壳聚糖酶高产菌株选育及高效诱变生物工程本科论文.docx
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壳聚糖酶高产菌株选育及高效诱变生物工程本科论文
本科生毕业论文(设计)
题 目
壳聚糖酶高产菌株选育及高效诱变
姓 名
王宇学号2011413283
院 系
生命科学学院
专 业
生物工程
指导教师
刘金峰职称副教授
2015年5月18日
曲阜师范大学教务处制
目录
摘要…………………………………………………………………………………1
关键词………………………………………………………………………………1
Abstract……………………………………………………………………………1
Keywords…………………………………………………………………………1
引言(或绪论………………………………………………………………………1
1材料与方法……………………………………………………………………3
1.1菌株……………………………………………………………………………3
1.2培养基…………………………………………………………………………3
1.3曲霉CJ22一3菌株的UV和60Co诱变………………………………………3
1.4还原糖的测定………………………………………………………………3
1.5壳聚糖酶活力的测定………………………………………………………3
2结果与讨论……………………………………………………………………3
2.1菌株诱变的结果……………………………………………………………3
2.2发酵培养基的优化…………………………………………………………4
2.2.1单一碳源对壳聚糖酶产率和菌体生长的影响…………………………4
2.2.2复合碳源对产酶影响……………………………………………………4
2.2.3氮源对产酶的影响………………………………………………………4
2.2.4金属离子和KH2PO4对产酶影响……………………………………………4
2.2.5对碳氮源的正交实验优化…………………………………………………5
2.2.6表面活性剂对产酶的影响…………………………………………………5
2.3发酵条件的优化……………………………………………………………5
2.3.1接种量对产酶的影响………………………………………………………5
2.3.2溶氧对菌株产酶的影响……………………………………………………5
2.3.3温度、培养基起始声和发酵时间对产酶的影响……………………………6
3结论……………………………………………………………………………7
3.1壳聚糖酶选育及诱变…………………………………………………………7
3.2壳聚糖酶的高效诱变…………………………………………………………7
致谢…………………………………………………………………………………7
参考文……………………………………………………………………………8
壳聚糖酶高产菌株的选育及高效诱变
生物工程专业学生王宇
指导教师刘金峰
摘要:
从曲师大实验楼后采集的土样中分离到4株产壳聚糖酶的菌株,经过摇瓶复筛,发现菌株曲霉CJ22-3产酶效果最好。
以自筛曲霉CJ22-3为出发株,经紫外线和60Co高效诱变处理,获得1株壳聚糖酶高产菌株CJ22-326,经正交实验初步优化了其液态产酶培养基:
壳聚糖1.5%,麸皮2%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.2%,MgS040.05%,Tween一800.05%,pH5.5。
优化的发酵条件为:
装液量75mL/250mL三角瓶,摇床转速150r/min,发酵温度为300C,发酵时间为96h。
在此条件下,CJ22-326产酶活力为3.06U/mL
关键词:
选育;发酵条件;壳聚糖酶;高效诱变
TheChitosanasesHighyieldstrainsOf
Breedingand high mutation
Studentsmajoringinbiologicalengineeringwangyu
Tutorliujingfeng
Abstract:
FromQufuNormalUniversityexperimentaftercollectingthesoilsamplesisolated4strainsofmicrobeschitosanase.Aftershakingflaskrescreening.ItisfoundthatthestrainAspergillusCJ223-producingenzymeeffectbest. ToscreenAspergillusCJ22-3forstartingstrains,treatedbyUVand60Comutation,1strainofshellofgettingXylanaseProducingStrainCJ22326-,throughorthogonaltests,thepreliminaryoptimizationoftheliquidfermentationmedium:
1.5%chitosan,thedrumskin2%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.2%,MgS040.05%,0.05%Tween80,pH5.5. Optimizationoffermentationconditionsforliquidloadingon75ml/250mLtrianglebottle,shakingspeed150r/min,fermentationtemperatureforthe300C,fermentationtimefor96h. Underthiscondition, theCJ22-326enzymeactivitywas3.06 U /mL
Keywords:
Thefermentationconditionsof chitosanase;Breeding;Mutagenesis; Efficient.
