制药工程专业论文对药品微生物限度检查法的思考.docx
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制药工程专业论文对药品微生物限度检查法的思考
毕业论文(设计)
题目:
对药品微生物限度检查法的思考
限度检测
类别:
毕业综合实训总结报告
系别:
药学院
专业班级:
制药工程
学号:
学生姓名:
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时间:
学位论文作者声明
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本学位论文内容不涉及国家机密。
论文题目:
药品微生物限度检查法的思考
作者单位:
作者签名:
年月日
药品微生物限度检查法的思考
摘要
药品微生物限度检查法在我国已经有较高的检验水平,然而微生物限度检查在实际工作中却存在一些问题,对临床用药造成了一定的影响。
对我国药品微生物限度检查法及现状发展进行了阐述,并对我国药品微生物限度检查中存在的问题进行了分析和探讨,提出了一些改进的措施。
关键词
药品;微生物限度检查法;现状;思考
Talkaboutmicrobiologicallimitsondrugs
Abstract
Pharmaceuticalmicrobiallimittestinourcountryalreadyhasahigherlevelofinspection,andmicrobiallimitinspectioninpractice,however,therearesomeproblems,hadacertaininfluenceonclinicaldruguse.Pharmaceuticalmicrobiallimittestandthepresentsituationanddevelopmentofourcountryinthispaper,andtheproblemsexistinginChinesepharmaceuticalmicrobiallimitinspectionareanalyzedanddiscussed,someimprovementmeasuresareputforward.
Keywords
Drugs;microbiallimittest;statusquo;thinking
1前言
微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法[1]。
药品与我们的生活息息相关,药品的安全性、质量将直接影响到消费者的健康和安全,为消费者提供安全、卫生、无污染的药物是每个药学人员需要学习和实践的。
生产、加工、储存、运输、销售药品的过程中,药品都将受到各种因素污染的影响。
随着中国药典中微生物检测的比重越来越大,医药企业纷纷开始重视微生物的检测。
1.1研究目的及意义
药品用于治病救人,但在没有检测的条件下,可能含有各类致病、致死的微生物或元素。
比如药品中会含有,被患者吸入肺部,导致肺部感染的霉菌;含有使人患上败血症的金黄色葡萄球菌;导致肠道疾病的大肠杆菌等。
意识到微生物污染存在的危险,药学人员开始关注药品内微生物含量的检测,为药品安全提供更有力的保障。
微生物由于重量轻、体积小、繁殖能力强、适应性强等特点[2]。
广泛分布于自然界中[3]。
药物也不例外,一些药能产生抗菌性来抑制细菌、真菌的生长,但并不是每一个药物,都能避免药物含有细菌、真菌等微生物,有的微生物产生对人体有益的物质,但大多数药物的微生物会产生污染,不仅影响药物本身的质量、效果,严重的将威胁到人类的生命安全与健康。
因此有必要测试药物的微生物含量,使药物可以在微生物含量安全的范围内进行使用。
1.2概况
1972年我国开始接触药品微生物限度,1995年药典开始收录药品微生物限度,但标准尚未被载入。
在接下来的2000年、2005年,《中国药典》增加了以剂型载入的微生物限度,以及微生物限度检查时的所有方法的验证。
其操作方法包括有以下几项:
平皿法(直接法):
首先,在每个灭菌平皿中注入1ml原液,注意每个稀释级注中需要有2~3个平皿,所有的平板都需要慢慢注入1ml供试液,为了防止倒吸,管内需没有残留液体。
大约15ml注入45℃培养基中,顺时针或逆时针旋转平板混匀。
阴性对照实验:
取1ml实验所需稀释液,放在无菌培养皿中,注入培养基后,需倒置培养,测试结果应该是阴性的,不含有细菌。
