基因工程第四章1.docx
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基因工程第四章1.docx
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基因工程第四章1
第四章基因克隆载体
1.定义:
携带外源基因进入受体细胞的这种工具称为载体(Vector)
载体的本质是DNA。
2.在基因工程中所用的载体,主要有5类:
⑴质粒(Plasmid)
⑵噬菌体(phage)的衍生物
⑶柯斯质粒(Cosmid)
⑷单链DNA噬菌体M13
(5)动物病毒
3.理想的载体应具备的条件:
(1)具有自我复制能力
(2)有适宜的限制酶切位点,最好是对多种常用的限制酶有单一切点,并且这些单一切点在易于被检测的表型基因上
(3)具有一个或几个选择性遗传标记
(4)分子量较小,在受体细胞内有较多的拷贝数
⑸可携带足够长度的外源DNA片断,并能有效的转化至宿主细胞中
(6)容易从宿主细胞中分离纯化
4.1质粒载体
4.1.1质粒的一般生物学特性
1.质粒:
是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
它广泛存在于细菌细胞中,在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。
在基因工程中,多使用大肠杆菌质粒为载体。
质粒分子的大小为1~200kb,它可以“友好”地“借居”在宿主细胞中,依靠宿主细胞的现有体系进行自身复制,并将其编码的一些非染色体控制的遗传性状进行表达;同时质粒也提供给宿主细胞一些抗性、免疫性。
2.质粒的类型
(1)F质粒:
又叫F因子或性质粒(sexplasmid),F+、F-。
F+F-时,染色体标记低频转移,F因子高频转移
F质粒可以整合到染色体上,同步复制(这种菌株在与F-菌株杂交时,比F+所产生的遗传重组频率要高103倍),称为Hfr菌株(高频菌株)
HfrF-时,染色体标记高频转移,F因子低频转移
F因子从染色体脱离下来时,往往会带有染色体片断,这种带有染色体片段的F
因子称为F'因子。
(2)R质粒:
也称抗药性因子。
R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因,此中抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞,使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
(3)Col质粒:
此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因,即所谓产生大肠杆菌素因子。
3.质粒的分类
根据质粒能否自己转移,可分为:
(1)接合型质粒:
自我转移的质粒,除含有自我复制基因外,还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因
(2)非接合型质粒:
不能自我转移的质粒,此类质粒能够自我复制,但不含转移基因组。
从基因工程的安全角度讲,非接合型质粒用作克隆载体更为合适。
根据质粒的拷贝数,可分为:
(1)严紧型质粒:
拷贝数1~3份
⑵松弛型质粒:
拷贝数10~60份
质粒的复制型不是绝对的,不仅受自身的制约,还同宿主的状况有关。
4.质粒的不亲和性
两种亲缘关系密切的不同质粒,不能在同一宿主细胞中稳定地共存,这种现象称为质粒的不亲和性,也称不相容性。
彼此不相容的质粒属于同一个不亲合群;而彼此能够共存的亲和质粒,则属于不同的不亲和群。
不亲和群:
来源于同一种原始质粒,利用相同复制系统的这类质粒。
4.1.2几种常见的质粒
1.ColEl质粒载体
属于大肠杆菌Col类质粒中的一种,是一种天然质粒。
大小为6.3kb,分子量为4.2106dal。
含有EcoRI的单一酶切位点,具有松弛型复制子。
在培养基中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成,宿主染色体DNA的复制便被抑制,细胞的生长也随之停止;而质粒DNA仍可继续进行数小时的复制,这样每个宿主细胞所累积的ColEl质粒的拷贝数可达1000~3000个。