引言:
壳聚糖(chitosanase)是由D-氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接起来的生物多糖,可在酸性溶液中溶解,反应活性比甲壳素和纤维素都高[1]。
壳聚糖是自然界中唯一的天然碱性多糖,研究发现,其降解产物壳寡糖(chitooligosaccharide)具有良好的水溶性、易被生物机体吸收且无毒、无热源、无变异性,并具有抗癌、抑菌等生理活性,在农业、食品、医药等领域的应用广泛[2]。
目前,在壳聚糖的降解方法中酶降解法以其降解过程容易控制、反应条件温和以及对环境无污染等优点而成为壳聚糖降解的首选途径。
壳聚糖是几丁质脱去部分乙酰基的产物,具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒性以及易成膜性,因而在众多领域得到了广泛应用。
但壳聚糖分子质量较大,水溶性差,在人体内不易吸收,使其应用受到一定限制[3]。
壳寡糖是壳聚糖的降解产物,是聚合度为2~20的低聚糖,具有水溶性好、易吸收等优点以及许多独特的生理活性和功能[4,5]。
如能提高机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长、活化增殖人体肠道内双歧杆菌,同时还具有抗菌防腐[6,7]、保水保湿等功能,在医药、食品、化妆品等领域的应用前景备受瞩目。
壳寡糖的制备可分为化学降解法、物理降解法和酶降解法[8,9],与目前常用的化学降解法相比,酶法生产壳寡糖的反应条件温和易控,寡糖得率高、功能性更强,不易造成环境污染,是壳寡糖制备的主要研究方向。
因此,对壳聚糖酶的研究已成为几丁质和壳聚糖研究领域中较为活跃的分支之一[10]。
壳聚糖酶(chitosanase,EC3.2.1.132)是以内切方式催化水解部分乙酞化壳聚糖中的β-1,4-氨基葡萄糖普键的酶。
目前已经从细菌(CBacillus,Myxobacter,Enterobacter)放线菌(Streptomyces,Nocardioides),霉菌(Aspergillus,Penicillium),病毒(Chlorellavirus)研究人员通过人工诱变处理来获得高产突变株。
王艳等[11]以假单胞菌Y8.0为出发菌株,分别通过亚硝基肌、曳。
和UV诱变3种诱变方法进行处理,发现UV诱变效果最好,得到突变菌株假单胞菌Y8,其所产壳聚糖酶活力达到3.OU/mL,酶活力提高近6倍,并具有较好的遗传稳定性。
实验筛选获得一株产壳聚糖酶菌株,初步鉴定为烟曲霉菌,以该菌株为出发菌株,采用紫外诱变的方法对其进行遗传改良,旨在筛选获得新的高产壳聚糖酶突变菌株。
1材料与方法
1.1菌株
曲霉CJ22一3,自筛菌种。
曲霉CJ22一326,CJ22一3经紫外和60Co诱变得到。
1.2培养基
(1)斜面保藏培养基:
马铃薯琼脂培养基。
(2)平板筛选培养基:
胶体壳聚糖0.5%,葡萄糖2%,酵母膏0.1%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.2%,MgS040.05%,琼脂2%,pH5.5-6.0。
(3)基础培养基A:
胶体壳聚糖1%,酵母膏0.1%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.2%,MgS040.05%,pH5.5。
(4)摇瓶筛选培养基B:
胶体壳聚糖1%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.2%,MgS040.05%,麸皮1%,pH5.5。
(5)优化培养基C:
胶体壳聚糖1.5%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.2%,MgS040.05%,麸皮2%,pH5.5。
1.3曲霉CJ22一3菌株的UV和60Co诱变
诱变筛选程序为:
曲霉菌种抱子紫外照射1min暗培养增殖叶涂布平板培养叶挑取透明圈大的菌落接出斜面培养叶摇瓶筛选。