霉菌、酵母菌计数平板倒置在23~25℃霉菌培养箱培养。
培养结束后在培养基背面直接用肉眼观察计数。
薄膜过滤法:
实验前,所有实验室设备需消毒,水溶性供试品,应先进行滤膜润湿冲洗,而油类供试品滤膜、滤器需保持干燥。
实验过程,首先对1ml或1g样品的供试液进行过滤,然后用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗,每个培养基必须至少有一个滤膜,冲洗后取出滤膜,细菌面朝平板表面贴于平板上,不允许有气泡或缝隙。
对于其中每一个供试品,都需要有一组阴性对照,即取试验用稀释剂1ml,操作与样品操作相同,阴性均不得长菌。
大肠埃希菌检查:
近年来,抗菌药物已广泛应用[4]。
大肠杆菌已成为医院感染的主要致病性细菌[5]。
大肠杆菌对多种抗菌药物具有耐药性,给临床治疗带来许多限制和竞争。
其检查的具体操作如下流程图所示:
配置培养基及稀释液→供试液的制备→增菌培养(胆盐乳糖)→靛基质试验、荧光检查→检查结果判断→(①双阴性或双阳性→蓝白荧光、玫瑰红色液面;②阴性、阳性→分离提纯→麦康凯琼脂、EMB琼脂平板→观察菌落特征[4])→书面检查记录单
2研究现状
根据我实习的经历我发现,一些医药公司对药品微生物限度检查意识淡薄,他们在检验药品的含量、溶出度时把关较严,但在药品微生物限度检查上却没有严格操作的意识,一般会将送验的药品进行无菌处理,但在抽检的品种中就会出现药品微生物限度不合格的现象。
我在实习的过程中发现,操作人员在实际操作中并不严谨,药典中药品微生物限度检查的相关规定与实际操作存在脱节的现象,其原因在于现存的规定比较笼统,并未对每种药品进行详细的要求,再加上操作人员的理解误差,从而导致实验结果的误差。
2005年新增了药品微生物限度检查方法的验证,然而许多医药企业对此部分的资料较为凌乱,遗漏较多。
有的实验设计不够严谨,有的不够规范,不能反映试验方法的完整性与可行性。
药品微生物限度检查验证工作比较笼统和复杂,但在药品微生物限度检查工作中是至关重要的一部分,不容忽视。
3药品微生物限度检查法的解析
3.1药品微生物限度检查标准的修订
随着药典的不断完善,我国药品微生物限度检查法越来越成熟,在1995年以前刚刚开展的药品微生物限度检查,再到1995年,药典正式开始记载药品微生物限度检测方法,再到2000年药典对大部分化学药制剂、中药制剂的微生物限度的收载,使药品微生物限度开始进入正轨。
2005年,药典利用用药途径进一步提高了药品微生物限度的标准,增加了方法验证的内容,使微生物检测更加科学。
3.2不同药品微生物限度检测法
盐酸克林霉素微生物限度检查:
首先是供试品溶液的配置:
精确称取10g盐酸克林霉素样品,于稀释液(pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液)中溶解,并稀释至100ml,充分振摇均匀,即为供试品溶液。
配置好供试品便可以进行微生物限度检查了,其具体检查项目及操作如下:
需氧菌总数:
在无菌滤器中,用移液管吸取10ml供试品,缓慢加入,同时用过滤器进行过滤,再用100ml的无菌pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,进行淋洗滤膜,需冲洗八次,冲洗完毕取出滤膜,菌面朝上贴于在事先准备好的无菌TSA平板表面,用于需氧菌计数。
在隔水式培养箱中倒置TSA培养基,在30℃~35℃中培养3~5天,培养结束后进行计数,需平行检测。
霉菌及酵母菌:
在无菌滤器中,加入10ml用移液管吸取的供试品,进行抽滤,同样需要用100mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液,进行充分淋洗8次,取出滤膜,菌面朝上贴于事先制备好的SDA平板表面,用于霉菌和酵母菌计数。
霉菌培养箱中倒置SDA培养基,在20℃~25℃中培养5~7天,培养结束后进行计数,需平行检测。
大肠埃希菌:
培养结束后,震摇容器,在100ml麦康凯肉汤培养基中,加入1mlTSB培养液,在42~44℃中培养24~48小时。
然后在麦康凯琼脂培养基平板上进行划线[6]。
划线完倒置在30~35℃下培养18~72小时[7]。
观察菌落外观[8]。
说明:
若平板生长出红色,非粘液型菌落,则表示样品中存在大肠埃希菌,需用合适的生物化学鉴定试验加以确认。
如果生物化学鉴定试验结果呈阴性或平板中未见此类菌落生长,则表明产品符合规定。