ColEl质粒除了具有可以编码大肠杆菌素EI的基因外,还可以编码使宿主细胞对大肠杆菌素EI产生免疫性的基因。
FrnFTfTl£
对大肠杆菌素的免疫特征可作为一种选择标记。
若在ColEl质粒的EcoRI位点插入外源DNA序列,则宿主细胞不能合成大肠杆菌素El(ColEI-),而具有EI免疫性(ImmEl+)表型的为含有重组质粒的细胞。
2.pBR322质粒载体
是人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体。
大小为4.3kb,分子量为4.2
106dal。
具有ColEl松弛型复制子,拷贝数为60个/细胞。
pBR322质粒上有两个选择性标记:
氨苄青霉素抗性基因(AmpR):
其上有PstI的切割位点
四环素抗性基因(TetR):
其上有BamHI、HindIll、SalI的切割位点
对pBR322质粒可利用插入失活法进行重组体的选择。
例如用BamHI切割后插入外源DNA片段,形成AmpR、Tet5,在如下的抗菌素培养平板上进行检验,即
可方便的筛选出重组体DNA(红色菌落)
pBR322质粒共有4363个核苷酸,规定核苷酸的计数由EcoRI的靶序列开始,以GAATTC中的第一个T记为核苷酸1。
3.pBR325质粒载体
由于在质粒pBR322中,基因工程最常用的限制酶EcoRI位点不具有插入失活效应,因而对其进行改进得到了质粒pBR325,大小为5.4kb。
pBR325质粒上有三个选择性标记:
R
氨苄青霉素抗性基因(Amp):
其上有PstI、PvuI的切割位点
四环素抗性基因(TetR):
其上有BamHI、HindIII、SalI的切割位点
氯霉素抗性基因(CmR):
其上有EcoRI、PvuII的切割位点
4.pAT153质粒载体
用HaeII消化pBR322质粒,使其缺失HaeII的B和G片段,形成3.6kb的小质粒。
pAT153质粒上的其余酶切位点和抗性标记均与pBR322质粒相同。
由于B、G片段的DNA包含了控制拷贝数的基因组,当其缺失后则拷贝数不受限制,因而pAT153质粒的一个重要特点是在宿主细胞中有高的拷贝数,大约比
亲本质粒pBR322高出1.5~3倍。
5.PCYC184质粒载体
它和上述ColEI衍生质粒分属于两个不相容群,所以可以共存于同一个细胞内。
PCYC184质粒上有两个选择性标记:
四环素抗性基因(TetR):
其上有BamHI、HindIII、SalI的切割位点
氯霉素抗性基因(CmR):
其上有EcoRI的切割位点
加入壮观霉素可以使质粒扩增。
6.PUC系列质粒载体
是一类长度约2.7kb的小质粒,有一个氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
该类质粒是高拷贝质粒,因为其缺失rop基因,该基因紧靠DNA复制起点,与控制拷贝数有关,所以缺失后拷贝数增多,每个宿主细胞内拷贝数可高达
500~700个。
PUC系列质粒带有一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA区段,该区段能编码LacZ基因产物(-半乳糖苷酶)的氨基端片段(N端的146个氨基酸),这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并不影响该片段的功能。
调节皋因
启动操纵基氏1基因一
结构基因
I
P
0
Z
Y
A
半乳耀昔酶透性翳
转乙醍05
InKNA
当阻遏蛋白与0结合后,阻档了皿私聚合酶的前移,丢闭了2、Y>心基因的转录。
当诱导物〔乳糖)与阴遏蛋白形成复合物后,则与0脱离.转录可以堆续进行。
多克隆位点:
由克隆实验中常用的限制酶所识别的序列组成,多数情况下这些酶切位点都是单一的,即在质粒载体的其他部位无此切点。
这种人工合成的密集排列的系列克隆位点称为“多克隆位点”,也叫“多接头”,又叫“限制酶切位点库”。
该编码区位于诱导型启动子Plac的下游,用IPTG(异丙基--D-硫代半乳糖苷)能够诱导该片段的合成。
而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶
(缺失N端部分序列)实现互补,形成具有酶学活性的蛋白质。
LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体(宿主)与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体(质粒)之间实现基因内互补,这种互补现象称为“-互补”(基因内互补)。
由-互补而产生的Lac+细菌易于识别,它们在生色底物X-gal(5-溴4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷)的存在下可形成蓝色菌落,这是由于-半乳糖苷酶与X-gal
作用形成了蓝色化合物(5-溴-4-氯-靛青)。
当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免的产生无-互补能
力的N端片段,不能形成有活性的-半乳糖苷酶,因此带重组质粒的细菌形成
白色菌落。
而不含插入片段的PUC质粒转化到同样的宿主菌,则生成蓝色菌落。
PUC18和PUC19是一对质粒,除它们的多克隆位点以互为相反的方向排列外,两者在其他方面并无差别。
PBR322、PBR325等与PUC系列亲缘关系较近,不能在同一细胞中共存。
4.2■噬菌体载体
4.2.1噬菌体(phage的一般生物学特征
phage是寄生在细菌体内的一类生物,有蛋白质外壳,头部内有DNA
头尾型(\噬菌也thDNA)
噬菌体的感染效率极高,只要重复4次感染周期,一个噬菌体颗粒便能够使数10亿个细菌细胞致死。
*烈性噬菌体:
只具有溶菌生长周期的噬菌体(噬菌体侵入寄主细胞后,进行DNA复制及蛋白质合成,使寄主细胞破裂,释放出子代噬菌体颗粒)。
*温和噬菌体:
既能进入溶菌生长周期,又能进入溶源生长周期的噬菌体(在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒,噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体
DNA上,成为它的一个组成部分)。
在基因工程中多采用温和型噬菌体。
*溶源性细菌:
具有一套完整的噬菌体基因组的细菌(即含有原噬菌体的寄主细胞)。
*原噬菌体(prophage):
在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA。
(所谓整合是指噬菌体DNA已插入到寄主细胞染色体DNA之中。
)
溶源性细菌具有免疫性,能够不再受同种噬菌体的侵染,这一现象称为超感
染免疫性
用小剂量的紫外线照射处于生长期的细菌,可以使溶源性细菌转入裂解状态,开始溶菌周期。
422,噬菌体的基因及功能
DNA为线性双链分子,长度为48.6kb,是一种中等大小的温和型噬菌体。
在分子两端,各有一条由12个碱基组成的彼此完全互补的5'延伸的粘性末端。
当,DNA被注入寄主细胞后,会迅速通过粘性末端之间的互补作用,形成环行双链DNA分子。
这种由粘性末端结合形成的双链区段,称为cos位点
(cohesive-endsite粘性末端位点)。
用址乍用
■DNA至少包括61个基因,其中有一般左右参与了噬菌体生命周期的活动,称为■噬菌体的必要基因;另一部分基因,当它们被外源基因取代后,并不影响噬菌体的生命功能,称为非必要基因,取代了非必要基因的外源基因,可以随寄
主细胞一道复制和增殖。
b2区:
功能不明
int、xis、red:
重组基因,行使整合、重组和割离功能
N、Q:
正调控因子
cIII、cl、cro、ell:
负调控因子
O、P:
DNA复制基因
S、R:
裂解基因
cl基因表达,可产生一种阻遏物蛋白,此蛋白可使参与溶菌周期活动的所有基因失去活性,促进噬菌体进入溶源途径并维持溶源状态。
cl基因停止表达,则噬菌体的溶菌生长周期开始。
cro基因编码反阻遏物因子cro蛋白,该蛋白阻遏cl基因的转录,同时也阻遏其余早期基因的转录。
■DNA的复制在早期是按形式从双向进行的,由一个环状分子复制成两个
环状分子。
若进入裂解途径的晚期,则进行滚环复制,由一个环状DNA分子复