对正突变株CJ22一311进行第2次60Co诱变,诱变剂量为500、700、900Gy,涂布平板培养叶挑取透明圈大的菌落接出斜面培养叶摇瓶复筛获高产株CJ22一326。
1.4还原糖的测定
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法。
1.5壳聚糖酶活力的测定
按参考文献[10]的方法进行,在1mL0.5%壳聚糖(0.2mo/L,pH5.6醋酸缓冲液)中加入1mL适当稀释的酶液,于37℃保温15min,沸水浴10min灭酶,过滤。
DNS法测定酶解液中的还原糖(以氨基葡萄糖计),酶活定义:
每分钟催化生成相当于1mol氨基葡萄糖还原糖所需的酶量为一个酶活单位。
2结果与讨论
2.1菌株诱变结果
以曲霉CJ22一3为出发菌株,采用15W紫外灯于30cm的距离,照射1min后,致死率为92%,在添加产酶阻遏剂葡萄糖的平板上分离得到CJ22一311菌株,产酶比出发株CJ22一3提高31%,达1.64U/mL。
以此作为再次诱变出发株,对CJ22一311进行第2次60Co诱变,诱变剂量分别为500,700,900Gy,经700Gy照射后,致死率为90%,在含2%葡萄糖
表1单一碳源对壳聚糖酶产率和生长的影响
碳源葡萄糖乳糖氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖壳聚糖淀粉麸皮
菌体量/g。
L-13.452.782.342.021.952.72.41
酶活/L。
mL-10.010.0380.050.0370.920.030.06
平板上仍能产透明圈的突变株较少,减轻了摇瓶复筛的工作量,最终获得CJ22一326菌株,产酶达1.93U/ml,为出发菌株CJ22一3的1.54倍。
将诱变得到的高产菌株与原始菌株一起连续转接8代;每传一代用摇瓶发酵液测定酶活。
试验结果表明菌株CJ22一326产酶能力稳定在1.9U/ml左右。
2.2发酵培养基的优化
2.2.1单一碳源对壳聚糖酶产率和菌体生长的影响
文献报道,大部分微生物产壳聚糖酶为诱导酶,底物的存在是诱导酶产生的必要条件,壳聚糖、氨基葡萄糖、乙酞氨基葡萄糖等可以做诱导物来诱导产酶。
用同样量的6种碳源取代基础培养基A中碳源,结果见表1。
CJ22一326菌株壳聚糖酶的合成与分泌需要有壳聚糖的诱导,是一典型的诱导酶,氨基葡萄糖、乙酞氨基葡萄糖做碳源,不利于诱导产酶。
针对菌株CJ22-326,壳聚糖才是高效诱导剂,但由于壳聚糖分子中氨基的存在,在酸性条件下表现出抑菌性,故只是单独以它作碳源时,抱子萌发受抑制,菌体量小,影响酶活。
2.2.2复合碳源对产酶影响
考虑到菌体的生长和对壳聚糖酶诱导2方面的因素,选取壳聚糖和鼓皮复合碳源代替单一碳源。
因麸皮是富含多糖、蛋白质、维生素和矿物质等的常用培养基成分,在添加1%的麸皮后,不同浓度的壳聚糖对产酶的影响,结果见表2。
壳聚糖的添加量对壳聚糖酶的生产有很大影响,壳聚糖浓度达到2%时,酶活达到最高,继续增加用量,有降低的趋势,这可能由于壳聚糖浓度高,粘度大,影响传质和溶氧。
表2壳聚糖浓度对壳聚糖酶产率的影响
壳聚糖浓度/%0.511.522.5
酶活/U.mL-11.211.92.272.462.35
选取壳聚糖浓度为1%,再改变麸皮浓度,结果见表3,可看出麸皮浓度对酶活的影响同壳聚糖对酶活影响相似。
当麸皮的浓度为2%时酶活达到最大;再增加时,发酵液的残糖高,可能产生了阻遏。
表3麸皮浓度对壳聚糖酶产率影响
麸皮浓度/%123
酶活/U.mL-11.922.352.24
2.2.3氮源对产酶的影响
进行不同氮源的实验时,培养基碳源选取1%壳聚糖、2%麸皮,再分别添加0.2%的不同氮源,包括4种有机氮源:
尿素、胰蛋白陈、酵母膏、牛肉膏和3种无机氮源:
KN03,NH4N03,(NH4)2SO4。
结果表明,在所选氮源中,无机氮源(NH4)2SO4;较有机氮源和复合氮源(0.1%(NH4)2SO4+0.1%酵母膏)更有利于壳聚糖酶的产生。
