大孔吸附树脂提取分离栀子黄色素的研究.docx

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大孔吸附树脂提取分离栀子黄色素的研究

南阳理工学院

本科生毕业论文

学院（系）：

生物与化学工程学院

专业：

生物工程

学生：

*******

指导教师：

臧晋（教授）

完成日期2012年5月

南阳理工学院本科生毕业论文

大孔吸附树脂提取分离栀子黄色素的研究

Researchofextractionandisolationofgardeniayellowpigmentwithabsorptionresin

总计：

毕业设计（论文）34页

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南阳理工学院本科毕业设计（论文）

大孔吸附树脂提取分离栀子黄色素的研究

Researchofextractionandisolationofgardeniayellowpigmentwithabsorptionresin

学院（系）：

生物与化学工程学院

专业：

生物工程

学生姓名：

**********

学号：

********

指导教师（职称）：

臧晋（教授）

评阅教师：

完成日期：

2012年5月

南阳理工学院

NanyangInstituteofTechnology

大孔吸附树脂提取分离栀子黄色素的研究

生物工程******

[摘要]本文通过研究大孔吸附树脂对栀子黄色素、栀子苷的吸附与解吸条件而选择优化提取分离栀子黄色素的最佳条件。

采用单因素实验分别进行了色素吸附条件的选择，栀子苷洗脱条件的选择，并采用正交试验对色素洗脱条件进行了优化。

实验结果表明：

吸附效果最好的大孔树脂为HPD-100A型；大孔吸附树脂吸附色素的最佳条件为：

树脂和栀子提取液的固液比为1：

20（g/ml）,温度为50℃，时间为20min，pH为8。

色素吸附率可达93%；洗脱栀子苷的最佳条件为：

浓度为5%的乙醇，洗脱7次后，对栀子苷的累积洗脱率为：

96.1%；洗脱色素的最佳条件为：

乙醇浓度90%﹑温度为30℃﹑时间为30min，色素洗脱率可达97%。

[关键词]栀子黄色素；栀子苷；大孔吸附树脂；分离提取；条件优化。

ResearchofIsolationandextractionofgardeniayellowpigmentwithabsorptionresin

BiologicalEngineeringMACai-hong

Abstract:

Inthispaper,adsorptionanddesorptioncongditionsoftheyellowpigmentandgeniposidewerestudied,thepurposeistochoosethebestconditionstoextractandseparategardeniayellowpigment.Theselectionofadsorptionconditionsofpigmentanddesorptionconditionsofgeniposidewerestudiedbythesingle-factortest.Anddsorptionconditionsofpigmentwereoptimizedbyorthogonaltest.Experimentshows：

thebestmacroporuosresinisHPD-100A;theoptimalconditionthatmacorporousresinabsorpgardeniayellowpigmentis:

theratioofresinandgardenialiquidis1:

10,tempeturewas50℃,absorptiontimewas20minandthepHofgardenialiquidwas8;theabsorptionrateofpigmentcanbeupto93%.Theoptimalconditionstodesorpgeniposidewithmacroporousresinwas:

5%ethanol,thecumulativedesorptionrateofgeniposideis96.1afterdesorp7times.Theoptimalconditionstodesorppigmentwithresinwas:

theconcentrationofethanolwas90%,desorptiontemperaturewas30℃anddesorptiontimewas30min,andthedesorptionrateofpigmentcanbeupto97%.

Keywords:

gardeniayellowpigment;geniposide;theabsorptionresin;isolationandextraction;optimization.