制成多个■DNA分子连在一起的线状长多连体分子。
在噬菌体包装时,DNA的多连体分子经过核酸酶的切割作用,从cos位点
处将它分离成单位长度的单体分子之后,才能够被包装起来。
423■噬菌体的构建
1.基本原理:
■DNA中的J基因到N基因区段为非必需区,该区段约占总DNA的三分之一,
它的缺失或取代不影响■噬菌体的生长和裂解释放。
故操作时先把J~N这一段非必需区去掉,而用事先设计好的片段取代之,设计好的这一片段具有限制酶的切割位点,且常常带有标记(如放射性同位素标记、抗生素抗性标记等)。
2.噬菌体载体的类型:
(1)插入型载体:
只有一个限制酶作用位点,插入外来的DNA片段能使该位点上的基因断开而失活。
插入型载体承受的外源DNA片段较小,一般在10kb以内。
*免疫功能失活的插入型载体:
在其基因组中有一段免疫区(imm434),该区段带有一两种限制酶的单一切点,并都位于cl基因内部。
若外源DNA片段插入到这种位点上,会导致cl基因失活,从而使该载体进入溶菌周期,产生出清晰的噬菌斑;而没有外源DNA插入的亲本噬菌体可以变成溶源状态,形成浑浊的噬菌斑。
*P-半乳糖苷酶失活的插入型载体:
在其基因组中含有一个大肠杆菌的Iac5区段,其上有lacZ基因(编码二半乳糖苷酶)。
由该载体感染的大肠杆菌lac指示菌,涂布在加有IPTG和X-gal的培养平板上,会形成蓝色的噬菌斑。
但若在Iac5区段插入外源DNA片段,阻断了亠半乳糖苷酶的合成,由这种,重组体感染的lac-指示菌,只能形成无色的噬菌斑。
(2)替换型载体
基因组中具有成对限制酶切割位点,在这两个位点之间的DNA区段可以被插
入的DNA片段所取代,这类载体可承受较大的外源DNA片段。
*带有SupE基因的替换型载体:
女「NM781载体,具有可取代的EcoRI片段,内编码有SupE基因,可校正寄主细胞的lacZ基因的琥珀突变。
由于这种■NM781噬菌体的感染,寄主细胞lacZ基因的琥珀突变被抑止,所以能在乳糖麦康氏(MacConkey)琼脂培养基上产
生红色的噬菌斑,或者在X-gal琼脂培养基上产生蓝色的噬菌斑。
如果具有SupE基因的EcoRI片段被外源DNA片段所取代,那么形成的重组噬菌体在上述两种培养基中,都只能产生无色的噬菌斑。
琥珀突变(Ambermutation):
在原先代表某种蛋白质一个氨基酸密码子所占据的位点上,造成一个琥珀密码子(UAG)的DNA突变。
无义突变是指某个碱基的突变使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子。
Am为琥珀型无义突变;Oc为赭石型(Ochre)无义突变,密码子为UAA;Opal为乳石型(Opal)无义突变,密码子为UGA。
*带有lacZ基因的替换型载体:
许多替换型载体也带有大肠杆菌的lac5取代区段,如Charon4感染寄主(lac-)后,可在X-gal琼脂培养基上产生蓝色的噬菌斑。
而含有lac5的EcoRI片段被外源DNA取代后,所形成的重组噬菌体只能产生无色的噬菌斑。
*Spi「正选择的替换型载体:
是一批经改良的替换型载体,其共同特点是在它们的中心限制片段上具有■
噬菌体的两个基因red和gam。
野生型的■噬菌体不能够在P2噬菌体溶源性细菌种生长(即在携带P2原噬菌体的溶源菌中生长受到抑制),其表型为Spi+sensitivetoP2inhibition,对P2噬菌体的抑制作用敏感)。
已证明这种生长抑制作用,是受■噬菌体的red和gam这两个基因编码的产物所控制的。
red基因的产物参与从型DNA复制向滚环复制转变时的重组过程;gam基
因的产物是大肠杆菌recBC核酸外切酶的抑制物。
red'gam-的重组噬菌体在recA-的宿主细胞中既不能依靠重组形成可被包装的闭环双体分子,滚环复制产生的线
状多聚体DNA也容易被recBC核酸外切酶降解,因此无法在宿主体内生长。
但是如果red'gam-噬菌体具有一个chi位点,则可以在recA+宿主中生长,因为chi位点(crossoverhotspotinstigatorsite意为交换特点激活区,是一段与重组有关的DNA序列,能够激活以rec为媒介的交换反应,催化由型复制产生的两个
子代噬菌体DNA的重组