比较适宜的(NH4)2S04;浓度为0.2%。
表4添加氮源对产酶的影响
氮源尿素胰蛋白胨酵母膏牛肉膏KNO3NH4NO3(NH4)2SO4(NH4)2SO4+酵母膏
酶活/U.mL-11.932.051.972.011.842.062.422.36
2.2.4金属离子和KH2PO4对产酶影响
金属离子是微生物生命活动所必须的,以0.05%的Zn2+、Fe2+、Co2+、Li2+、Ca2+,Mn2+等金属离子的无机盐代替筛选培养基中的Mg2+。
实验结果表明,在所用的培养基B中,添加以上金属离子的无机盐对产酶影响不大,这可能因为鼓皮中已含有足够量的无机金属离子,无需再另外添加。
选择0.1%、0.2%、0.3%三个不同浓度的KH2PO4,该项实验结果表明,KH2PO4在此浓度范围对产酶影响不大,0.2%浓度时略好,说明该菌株发酵时对无机盐和磷的要求不高。
2.2.5对碳氮源的正交实验优化
研究了3个主要营养源,即壳聚糖、麸皮和(NH4)2SO4的不同配比对菌株产酶的协同效应。
采用正交表L9(34)的设计方案,试验数据和处理结果见表5。
结果表明,影响最大的因素为壳聚糖的浓度,其次是氮源和麸皮的浓度。
最佳参数组合为A1B2C1,即壳聚糖2%,麸皮2%,(NH4)2SO40.2%。
考虑到原料的利用率,壳聚糖浓度以1.5%为宜。
表5正交试验和数据处理结果
试验号A(壳聚糖)B(麸皮)C(NH4)2SO4酶活力/U.mL-1
11(1.5%)1(1%)1(0.2%)2.81
212(2%)2(0.1%)2.61
313(3%)3(0.3%)2.56
42(1.5%)122.39
52232.58
62312.40
73(1%)131.95
83212.30
93322.17
Κ12.662.382.50
Κ22.462.492.39
Κ32.142.372.36
RO.520.120.14
2.2.6表面活性剂对产酶的影响
表面活性剂用于酶的发酵生产受到广泛重视。
一般认为表面活性剂可强化传质传氧,提高细胞膜渗透性,使酶易向胞外分泌。
实验表明,在优化培养基C中添加0.1%以下的TWeen一80表面活性剂,可提高酶活。
添加0.05%Tureen一80比对照提高酶产量11%。
表6表面活性剂对产酶的影响
TWeen一80浓度/%0.020.050.080
酶活/U。
mL-12.913.062.842.75
2.3发酵条件的优化
2.3.1接种量对产酶的影响
在一定的培养基中,接种量过低时,菌体生长缓慢,发酵周期长,影响产酶。
接种量过高时,发酵周期短,同样影响产酶。
分别采用接种量为3%、5%、8%、10%进行培养,其中以接种量8%为最佳。
2.3.2溶氧对菌株产酶的影响
通过改变摇瓶装液量和摇床转速试验CJ22-326对通风量的要求,结果见图1。
250mL的三角瓶中装液量为75mL时最佳。
当摇瓶转速为150r/min时产酶最好,超过180r/min,酶活下降。
可见过量的溶氧对菌株合成酶也不利。
2.3.3温度、培养基起始声和发酵时间对产酶的影响
培养温度达32℃时,发酵周期短,但产酶不高;温度过低(28℃),则发酵时间延长,酶活力也不高。
温度以30℃为宜。
培养基的pH影响细胞膜表面带电基团的解离及其微观结构,进而影响营养物的吸收及代谢物的分泌,导致微生物的生长和代谢发生变化。
另外由于壳聚糖的特殊性,在pH>6.5时不溶解。
我们试验了培养基C起始pH在4.5~6.5之间和发酵89h时的pH和酶活,结果显示产酶培养基的适宜起始声值在5.0~6.0之间。
声为5.5时酶活力最高,见表7。
微生物从生长到产酶有一过程,随时间而变化。
我们发现接种36h后形成了大量的菌体,此时产酶很低,而还原糖含量很高,发酵液声下降,72h后,菌体数量达到平衡,培养时间进一步延长,菌体数量不再增加,发酵液pH又回升,壳聚糖酶的合成与分泌达到平衡,当到达96h左右,酶活达到最高,结果见图2。
表7不同起始pH对产酶的影响
起始pH4.04.55.05.56.06.5