目录

1前言1

1.1栀子概述1

1.2栀子黄色素概况2

1.2.1栀子黄色素的性质2

1.2.2栀子黄色素发生褪色和绿变的原因3

1.2.3栀子黄色素的提取3

1.3栀子黄色素提取分离研究现状及展望4

1.3.1浸提工艺4

1.3.2大孔树脂吸附法4

1.3.3超临界流体萃取法5

1.3.4微波提取法5

1.3.5超声波法5

1.3.6膜分离法6

1.3.7植物酶处理法6

1.3.8溶剂沉淀法6

1.4大孔吸附树脂6

1.4.1大孔吸附树脂及其功能6

1.4.2大孔吸附树脂的预处理7

1.4.3大孔吸附树脂的再生7

1.5本文的研究目的意义与研究内容7

2.实验部分8

2.1材料与仪器8

2.1．1材料与试剂8

2.1.2仪器8

2.2实验方法9

2.2.1栀子黄色素的提取9

2.2.2树脂预处理和再生9

2.2.3大孔树脂吸附色素实验9

2.2.4洗脱栀子苷实验9

2.2.5洗脱栀子黄色素实验9

2.2.6实验数据处理10

2.3实验方案10

2.3.1大孔树脂吸附色素条件的选择10

2.3.2栀子苷洗脱条件的选择11

2.3.3栀子黄色素洗脱条件的选择12

2.4实验结果13

2.4.1大孔树脂吸附色素条件选择结果13

2.4.2栀子苷洗脱条件选择的结果15

2.4.3栀子黄色素洗脱条件选择的结果18

3结论25

参考文献26

致谢27

1前言

合成色素具有品质均一、色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、易于溶解和着色等优点,从而被广泛应用于食品和化妆品等工业，但其没有营养价值，而且对人体有一定的负作用。

天然色素与合成色素相比，有很多的优点。

不但对人体无害，而且还有一定的营养价值，有些还对人体有医疗保健作用。

因此寻找和开发更多的天然色素已成为食用色素发展的总趋势。

栀子是提取天然色素的植物之一。

别名黄栀子、山栀等，是一种常绿灌木，茜草科植物[1]。

目前，栀子的果实是传统中药，属卫生部颁布的第一批药食两用资源，具有护肝、镇静、止血、利胆、降压、消肿等作用，是生产“安宫牛黄丸”、“龙胆泻肝丸”等几十种中成药的重要原料；还是提取食用色素添加剂“栀子黄色素”的优质材料,栀子黄色素一般为橙黄色粉末，其主要成分为藏红花素和藏红花酸，是一种罕见的水溶性类胡萝卜素，水溶液为柠檬黄色。

稳定性好、着色力强、耐还原性、耐微生物性好，耐光、耐热，在pH值4－11范围内颜色基本不变，对金属离子稳定；对淀粉、蛋白质染色效果好而被广泛应用[2]。

用于分离纯化栀子黄色素的方法有：

水浸取法、大孔树脂吸附法、超临界流体萃取法、微波提取法、溶剂沉淀发、植物酶处理法、超声波法等[1]-[3]。

本文概括介绍栀子黄色素和大孔树脂分离提取栀子黄色素工艺条件的研究。

首先选取了八种大孔吸附树脂对水提栀子黄色素的静态吸附特性，从中筛选出一种吸附和洗脱性能较好的树脂，并对其分离纯化栀子黄色素的影响因素进行分析，目的在于改进黄色素的分离提取工艺，得到高色价，低OD值的纯度较高的栀子黄色素。

1.1栀子概述

　栀子见于《神农本经》，是农胆目茜草科栀子属的一种常绿灌木，是卫生部颁发的第一批要是两用资源。

据《本草纲目》等记载，栀子性苦寒、无毒，常用来清泻火、解玉支度等。

栀子主产于福建、广西、四川、江西等省区,是喜温暖气候,能耐旱、不耐寒的植物。

对土壤要求不高，适宜在微酸或中性砂质壤土中生长，在山区、丘陵等地也都可栽种[3][14]。

现代药理学研究表明，栀子具有清热、利胆、泻火、凉血、降压、止血、消肿等功效。

医学上主要用来主治:

黄疸型肝炎，糖尿病、咽痛、高血压尿血、扭伤肿痛等[4]。

黄栀子作为中药材，果实的各部分均可制药，对人体有医疗保健作用，是中药不可缺少的原材料，从黄栀子提取出来的栀子黄色素的主要成分为藏红花素和藏红花酸，是一种罕见的水溶性类胡萝卜素,极易被人体吸收，有保健作用，在人体内可以转化为维生素A。