甲砜霉素微生物限度检查:
供试品制备:
在无菌的100ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中,加入精密秤取的甲砜霉素10g,振摇使药品混合均匀,将上述溶液置于离心管中,于500r/min离心3min;取离心后的上清液,做1:
10的供试液。
供试液制备完成,便可以开始精心微生物限度检测,具体操作如下:
细菌霉菌及酵母菌计数:
采用薄膜过滤法过滤上述供试液10ml,再用100ml无菌的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液进行冲洗,需冲洗三次,冲洗完毕取滤膜,菌面朝上,贴于玫瑰红钠琼脂培养基平板或营养琼脂培养基平板上,分别作平行试验。
倒置营养琼脂培养基于生化培养箱中进行培养[9]。
30℃~35℃培养三天[10]。
倒置培养玫瑰红钠琼脂培养基于霉菌培养箱,23~25℃培养五天。
大肠埃希菌:
过滤供试液10ml,再取无菌的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液进行冲洗[11]。
冲洗完取滤膜,放置于100ml胆盐乳糖培养液中,在30~35℃中培养18~24小时,之后操作与盐酸克林霉素一致。
瑞格列奈微生物限度检查:
首先进行供试液制备,用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,稀释精确秤取瑞格列奈(REP)样品10g至100ml,振摇使其分散均匀,然后静置5-10分钟,取中间清层为供试液。
限度检查操作如下:
需氧菌、霉菌及酵母菌总数的计数:
取温度不超过45℃的溶化的TSA和SDA培养基15ml左右,注入1ml供试液,混匀、凝固后需倒置培养。
SDA倒置于20~25℃培养七天,TSA需倒置于30~35℃培养五天,并逐日计数,需做空白对照。
大肠埃希菌的检查:
同盐酸克林霉素。
联苯双酯微生物限度检查:
供试液的制备:
取100ml无菌的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液,稀释精确秤取的联苯双酯10g,振摇使其均匀,静置后取其上清液,作为1:
10的供试液。
供试液制备完成后操作如下:
需氧菌、霉菌及酵母菌的计数:
用薄膜过滤法过滤1:
10供试液10ml,再加入100ml无菌的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液,进行冲洗滤膜,冲洗结束后,菌面朝上贴于SDA培养基和TSA培养基上,在培养箱中倒置培养TSA,于30~35℃培养五天,SDA培养基倒置培养,于20~25℃培养箱中培养7天,计数并报告菌落总数,需做空白对照。
大肠埃希菌检查:
采用薄膜过滤法过滤1:
10供试液10ml[12]。
用100ml无菌的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜[13],冲洗结束后,将滤膜放入100mlTSB培养液中,在30~35℃下培养18~24h[14],培养结束,在100ml麦康凯肉汤培养液中,加入1ml培养液进行培养,在42~44℃下培养24~48h[15]。
培养完在麦康凯琼脂培养基上进行划线[16],在30~35℃下培养18~72h,培养完观察菌落外观[17]。
4药品微生物限度检查方法的验证及改进建议
4.1药品微生物限度检查法验证
为了使微生物限度检查法更加完整、科学和严谨,《中国药典》规定:
在建立供试品的微生物限度检查法或检查法的检验条件发生改变可能影响检查结果时,应对检查法的可靠性进行方法验证。
根据产品的性质,合理地进行实验,并对实验结果进行三次实验,以减少误差,使实验结果更加准确。
包括菌落计数法确认、菌液制备、计算回收率、实验方法等,然后回收率在0.7以上。
微生物的限制是很麻烦的,许多因素都会导致测试结果的误差。
其中包括有:
操作环境的影响、培养基的影响、设备及用具的影响、菌落计数误差、供试液制备过程影响等,所以对限度检查方法进行验证是非常重要的。
试验具体操作如下:
首先需用0.9%的氯化钠溶液稀释菌种制作菌液,包括有金菌、铜绿、枯草、白念。
根据中国药典规定,需进行菌数测定验证和控制菌检查验证,需要进行五组平行试验开测定菌数。
