)
VysisP.N(productnumber)
30-17060/35-171060
Quantity:
200uL/500uL/500uLx2forthe100assaykit
Storage:
-20Cinthedark
Composition(成分):
SpetrumGreenfluorophore-labeledalphasatellite
DNAprobeforchromosome17,SpectrumOrange
fluophore-labeledDNAprobefortheHER-2/neu
gen
locus,andblockingDNA,pre-denatured
in
hybridizationbuffer.
2)
DAPIConuterstain
VysisP.N:
30-804840/30-804860/30-804960
Quantity:
300uL/600uL/1000Ul
Storage:
-20Cinthedark
Composition:
1000ng/mLDAPI(4,6-diamino-2phenylindole)
in
phenylenediaminedihydrochloride,glycerol,and
buffer.
3)
NP-40
VysisP.N:
30-804820
Quantity:
4mL(2vials)
Storage:
-20to25C
Composition:
NP-40
4)
20XSSCsalts
VysisP.N:
30-805850
Quantity:
66gforupto250mLof20XSSCsolution
Storage:
-20to25C
Composition:
sodiumchlorideandsodiumcitrate
Note:
MaterialSafetyDataSheets(MSDS材料安全数据表)forallreagentsprovided
inthekitsareavailableuponrequestfromtheVysisTechnicalDepartment.
Storageandhandling贮存和处理
未开封的PathVysis试剂盒-20C贮存并避光和潮湿。
20XSSC盐和NP-40可以单独贮存
于室温。
每一种成分包装上面都标明了有效期。
同时也标明了打开和未开包装的贮存条件。
试剂盒中的某些成分接触光、热或潮湿会影响试剂的有效期,应该避免。
不按包装规定的条
件保存可能会影响检测结果。
需要的材料但Vysis公司不提供
实验室试剂
•HER-2/nue探针检测正常对照(正常信号率)orderNo.30-805093
•福尔马林固定,石蜡包埋,培养好的人细胞株(normalLSIHER-2/nue;CEP17ratio)
应用型显微镜载玻片数量:
5片,对照片在15-30C干燥剂防潮密封在容器中贮存。
•HER-2/nue探针界限对照片(弱扩增信号率)orderNo.30-805042;福尔马林固定,
石蜡包埋。
培养好的人细胞株(低水平HER-2/nue扩增)应用型显微镜载玻片数量:
5
片,对照片在15-30C干燥剂防潮密封在容器中贮存。
•石蜡预处理试剂盒(Vysiscat.#32-801200)盒内包括:
•预处理液(NaSCN数量:
5X50mL
•蛋白酶(胃蛋白酶2500-3000单位/mg)数量:
5X25mg
•蛋白酶缓冲液(NaCIsolution,pH2)数量:
5X50Ml
•缓冲洗液(2XSSC,pH7)数量:
2X250mL
•中性缓冲福尔马林液(4嫁聚甲醛PBS配制)
•Hemo-De(血液德)透明剂(FisherproductNo.15-182-507A)
•苏木精和伊红(H&E
•适当的荧光显微镜浸泡油。
室温贮存
•超纯甲酰胺。
从发货计算4C保存1个月(查看生产商推荐的详细信息)
•100%乙醇。
室温贮存
•浓缩的(12N)盐酸
•1N氢氧化钠
•纯净水(蒸馏水或去离子水或Milli-Q)。
室温贮存
•橡胶水泥胶
•Drierite德里拉特[干燥用无水硫酸,商品名]和液氮
实验室设备
•预清洁硅化或正电荷显微镜载玻片
•载玻片加热器(要求有准确的温度数字显示)45-50C
•22mmX22mm玻璃盖玻片
•可调容积吸管(1-10uL)和无菌微量移液管头
•聚丙烯微量离心管(0.5-1.5mL)
•计时器
•切片机
•磁力搅拌器
•漩涡混合器
•微量离心机
•刻度量筒
•水浴锅(37±1C,72±1C和80±1C)
•水浴(40C)无蛋白质
•干燥箱(37C-56C)
•钻石笔
•杂交湿盒
•镊子
•一次性注射器(5mL)
•染色缸(6)建议型号:
WheatonProductNo.900620竖式染色缸
•荧光显微镜设备和推荐的滤光片(见第二部分)
•pH计和pH试纸
•温度计
•带盖载玻片盒
•0.45细孔过滤设备
显微镜设备和附属品
显微镜:
观察原位杂交结果需要一种磊照明荧光显微镜,如果有合适的荧光显微镜。
应该检
查荧光显微镜是否能较好的观察原位杂交样品。
用老式显微镜一般DNA染色例如DAPI,碘
化丙啶和奎纳克林不具备足够的功能进行FISH检测。
显微镜常规清洁和定期调试应该由生
产商家的技术人员完成。
注释:
Oftenapresumedfailureofreagentsinaninsituassaymayactuallyindicatethatamalfunctioningorsub-optimalfluoroscopeorincorrectfiltersetisbeingusedtoviewasuccessfulhybridizationassay.