可以补充人体维生素的不足。

因此研究栀子黄色素的分离提取非常重要。

1.2栀子黄色素概况

栀子黄色素是一种混合物，含有珍贵的水溶性类胡萝卜素、藏花素、藏花酸、栀子苷、绿原酸和黄铜等[5]。

栀子黄色素的主要成分为藏花素和藏花酸。

藏花酸为红棕色针状晶体、微臭、熔点180℃，易溶于热水和乙醇，是橙色溶液，水溶液呈弱酸性或中性，分子量926.97[6]。

栀子分山栀子和水栀子，食品行业和医药行业对栀子的提取目的物不同，由于水栀子中藏花素含量较多，因此被应用于食品行业，中药主要提取栀子当中的环烯醚萜苷类化合物如栀子苷，羟异栀子苷等，这些物质清热泻火、凉血散瘀的功效。

由于山栀子这些物质含量较高，因此中药中常选用山栀子作为原料[7]。

总之由于栀子稳定性好、着色力强，耐还原性和耐微生物性好，而且耐光、耐热性也好，在pH值4－11范围内颜色基本不变，对金属离子稳定，对淀粉、蛋白质等的染色效果好而被广泛应用[9]。

1.2.1栀子黄色素的性质

栀子黄色素一般为橙黄色或深黄色粉末，水溶液为柠檬黄色。

主要成分是a-藏花素（a-crocin）和藏花酸（crocetin），其中藏花素的化学式为C

H

O

分子量997.21，是胡萝卜素二酸雨右旋龙胆双糖成苷键相接，较稳定[8]。

藏花酸，化学式为C

H

O

，分子量为328.39，是胡萝卜素二羟酸，经实践研究栀子黄色素的最大吸收峰是440nm[10]。

栀子黄色素中藏花素和藏花酸的结构式如下：

图1藏花素及其衍生物分子结构

图2藏花酸的结构式

栀子黄色素易溶于水、乙醇等极性溶剂，难溶于苯、醚、汽油等非极性溶剂。

由于栀子黄色素中的藏花酸为酸性成分，色素在碱性溶液中溶解度较大。

紫外-可见光区内栀子黄色素水溶液有三个吸收峰：

440nm、238nm、325nm，分别是藏花素和藏花酸、栀子苷、绿原酸特征吸收峰[9]。

是一种优良的天然植物色素，被广泛应用于食品、医疗和化妆品领域。

栀子黄色素为天然食用着色剂,具有安全性好、色泽鲜艳、着色力强、使用方便等优点而被广泛应用为饮料、面制品、糖果、酒类、乳制品、化妆品的着色剂，同时也可用于中医药着色剂和中药材原料。

栀子黄色素对淋病双球菌、脑膜炎双球菌、金黄色葡萄球菌、卡他球菌等有抑制作用，具有抗菌、抗病毒作用，是我国中药临床治疗黄疸型肝炎的最后好药物，具有利胆作用。

日本、韩国、欧美等国外市场对栀子黄色素需求量很大，在国内,大型饮料厂为了增加产品的市场竞争力，也逐步使用食用天然色素代替食用合成色素[11]。

目前,我国对栀子黄色素的研究主要集中在栀子黄色素的一般性质上,对于栀子黄色素的精制纯化、功能特性以及栀子黄色素的研究则相对较少[7]。

本文主要对栀子黄色素的静态提取工艺进行了深入研究，了解影响提取工艺的主要因素，为动态研究提供最好的工艺条件组合，以便得到质量较高的栀子黄色素产品，酸、碱、光、热和糖等对黄色素色调基本无影响。

1.2.2栀子黄色素发生褪色和绿变的原因

由于水提取的栀子溶液中有绿原酸等杂质，栀子黄色素易发生褪色、绿变等问题，限制了该色素的广泛应用。

引起栀子黄色素绿变及褪色的原因主要有两个方面：

一是栀子黄色素中存在易引起绿变的物质，栀子苷及绿原酸。

栀子苷在蛋白酶或（-葡萄糖苷酶）的作用下易发生反应而引起其着色的食品发生绿变，绿原酸则因易氧化而使其着色的食品发暗。

若把栀子黄色素中栀子苷的含量降低到一定含量，即可有效地防止绿变的发生。

实践证明，当栀子黄色素中栀子苷的最大吸光度（吸收峰值在238nm处）与藏花素和藏花酸的最大吸光度（吸收峰值在440nm处）的比值小于0.4时即可避免发生绿变[12]。

