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酶的提取及其活性影响
青岛科技大学
本科毕业设计(科技论文)
酪氨酸酶的提取及其催化活性研究
影响唾液淀粉酶活性的因素
题目__________________________________
__________________________________
指导教师__________________________
辅导教师__________________________
学生姓名__________________________
学生学号__________________________
112
应用化学
化学
____________________院(部)____________________________专业________________班
2014
14
11
______年___月___日
酶的提取及其催化活性研究
摘要
绝大多数酶的化学本质是蛋白质,本文从酶活性的定义出发,论述了酶的种类、特性以及影响酶活性的因素,酶在人们的生产、生活中均有广泛应用,探讨酶的特性对研究酶的人工合成有积极意义,通过与酶促反应速率的影响因素的比较,阐释影响酶活性的因素,来帮助我们正确理解酶活性以及理解酶活性的影响因素。
Thechemical natureof most enzymes areproteins, fromthedefinition ofenzymeactivity of enzyme, discussesthe types, characteristicsand factorsaffectingenzymeactivity, enzyme are widelyused in people'sproductionandlife, hasapositivemeaning toexplorethe propertiesoftheenzyme to studyenzymatic synthetic, through influenceand enzymaticreaction therateoffactorcomparison, explainsthe factorsaffectingenzymeactivity, tohelp ustocorrectlyunderstandthe enzymeactivityand enzymeactivity factor influenceunderstanding.
关键词:
酶;活性;影响因素
1.综述
1.1酶的简介
酶(enzyme)是由生物细胞合成的、对特定底物(substrate)起高效催化作用的蛋白质,是生物催化剂。
生物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。
只要有生命活动的地方就有酶的作用,生命不能离开酶的存在。
在酶的催化下,机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着;同时又在许多因素的影响下,酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。
生物体的许多疾病与酶的异常密切相关;许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。
随着酶学研究的深入,必将对人类社会产生深远影响和作出巨大贡献。
酶的化学本质是蛋白质。
结构上,同样具有一、二、三级结构,有些酶还具有四级结构。
分子的化学组成上,有单纯酶和结合酶之分。
单纯酶分子是仅由蛋白质构成的酶,不含其他物质,如脲酶、活化蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等等。
结合酶分子是由蛋白质分子和非蛋白质部分组成,前者称为酶蛋白(apoenzyme),后者称辅助因子(cofactor)。
辅助因子是金属离子或有机小分子。
酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物称全酶(holoenzyme),酶蛋白和辅助因子各自独立存在时,均无催化活性,只有全酶才有催化活性。
在酶促反应中酶蛋白决定着反应的专一性和效率,而辅助因子则决定着反应的种类和性质。
辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度和作用特点,一般分为辅酶(coenzyme)和辅基(prostheticgroup)。
辅酶是指辅助因子与酶蛋白结合松弛,没有固定的组成比,往往可用透析或超滤法除去,在反应中作为底物接受质子或基团后离开酶蛋白,参加另一酶促反应并将所携带的质子或基团转移出去,或者相反。
而辅基是指与酶蛋白结合比较紧密,与酶蛋白有一定的组成比,不能通过透析或超滤法除去,在反应中辅基不能离开酶蛋白。
辅助因子中大部分是金属离子,约占2/3。
小部分是稳定的有机小分子。
常见的金属离子有K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Cu2+(Cu+)、Zn2+、Fe2+(Fe3+)等。
金属离子以辅基出现的称金属酶,以辅酶出现的称金属激活酶。
金属辅助因子的作用是多方面的,或者作为酶活性中心的催化基团参与催化反应,传递电子;或者作为连接酶与底物的桥梁,便于酶对底物起作用;或者是稳定酶的构象所必需的;或者中和阴离子,降低反应中的静电作用等。
有机小分子的辅助因子,主要是参与酶的催化过程,在反应中传递电子、质子或一些基团。
酶分子中能与底物作用或结合形成酶-底物中间配合物的区域称酶的活性中心。