激发光源:
100W汞灯它的大约寿命200小时是推荐的激发光源。
汞灯用后应该记录使用小时数。
超过规定的时间之前应该更换。
确保汞灯适当的应用。
接物镜:
显微镜汞灯100W使用的荧光接物镜浸泡油数值孔径》0.75。
一个40X接物镜用10X
目镜连接适合扫描。
对FISH分析用63X或100X油浸消色差透镜型接物镜就可以获得满意的结果。
浸泡油:
油浸接物镜使用的浸油,是一种低自发荧光和专用荧光显微镜的配方。
滤光片:
多带通荧光显微镜滤片装置最适合用于CEF和LSIDAN探针试剂盒可以从Vysis获
得一些显微镜滤片型号。
PathVysion试剂盒推荐滤片装置是DAPI/9-Orange双带通,
DAPI/Green双带通和DAPI/Green/Orange三重带通。
LSIHER-2/nue原位杂交和CEP17探针对它们的靶区分别标记橙色和绿色荧光。
其它所有DNADAPI染色为绿色荧光。
工作液的准备
20XSSC(3M氯化钠,0.3M柠檬酸钠,pH5.3)
配制20XSSCpH5.3加入的顺序:
66g20XSSC
200mL纯化水
250mL最终量
彻底混合,用pH计室温下测pH,用浓盐酸调pH到5.3。
加纯水至总量250没mb通过0.45um孔径的过滤设备过滤。
室温贮存6个月。
变性液(70%甲酰胺/2XSSC,pH7.0-8.0)
配制甲酰胺的顺序:
49mL甲酰胺
7mL20XSSC,pH5.3
14mL纯化水
70mL最终量
彻底混合,用pH计室温下测pH,用玻璃电极(glasselectrode利用薄玻璃膜将两种溶液隔离而产生电势差的电极,常用于测量溶液的pH)调pH至7.0-8.0之间。
液体可以保存一
周。
每次用前检查pHo贮存于2-8C,不用的时候盖紧容器的盖子。
乙醇液
用100°%乙醇和纯化水V/V稀释70%80%避免蒸发或稀释过量,不用的时候盖紧容器的盖子。
配制后可以使用一周。
后杂交缓冲洗液(20XSSC/0.3%NP-40)
配制顺序:
100mL20XSSC,pH5.3
847mL纯化水
3mLNP-40
1000mL最终量
彻底混合,用pH计室温下测pH,用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5。
加纯化水到总量1000mL
通过0.45um孔径的过滤设备过滤。
使用过的液体当日丢弃,未使用过的液体室温贮存6个
月。
注意事项和预防措施
1.VysisPathVysionHER-2DNAProbekit用于体外诊断使用。
2.ThePathVysionKit仅用于福尔马林固定石蜡包埋乳腺癌组织;不作为新鲜组织或非乳腺癌组织使用。
3.所有生物学标本经过防止传染病传递的药剂处理。
盒子里提供的是人细胞株经过10%福尔马林固定的对照细胞涂片。
因为常常不清楚是否会引起传染,所有人标本和对照
片是经普遍预防处理。
标本处理指南从美国疾病控制中心获得。
4.标本应该避免酸,强碱或过热,这样的条件会破坏DNA引起FISH检测失败。
5.下面所有步骤对标本变性,杂交和检测可以引起不可接受失败或错误的结果。
6.相同组织块的第10张切片应该进行H.E染色对靶区进行辨认。
7.使用其它试剂代替Vysis公司提供的试剂可能对杂交条件产生不利的影响。