另外藏花素、藏花酸分子本身含有不饱和的多个共轭双键。

通常调整酸碱pH至8～9等方法可有效地防止褪色的发生；为了防止发生绿变，要提取栀子黄色素时，要使用新鲜的栀子果实，因为越新鲜的栀子藏红花素和藏红花酸的含量越高，栀子要晒干，提取液要洁净，尽可能降低栀子黄色素中栀子苷的含量才可避免。

1.2.3栀子黄色素的提取

栀子黄色素在水和乙醇溶液中的溶解性好，同时存在的栀子苷类物质也极溶解于水。

此外，栀子果实中还含有大量的果胶、蛋白、粘性物质等。

据研究，醇有利于栀子黄色素的提取，而水则更利于栀子苷类的浸出。

采用浓度较高的醇类物质提取栀子黄色素可提高栀子黄色素的提取率，同时可降低栀子苷和果胶等物质的溶出。

有研究结果表明，用乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇等溶剂可使栀子黄有较大的提取率[8][14]。

但考虑到经济因素及在食品行业中的安全要求，多用乙醇提取。

但这种方法存在效率低、耗时长、品质不好、操作复杂等很多缺点或不便。

研究栀子黄色素的提取工艺，提高色素纯度是本文研究的主要目的。

1.3栀子黄色素提取分离研究现状

近年全球市场对栀子的需求量逐年增长，我国是栀子产量较大的国家之一，具有较大的开发发展潜力，自1961年日本就一直从我国进口栀子[11]，但我国栀子黄色素的提取工艺还是粗放型的，加工技术落后，开发利用度低。

产品质量与国外有相当大的差距，目前我国还是主要研究传统的提取工艺条件和稳定性方面的研究，产品色价不高生产技术落后是我国栀子黄色素产业主要存在的问题。

栀子黄色素是栀子深加工的主要产品之一，是一类珍贵的天然水溶性类胡萝卜素，无毒无臭食用安全，着色力好，应用范围广，成本较低，随着其需求量的逐年增长，备受关注。

栀子在提取黄色素后，可从其废液中提取栀子苷和果胶，其废液还可以当做饲料,综合利用度高[14]。

我国采用膜技术对栀子黄色素进行分离纯化的研究取得了一定成果，但依然处于初级阶段，没有进入实际应用。

由于栀子黄色素的产品的精制至今没有得到解决，因此导致我国生产的栀子换色素色价过低，OD值高，所含杂质多，平直达不到国际标准水平。

只能以原料或半成品的形式对外出口，大大降低了利润。

因此，利用我国盛产栀子的优势，借鉴目前已有工艺，寻找合理高效分离提取栀子黄色素的方法很有研究价值。

简化工艺降低成本，开发出具有实际可行的生产工艺，寻求适合工业化连续生产的技术路线。

目前用于分离提取以及纯化栀子黄色素的主要工艺方法主要有：

浸提工艺当大孔树脂吸附法超零界流体萃取法微波提取法超声波法膜分离法植物酶处理法溶剂沉淀发等。

1.3.1浸提工艺

如前所述，栀子黄色素是水溶性类胡萝卜素，易溶于水和醇，传统的提取工艺大都为水和醇浸提法，即通过粉碎→脱脂→浸提→过滤→浓缩等步骤，提取20%～50%的浆液，再经干燥得到栀子黄色素，该方法具有工艺简单、投资少、生产成本较低等优点，但该法生产的色素纯度低，质量差，难以精制，使用价值不大[15]。

由于栀子黄色素与栀子苷都易溶于水和醇,为了得到纯度较好的色素，国内外大都采用了乙醇浸提，或先由水浸提后再经乙醇等予以分离纯化。

一般而言，用乙醇为提取液相对于用水作为提取液来说，所提取的色素纯度较高[14]。

1.3.2大孔树脂吸附法

吸附树脂是近20年发展起来的一类新型非离子型有机高分子聚合物吸附剂，它具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，不受无机物存在的影响，再生简便，分离性能优良，溶剂用量少，解吸条件温和，可重复使用，溶剂用量少等诸多优点，避免了用有机溶剂提取分离造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重等缺点[15]-[18]。