对于结合酶而言,辅酶(辅基)分子或分子中的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。
酶既具备一般非生物催化剂的加快反应速度的功能,又具有一般催化剂所不具备的生物大分子的特征。
酶与一般非生物催化剂相比,具有以下几个特点:
1、酶的主要成分是蛋白质。
它具有表现活性和专一性所必需的空间结构,以提供反应中心。
由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而失活,所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的,如人体中的各种酶促反应,一般都在体温(37℃)和pH约为7的条件下进行。
2、酶促反应所需的活化能较低。
如使1mol蔗糖水解所需活化能高达1.34MJ,用H+离子作催化剂时活化能降至87.9KJ,若用蔗糖酶催化时只需39.4KJ。
3、酶的催化效率非常高。
酶的催化效率通常比非催化反应高108~1020倍,比一般非生物催化剂高107~1013倍。
如存在于血液中能催化H2CO3分子分解的碳酸酐酶,它的催化效率非常高,每一分子每分钟可以催化1.9×107个H2CO3分子分解。
正是因为血液中有这样高效率的酶,才能及时完成排放CO2的任务,维持血液的正常生理pH值。
4、酶具有高度的专一性。
酶对所作用的底物有严格的选择性,每一种酶只能对某一类物质甚至只对某一种物质起催化作用,这是一般非生物催化剂所无法比拟的。
影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH、温度和抑制剂等。
在酶浓度恒定的情况下,增加底物的浓度,可以提高酶促反应的初速度。
当底物浓度增至某一限度后,反应初速度就不再随底物的浓度而变化,而是逐渐趋近某一极限值,这个极限值称为最大速度(Vmax)。
酶的以上特性已引起化学工作者的极大兴趣,如酶正被作为分析试剂、探针得到应用;生物酶的化学模拟已广泛开展,将为研制高性能的工业催化剂奠定基础。
酶的电化学研究的开展还开辟了生物电化学的新领域。
酶化学是一门交叉学科,对其研究具有广阔的前景。
酶促反应动力学是酶化学的主要内容之一,这方面的研究具有重要的理论和实践意义。
1.2课题的研究目的及意义
酪氨酸酶的作用底物具有一定的广谱性,并且其对底物邻位羟基的催化具有高度的特异性,因而在催化合成有重要价值的化合物上,酪氨酸酶引起很多科学家的关注。
酪氨酸酶可以催化单酚和二酚形成的醌类化合物在水溶液中不稳定,经过一系列催化反应,可自身聚合或与其它物质(有机胺类化合物等)聚合反应形成不溶于水的大分子物质而沉淀。
因此酪氨酸酶不仅除去酚类物质,还能去除其它多种有机物,如有机胺、有机氯化合物等[1,2]。
现利用酪氨酸酶处理工业废水的技术已经成熟。
可以采用电流法测定酪氨酸酶的活性,因此,可以将酪氨酸酶做成酶电极用于检测水环境中是否含有有毒物质[3]。
酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶。
近年来的研究表明,黑色素在防紫外线辐射、清除自由基、作为无定形半导体、化妆品、以及生物杀虫剂的光保护剂等方面都具有广阔的应用前景[4]。
酪氨酸酶的抑制剂可被作为化妆品中的增白剂如熊果甙和曲酸,因此可以以酪氨酸酶作为研究对象寻找更好的美白剂[5-9]。
同时,酪氨酸酶激活剂如一些中药的提取物则被用于治疗白化病和白癫疯等疾病[10]。
编码酪氨酸酶的基因(melO)的启动子是个非常强的启动子,可用于对弱启动子的研究。
而且通过基因融合技术,可以用melO调控合成大量高纯度的蛋白,如Hyper2protein的生成[11]。
酪氨酸酶基因在基因工程中,可以作为一种很好的基因标记。
因此,老鼠、兔子都可以作为生物工程中很好的模式生物。
酪氨酸酶基因突变会导致形成多种疾病,如白化病,黑色素瘤等。
所以近年来,对酪氨酸酶的研究已转向色素障碍性疾病、黑色素瘤、白化病及早发性老年痴呆疾病的应用上。
因此,对酪氨酸酶的进一步研究,不仅能为临床治疗上述疾病寻找合适药物奠定理论基础,也为阐明这些疾病的发生机理提供理论依据。
2.实验部分
酪氨酸酶的提取及其催化活性研究
2.1实验原理
酪氨酸是一种以Cu+或Cu2+为辅助因子的全酶,能催化空气中的氧对多巴的氧化反应。
催化过程可以通过多巴转换反应过程的颜色变化来监测,通过测定吸光度随时间的变化来求的酶的活性。
酪氨酸酶可用比色法测定。
由于多巴转变成多巴红速率很快,在转到下一步产率慢得多,故可在酶存在下,测定多巴转变为多巴红的速率而测定酶的活性(可用吸光度对时间作图,从所得的直线斜率求酶的活性)。
酶的活性计算:
一般定义在优化的条件下(pH、离子强度),25℃时在1min内转化1μmol底物所需要的量为酶的活性单位。
通过下式可计算出所用的酶的活性:
α=ΔA*106/KtV
式中:
α为所用溶液的酶的活性,ΔA为最大吸收处吸光度的变化,t为时间,κ为多巴红的摩尔吸收系数,V为加入的酶体积。
进而计算出所用原料中的酶的活性:
A=aVo/m
式中:
A为原料中酶的活性,Vo为原料所得的酶溶液的总体积,m为原料总质量。
本实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并测定其活性,使同学们对酶有个初步的认识。
当土豆、苹果、香蕉或蘑菇受损伤时,在空气作用下,很快变为棕色,这是因为它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶,酶存在于物质内部,当内部物质暴露于空气中,在氧的参与下将发生如下反应,生成黑色素。
图1酶参与的多巴转换反应
2.2实验仪器与试剂
2.2.1实验仪器