&确保标记的有效期以盒子上正确贮存说明为基础,不按贮存说明要求存放可能对检测结果不利。
9.如果贮存在低温,20XSSC可以出现结晶,如果结晶在室温下不能再溶解,该液应该丢弃。
10.如果其它工作液沉淀或浑浊应该丢弃,从新配制新工作液。
11.该DAPI对比染色含有DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)和1,4苯二胺。
DAPI是一种可能的诱变剂明确建立在遗传毒性影响的基础上。
1,4苯二胺被认为是一种
皮肤致敏剂和一种可能的呼吸致敏剂,避免吸入,摄取或皮肤接触。
参考MSD辞细警
告。
12.荧光暴露在光线下容易被光漂白,限制这种降级。
操作所有含荧光的液体时要减少光线暴露。
所有步骤牵涉到处理杂交的切片。
所有(孵育、洗等)步骤不要在光线下应该在暗处操作。
13.LSIHER-2/neuCEP17DNA探针混合物含有甲酰胺,一种致畸因子。
避免接触皮肤和黏膜。
14.校准温度需要测量液体、水浴锅和恒温箱的温度。
15.总要核实预处理液,变性液和洗液的温度,使用前用标准温度计对科普林缸内液体进行测量核对温度。
16.所有有危险的物质应该按当地和国家指导方针进行无害化处理。
标本处理和载玻片准备
标本收集和处理
PathVysion试剂是为福尔马林固定石蜡包埋的组织样品检测而设计的,组织收集应该按照
实验室标准程序执行。
PathVysion检测对组织的选择应该由病理学家完成。
标本避免接触酸,强碱或非常高的温度。
这种情况会破坏DNA导致FISH检测失败。
切片厚度4-6微米,福尔马林固定,石蜡包埋的组织可以按照实验室常规步骤处理和贮存。
确保PathVysion试剂盒检测的最佳结果,对所有标本分析这些方法应该一致。
用于FISH
检测分析组织块的第10张作H.E染色,以便对靶区进行辨认。
组织切片应该贴在胶包被载玻片的正面,以便在FISH检测中脱片。
PathVysion试剂盒有足够检测大约20人份的试剂;每份限定22mmX22mm区域。
较大的组织切片超过22mnX22mm区域每份加探针应该大于10uL。
福尔马林固定石蜡包埋组织切片准备
使用下列方法进行准备
1.切片4-6微米。
2.切片飘在无蛋白质40C水中。
3.贴在有机硅烷胶包被载玻片的正面。
4.让切片在空气中干燥。
(StartprocessingProbeChekcontrolslideshere)
5.烤切片56C过夜。
切片预处理
在进行PathVysion试剂盒检测前标本需要经过固定,切片必须脱蜡。
PathVysion预处理
试剂盒插在包装中,(ProductNo.32-801200)含有详细的说明。
下面是简要的步骤说明。
切片脱蜡
切片浸在Hemo-De10min,室温。
用新Hemo-De重复两次。
切片在100%乙醇5min,室温,重复。
空气干燥切片或把切片放在45-50C载玻片加热器上。
预处理切片
切片浸在0.2NHCI20minutes
切片浸在纯化水中3minutes
切片浸在缓冲洗液中3minutes
切片浸在预处理液中80C30minutes
切片浸在纯化水中1minutes
切片浸在缓冲洗液中5minutes,重复
蛋白酶处理
在载玻片边缘用纸巾吸干载玻片上过多的缓冲液