其原理是通过物理是被吸附物质与大孔树脂见形成范德华力和氢键，通过有选择的吸附有机物质，从而达到提取分离的目的。

采用大孔吸附树脂柱层析是目前分离天然产物栀子黄色素的主要方法之一，以大孔树脂为吸附剂，用静态吸附法选择出吸附和洗脱的最佳条件，再用动态柱层析，得到的栀子黄色素一般杂质含量低，纯度高，可以精制达到食用要求。

1.3.3超临界流体萃取法

超临界流体萃取是食品工业中兴起的一项提取和分离技术，它是利用液体在超临界区域兼有气液两性的特点和对溶质溶解能力随压力和温度改变而在相当宽的范围内变化这一特性而实现溶质溶解与分离的一项技术[17]。

利用这种超临界流体可从多种液态或固态混合物中萃取出需要分离的成分，一般采用CO2作为萃取剂。

超临界CO2提取技术是以液态CO2为溶剂进行提取的，其提取率与提取温度、提取压力、CO2消耗量等因素有关。

此技术操作工艺比较简单，没有有机溶剂残留，操作条件温和，栀子黄色素主要成分栀子苷和藏花素均易溶于水，极性较大，根据相似相容原理，它们在非极性的CO2中溶解度很小，因此，可以用相应的萃取条件萃取栀子黄色素[19]。

1.3.4微波提取法

微波法是一种非电离的电磁辐射，是利用微波能量来提高萃取率的新技术。

其本质是微波对提取溶剂和物料的加热作用。

被提取的极性分子在微波磁场中快速转向和定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦，引起发热，提取速率高于常规加热法，易于提取物溶出和释放。

该技术具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少、有效成分回收率高，减少原料预处理费并对环境无害。

微波射线穿透性极好，可施加于任何天然生物材料，在接近环境温度下抽提所需的有效成分，对于热敏性成分的提取极为有效，而且还可将其与超临界流体提取结合运用。

微波提取方法的优点是提取率高、准确、快速、操作成本低。

姚中铭等采用微波法，得到最佳的提取条件是：

提取功率：

210W，500g/L乙醇水溶液为提取溶剂，提取时间为：

80s，提取级数为2级，料液比1：

12，色素提取率达到98.2%[20]。

1.3.5超声波法

超声波作为一种新的应用技术，近年来广泛应用于天然植物的提取。

主要是利用超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于所要提取的有效成分的溶出和释放，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本维持在57℃，对原料有水浴作用，与传统方法相比，具有提取速度快、时间短、收率高、不需要加热等优点。

与微波法相比，超声波提取法提取时间相对较长，但是产品的质量优于微波法提取。

因此，用超声波法提取天然色素有时间短，提取率高，得到的产品质量好，原料利用率高等优点。

陆伟，钱骅等通过正交试验，确定了超声波法提取栀子黄色素的最佳工艺条件为：

乙醇溶液60%、温度45℃提取时间20min[21]。

1.3.6膜分离法

膜分离技术最主要的是膜材料的选择，超滤膜对不同物质的截留性能的大小主要取决于膜材料的分子量的大小、形状、柔韧性和表面化学性质。

这种方法是利用具有一定孔径的膜，根据其对不同分子量的物质有不同的截留性质而达到分离的方法[1]。

对于特定的分离物需要选择不同材料，不同孔径的膜。

膜分离程序为：

栀子果实→干燥预处理→粉碎→浸提→离心→过滤→超滤精制→超滤浓缩→真空浓缩→成品。

膜分离技术具有过程较简单、无污染、没有相变、分离选择性好、经济性较好、可在常温下连续操作等优点，特别适用于热敏性物质的处理[22]。

对于天然植物提取物可避免加热浓缩和有机溶剂的使用，以保证提取的天然色素的品质。

1.3.7植物酶处理法

利用特定的植物酶对栀子提取液中所含杂质的水解作用来去除杂质，从而达到精制的目的，栀子果实先用酒精提取，然后用一种蛋白酶（菠萝蛋白酶）分解，最后用常规的方法结晶，能得到叫纯的栀子黄色素[1]。