当噬菌体丧失了red和gam基因(如被外源DNA所取代),这样的噬菌体突变体则获得了Spi-表型,能够在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中生长,并形成噬菌斑。
在应用具有red和gam基因的替换型载体作基因克隆的实验中,可以按Spi特性来选择重组体,故Spi-表型为我们提供了一种正选择标记。
424■噬菌体重组DNA的体外包装
1.■DNA的转染作用:
*转染(transfection):
应用病毒或病毒载体中分离的DNA感染细胞的过程,即由寄主细胞捕获噬菌体(病毒)DNA的过程。
*转导(transduction):
以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的过程。
*转化(transformation):
将质粒等外源DNA制剂引入细胞的过程。
转化得到的是转化子菌落,转染得到的是噬菌斑。
相对转化作用,转染是一个低效的过程。
所以在基因操作中,,重组体DNA的直接转染并不常用,目前主要应用体外包装技术,将,重组体DNA包装进噬菌体颗粒,再转导受体细胞。
2.DNA的体外包装:
是指在试管中完成噬菌体在寄主细胞内的全部组装过程。
其基本原理是:
■噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的,头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部,而尾部基因发生了突变的噬菌体只能形成头部,将
这两种不同突变型的噬菌体提取物混合起来,就能在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。
为此,首先要制备琥珀突变种。
E基因的产物E蛋白是,噬菌体头部的主要成分,占72%,E基因发生琥珀突变(Eam)后,头部基因不能表达,用这种■噬菌体感染的寄主细胞中可以积累大量的尾部蛋白质;D基因的产物D蛋白与噬
菌体头部的成熟有关,D基因发生琥珀突变(Dam)后,无法形成成熟的头部,而使其感染的寄主细胞中积累了大量的头部前体蛋白质。
由于这种细菌的溶菌物
在体外是彼此互补的,因此■DNA分子能够被包装成为成熟的噬菌体。
在实际工作中所使用的包装蛋白质是从具有cI857突变基因的■噬菌体之溶
源性的大肠杆菌,例如BHB2690(Dam)BHB和2685(Eam)菌株的培养物中制备的。
cl857是一种对温度敏感的阻遏物基因,具有该突变基因的■噬菌体,当其
寄主在32C下培养时,能保持溶源状态,而当温度上升到44~45C时,cI基因编码的阻遏物的活性丧失,这两种溶源性细菌的原噬菌体得到诱发。
但由于在其S
基因上有一个琥珀突变,所以细菌培养物不会发生溶菌反应,从而使子代噬菌体持续进行组装。
应用离心浓缩法收集这些含有未装配的头部蛋白质的细胞,然后用超生波处理或是反复冻融法使细胞裂解,也可用氯仿溶菌等措施获得包装蛋白质提取物。
再用这两种细胞提取物,在体外将重组的•DNA包装成为具有生物活性的噬菌体。
3.DNA的包装限制问题:
噬菌体的包装能力,控制在野生型DNA长度的75~105%。
在这个范围
内的DNA可以被包装成有活性的噬菌体颗粒,而超出这个范围的就不能形成正常大小的噬菌斑。
用,噬菌体作载体时,对外源DNA片段的大小有比较严格的要求。
若按野生型
DNA分子长度为48kb计算,其包装上限为51kb;由于野生型的DNA基因组中必要基因的DNA区段占28kb,所以载体克隆外源DNA片段的理论极限值是23kb。
一般的载体的包装容量在15kb左右。
当基因组缺失了超过其DNA总量25%的非必要区段,也不能被有效地包装。
所以用限制酶去除可取代片段后,若只有载体的左臂和右臂自身连接,达不到野生型DNA分子的75%,则不能形成噬菌斑;只有一定大小的外源DNA
插入后,才能形成噬菌斑。
可见,包装限制这一特性,保证了体外重组所形成的有活性的重组体分子,
一般都应带有外源DNA的插入片段,或是具有重新插入的非必要区段,这相当于是对重组体的一种正选择。
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