切片浸在蛋白酶液中37C,10minutes
切片浸在缓冲洗液中5minutes,重复
干燥切片在45-50C载玻片加热器上2-5minutes。
标本固定
切片浸在中性缓冲福尔马林液中,室温,10minutes。
切片浸在缓冲洗液中5minutes,重复
干燥切片在45-50C载玻片加热器上2-5minutes。
继续thePathVysion检测拟订计划
FISH测试步骤
FluoresceneeInSituHybridizationProcedureSummary
样品DNA变性
探针液DNA变性和杂交步骤准备工作应该同步进行。
1.将杂交用的湿盒在37C中预热(湿盒内放有湿纸巾)。
2.使用前在室温下将变性液pH调到7.0-8.0,把变性液加入玻片染色缸内(Coplinjar)
而后在72±1C水浴至少30min或变性液达到72±1C,使用前测量温度。
3.使用钻石笔尖划刻标记杂交区域。
4.将准备好的切片放入到达到72±1C的变性液中(v6片/缸)5min。
Note:
Verifythesolutiontemperaturebeforeeachuse.
5.用镊子从变性液中取出切片并立即放入室温70%酒精洗液中。
摇动切片去除甲酰胺,让切片在酒精中维持1min。
6.从70%酒精取出栽玻片,放入80%酒精,再入100%酉精。
7.载玻片的底部接触到一个小瓶子排掉载玻片上过多的酒精,用实验室纸巾擦干载玻片的底面。
&放在45-50C载玻片加热器上2-5min。
探针准备
1.室温下让探针复温,降低探针的黏度,以便探针充分准确吸取。
2.涡流混合。
把内容物装入试管底部,每个试管用台式离心机离心2-3秒,然后再次轻轻涡流混合。
杂交
1.力口10uL混合后的探针到载玻片的靶区,立刻在探针上加盖22mmX22mm盖玻片,让探针均匀的在盖玻片下扩散。
气泡会干扰杂交应该避免。
探针使用后需要及时再冷冻保存。
2.按下列方法用橡胶水泥密封盖玻片:
用5mL注射器抽橡胶水泥,在盖玻片的周围注射少量的橡胶水泥于盖玻片和载玻片交界处重叠,因此在盖玻片和载玻片周围形成密封圈。
3.把载玻片放入预热的杂交湿盒中,盖紧湿盒的盖子37C过夜(14-18小时)杂交后洗涤
1.加杂交后缓冲洗液(2XSSC/0.3%NP-40)到玻片染色缸内。
放进72±1C水浴中预热杂交后缓冲洗液至少30min或液体温度已经达到72±1C。
注:
在每次洗浴之前洗液的温度必须回到72±1C。
2.室温下加杂交后缓冲洗液到第二个玻片染色缸。
洗液使用1天后都要丢弃。
3.首先用镊子轻轻拉掉密封剂,去除载玻片上密封的橡胶水泥。
4.在室温下将载玻片浸入杂交后缓冲洗液中漂洗掉盖玻片。
5.盖玻片小心被去掉后,吸干载玻片边缘过多液体,把载玻片浸入杂交后缓冲洗液中72±1C2min(v6片/缸)。
6.从杂交后缓冲液中移出每张载玻片,把载玻片放在暗处竖立空气中干燥。
(关闭抽屉或关闭贵出门足可以)
7.加1010uLDAPI复染载玻片靶区并加盖盖玻片。
在信号计算前载玻片贮存于暗处。
载玻片贮存
在暗处杂交载玻片(带有盖玻片)贮存于-20C。
使用荧光显微镜时,先从-20C移出来让载玻片达到室温。
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