结果表明,该控制群的活菌群和4种样本群的存活结果均为5次试验的平均回收率,通过对三种细菌的计数,得出平均细菌回收率,白色念珠菌的回收率为霉菌的回收率,在5个平行试验中进行了控制细菌试验。
若采用常规的方法无法检出控制菌,则采用药典提供的4种前处理方法。
进行供试液的前处理,再重做验证试验[18]。
4.2药品微生物限度检查法中的问题及其改进建议
药品微生物限度检查操作繁琐,过程复杂,中间很多步骤都会存在错误或者污染。
现在就可能对药品微生物限度检查造成影响的因素进行分析和建议。
4.2.1实验室环境的影响
药品微生物检测为避免不相关的因素对实验结果的干扰,实验室需建在污染源较少的地方,需做到周边无垃圾处理站、无公厕、无粉尘。
我实习的公司由于实验室扩建,在微生物实验室周围进行大面积拆迁,粉尘对药品微生物限度检查结果造成了很大的干扰。
面对此类问题,我们需在取样时进入实验室前后用密封袋将样品进行密封保存。
在进入洁净区的无菌操作台前,不得将样品开封,同时无菌操作台需在紫外下灭菌半小时以后方可进入实验,以避免其他菌类对样品的污染。
4.2.2培养基的影响
在我实习的过程中,我发现药品检测大部分用的是固体培养基,固体培养基有的培养时间较长,会出现干裂,结块,变色等问题,对实验结果造成很大影响。
面对类问题,我们首先必须严格按照药典规定,将菌种或实验用培养基放在在相应的培养箱内进行培养,并在规定的时间内取出计数或使用。
在计数或使用前,先进行外观观察,如发现培养基有异,需重新进行实验。
损坏的培养基以及使用完的培养基需及时灭菌处理。
为避免细菌繁殖,不得存放过夜[19]。
4.2.3灭菌方法
药品微生物限度检查所使用的所有实验用具、培养基、洁净服等均要灭菌,而如果灭菌方式不对,则会对实验结果造成影响。
为避免此类问题发生,我们需知道哪些实验用品需要湿热灭菌,哪些需要干热灭菌。
如,镊子、玻璃平皿、试管、盛放平皿的不锈钢桶等,都需180℃干热灭菌150分钟,培养基、缓冲液、移液管、过滤薄膜、洁净服等则需湿热灭菌。
湿热灭菌在灭菌前需贴上湿热灭菌指示纸,若纸变黑则证明灭菌成功,否则可能是仪器漏气或者故障,需重新灭菌并进行仪器验证,湿热灭菌里不同的仪器与培养基灭菌的时间不一样,如培养基、缓冲液类需120℃灭菌15分钟,而洁净服、过滤薄膜、移液管则需120℃灭菌30分钟。
4.2.4实验人员的影响
人员是药品微生物限度检查的一个重要污染源,任何细微的不当操作都会引起实验的失败。
所以实验人员需建立较强的无菌观念,在实验室不得随意讲话、咳嗽、打喷嚏等以避免空气污染,同时在实验前需进行洗手消毒,更换无菌洁净服,实验过程中不得随意进出走动等。
每一步都按规定的标准试验操作来实验。
实验需在规定时间内尽快完成,长时间的操作会导致细菌污染的几率增加[20]。
5前景与展望
现代医学水平越来越发达,药物品种越来越多,医药行业对微生物检查的标准,越来越严厉,早在没有微生物检测的年代,因为药物感染导致患者死亡、重症感染的案例很多,所以人们对药品微生物污染的问题上越发关注。
不仅在药品领域微生物检测占有重要的地位,在食品领域同样不可小觑,食品和我们的生活同样息息相关,微生物不仅会影响到药品质量,也会影响到食品的质量、口味、好坏等。
在很多文献中表明,我国在微生物检测方面的要求,远落后于很多西方国家,但我国在微生物领域的相关规定,也在进行逐步的完善。
在未来的发展中,我们必须不断创新,提高综合素质,将微生物检测技术使用的更好,将微生物检测技术运用到更多的领域中。
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致谢
首先要感谢我的论文指导老师xx,她是一位认真负责老师,在整个毕业论文的撰写过程中,她对我的论文进行了认真的指导和详细的修改,从她的身上我学到了很多,严谨认真、一丝不苟的态度。
我将永远记住她曾经给予过我的教导,我要向指导老师表达我内心最崇高的敬意和最衷心的感谢!
同时我还要感谢所有代课老师和辅导员,在我大学四年的学习和生活过程中,这些老师给予了我很多的教导和很大的帮助,从他们身上我学到了很多做人的道理,将使我受益终生。
感谢我的家人和好友,他们的关爱和支持永远是我前进的最大动力,在任何时候,他们都给予我最大的鼓励和支持,我感谢他们!
最后,向审阅我论文和参加答辩的老师们表示衷心的感谢,感谢你们抽出宝贵的时候参加我的论文答辩会,感谢你们对论文不当之处提出的宝贵意见和建议。
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