终了pH3.723.754.065.046.166.99
相对酶活/%7076851007873
3结论
3.1壳聚糖酶选育及诱变
以曲霉CJ22-3为出发株,经紫外诱变和60Co诱变,最终获得CJ22一326,其产酶活力为出发株的1.54倍,经发酵条件优化后产酶达3.06u/mL,高于参考文献[11]中的报道。
产酶培养基的最佳配比为:
胶体壳聚糖1.5%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.2%,MgS040.05%,麸皮2%,0.05%Tween一80,pH5.5。
优化的发酵条件为:
装液量75ml/250ml三角瓶,摇床转速150r/min,发酵温度和时间分别为30℃和96h。
CJ22一326能在添加2%葡萄糖的壳聚糖培养基平板上仍产生透明圈,说明它已解除了部分阻遏。
3.2壳聚糖酶的高效诱变
诱变育种可以显著改善产壳聚糖酶菌株的产酶能力,其中紫外线是一种强的诱变剂,能使DNA上2个相邻的胸腺嘧啶之间形成二聚体,从而使其在复制过程中出错产生突变。
聂明等[14]利用的出发菌株经30W紫外灯诱变处理,筛选获得了1株遗传性能稳定的产壳聚糖酶突变菌株,其酶活达3.47U/mL,比出发株提高近2倍。
郑连英等对产壳聚糖酶菌株Peni-cilliumsp.ZD-Z1进行紫外诱变,摇瓶实验测定其粗酶液活性为0.58U/mL使得壳聚糖酶活力提高了3.8倍。
实验筛选获得一株产壳聚糖酶菌株(CX01),形态学初步鉴定为烟曲霉(CAspergillusfumigatus)。
以该菌株为出发菌株,经紫外辐射诱变筛选获得4株突变株CXO1-7、CXO1-8、CXO1-18、CXO1-22,酶活力分别为0.9557U/mL、0.8624U/mL、0.8628U/mL、0.8901U/mL,产酶活力分别比对照提高50.25%、36.30%、35.65%和39.95%。
经连续5次传代测试,其遗传性状稳定。
方祥年等以B.bassiana1316菌株作为出发菌株,经过紫外线和高能电子束注入诱变,筛选得到突变株B.bassiana1316-V1,其产壳聚糖酶能力提高为起始菌株的近16倍,达到2.32U/mL。
因此,实验获得菌株还可结合其他诱变方式,进一步提高产酶活力,同时还应对菌株的发酵产酶条件和工艺进行优化。
致谢
本人的学位论文是在我的指导老师刘老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。
他从课题的选择到项目的最终完成,刘老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。
导师渊博的专业知识,严谨的治学态度,精益求精的工作作风,诲人不倦的高尚师德,严以律己、宽以待人的崇高风范,朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。
不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法,还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。
本论文从选题到完成,每一步都是在导师的指导下完成的,倾注了导师大量的心血。
在此,谨向刘老师表示崇高的敬意和衷心的感谢!
本论文的顺利完成,离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。
时光匆匆如流水,转眼便是大学毕业时节,春梦秋云,聚散真容易。
离校日期已日趋临近,毕业论文的的完成也随之进入了尾声。
从开始进入课题到论文的顺利完成,一直都离不开老师、同学、朋友给我热情的帮助,在这里请接受我诚挚的谢意!
最后,再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心地感谢!
参考文献:
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