1.3.8溶剂沉淀法

这种方法主要是在栀子黄色素半成品中加入一定量的酒精或其它一些有机溶剂，把色素萃取出来，而果胶栀子苷绿原酸等杂质沉淀下来，从而达到分离精制栀子黄色素的目的。

这种方法对果胶的去除效果较好，但对栀子苷的去除率不理想，还需要经过酸碱处理[1]。

1.4大孔吸附树脂

1.4.1大孔吸附树脂及其功能

大孔吸附树脂是近10年发展起来的一类大孔径的有机高分子聚合物吸附剂，被吸附成分在大孔树脂上的吸附是大孔树脂与有效成分形成以范德华力和氢键为主的分子间作用力的结果。

[15]大孔树脂依据其聚合物的单体组成不同，可以分成非极性和极性两大类。

非极性吸附树脂适合从极性溶液中吸附非极性物质；中等极性树脂可从极性溶液中吸附非极性物质，还能从非极性溶液中吸附极性物质；极性大孔树脂适合从非极性溶液中吸附极性物质。

它具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，不受无机物存在的影响，再生简便，解吸条件温和，使用周期长，易于构成闭路循环，节省费用等诸多优点，避免了用有机溶剂提取分离造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重等缺点[16]-[18]。

大孔树脂的孔径和比表面积是影响大孔树脂对物质的吸附的主要因素。

大孔树脂比表面积越大，单位质量大孔树脂吸附的作用面积越大，单位质量大孔树脂吸附的有效成分就越多。

而大孔树脂的比表面积还包括内孔网的面积。

树脂孔径过小有效成分分子不能进入树脂内部，只能在树脂外表面吸附，相应的比表面积就比较小。

因此选择的时候应该根据目标物的分子量选择合适孔径的树脂才能使吸附的有效面积增大。

选择适合的树脂，采用合理的实验设计和工艺条件才能充分发挥大孔树脂的作用。

要使大孔吸附树脂发挥最好的功能，需要正确选择大孔孔吸附树脂的吸附工艺，通常情况下，需要选择适合的上样液pH值、盐离子浓度﹑吸附和洗脱温度、吸附和洗脱时间、上样液浓度、吸附速率、洗脱剂浓度等工艺条件。

1.4.2大孔吸附树脂的预处理

大孔树脂字使用前需要进行预处理，能够使树脂发挥最好的作用。

预处理的流程简述如下：

（1）以10倍体积的乙醇浸泡树脂24h；

（2）用蒸馏水洗涤，将无水乙醇洗尽，抽滤至滤液无白色物质；

（3）用5%的NaOH，10倍体积浸泡4h用蒸馏水洗涤，抽滤至滤液无白色物质，并用蒸馏水洗至ph接近中性；

（4）用10倍体积的5%的盐酸浸泡1d，用蒸馏水洗涤，抽滤直至滤液无白色物质，并用蒸馏水洗至ph接近中性，备用。

也可采用下列程序：

在洁净的分离柱内，放入已去除外来杂质，体积恒定的大孔吸附树脂加入相当于树脂体积0.4-0.5倍的乙醇浸泡24h，然后用树脂体积的2-3倍的乙醇与水交替反复洗脱交替洗脱2-3次，至最终以水洗脱后，保持分离使用前的状态。

醇洗脱液加水不显混浊。

也可用电导率、荧光和紫外吸收等作为前处理的标准。

1.4.3大孔吸附树脂的再生

使用过的大吸附树脂需要再生处理，以便再次使用，再生处理的过程简述如下：

（1）将用过的树脂用高浓度乙醇浸泡，直至树脂颜色和新树脂接近

（2用蒸馏水洗涤，将无水乙醇洗尽，抽滤至滤液无白色物质

（3）用5%的NaOH，10倍体积浸泡4h