分光光度计、离心机、研钵、食物研磨机、恒温水浴、纱布、计时秒表、冰箱等。
2.2.2实验试剂
酪氨酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、新鲜土豆
2.3实验步骤
1、溶液配制
0.10mol•磷酸缓冲溶液L-1(pH=7.2);
0.10mol•L-1磷酸缓冲溶液(pH=6.0);
0.01mol•L-1的多巴溶液;
2、酶的提取
在研钵中放入10g经过冰冻的切碎了的土豆(或苹果),加入7.5mL磷酸缓冲溶液,用力研磨挤压(约1min).用两层纱布滤出提取液,立即离心分离(约3000rpm,5min)。
倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中.提取液为棕色,在放置过程中不断变黑.有条件的话,可以经sephedex柱进一步纯化。
3、多巴红溶液的吸收光谱
取0.4mL已稀释过的土豆提取液,加2.6mLpH=6.0的缓冲液.加2mL多巴溶液,摇匀。
反应约10min后,使用1cm比色池于扫描分光光度计上进行重复扫描,即可获得多巴红的吸收光谱.若使用自动扫描分光光度计,可从混合开始以时间间隔为1min进行连续扫描,可以观察到吸光度随时间增加的现象。
表1多巴红溶液A-t数据
t
A
A(校准)
0
2.024
2.009
30
2.891
2.876
60
2.01
1.995
90
2.01
1.995
120
1.988
1.973
150
1.978
1.963
180
1.971
1.956
210
1.968
1.953
4、酶的活性测量
取2.5mL上述提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释至10mL比色管中,摇匀.取0.1mL稀释过的提取液于10mL比色管中,加入2.9mLpH=6.0的缓冲溶液,再加入2mL多巴溶液,同时开始计时,用分光光度计在480nm处测量吸光度。
开始6min内每分钟读1个数,以后隔2min读1个数,直至吸光度变化不大为止.取0.2mL,0.3mL,0.4mL已稀释过的提取液重复上述实验(注意总体积为5mL,每次换溶液洗比色皿只能倒很少量溶液洗1次)。
表2不同酶加入量的吸光度随时间变化数据表
时间/min
0.1mL提取液
0.2mL提取液
0.3mL提取液
0.4mL提取液
0
0.073
0.144
0.269
0.197
1
0.102
0.226
0.369
0.339
2
0.127
0.283
0.464
0.467
3
0.151
0.345
0.550
0.580
4
0.172
0.400
0.629
0.679
5
0.193
0.451
0.698
0.766
6
0.232
0.500
0.761
0.841
8
0.262
0.581
0.867
1.001
10
0.297
0.645
0.965
1.119
12
0.338
0.701
1.023
1.189
14
0.354
0.745
1.072
1.234
16
0.369
0.784
1.104
1.261
18
0.383
0.815
1.145
1.279
20
0.395
0.839
1.172
1.289
22
0.403
0.860
1.196
1.296
24
0.412
0.869
1.189
1.311
26
0.419
0.876
1.213
1.321
28
0.426
0.882
1.223
1.332
30
0.432
0.892
1.231
1.340
5、数据处理
以吸光度对时间作图,从直线斜率求出酶的活性。
3.结果与讨论
1、不同酶加入量的动力学曲线
以吸光度值为纵坐标,时间为横坐标,可得出在加入酶的作用下,多巴的转换动力学过程,在由直线部分得出转换速率,即为酶的活性。
依次得出不同提取液的活性,比较不同体积的提取液加入后相同量的多巴转换速率。
图1不同酶加入量的动力学曲线
2、酶的活性计算
将不同体积提取液的实验结果填入下表,计算出原料中酶的活性:
图2不同酶加入量的动力学过程直线部分
表3酶的活性计算表
已稀释的提取液体积/mL
活性/(A/min)
原提取液活性(mL^-1)
原料活性/(g^-1)
0.10
0.0248
197.9300
197.9300
0.20
0.0551
219.8779
219.8779
0.30
0.0783
208.3054
208.3054
0.40
0.1002
199.9253
199.9253
由图2可知,当溶液中酶的含量增加时,曲线斜率也增加,这表明酶浓度高,其反应活性也高。
3、影响酶的活性的因素研究
(1)取0.40mL稀释过的提取液在沸水浴中加热5min,冷却后配成测定溶液,观察现象。
(2)取0.40mL稀释过的提取液,加少量固体Na2S2O3配成测定溶液观察现象。
(3)取0.40mL稀释过的提取液,加少量固体Na2—EDTA振荡混合,反应一段时间后,配成测定溶液观察现象。
表4酶在不同影响因素下吸光度随时间变化数据表
时间/min
0.4mL提取液
0.4mL提取液沸水浴
0.4mL提取液+Na2S2O3
0.4mL提取液+Na2EDTA
0
0.197
0.092
0.134
1.638
1
0.339
0.092
0.134
1.638
2
0.467
0.092
0.134
1.638
3
0.580
0.092
0.134
1.638
4
0.679
0.092
0.134
1.638
5
0.766
0.092
0.134
1.638
6
0.841
0.092
0.134
1.638
8
1.001
0.092
0.134
1.638
10
1.119
0.092
0.134
1.638
12
1.189
0.092
0.134
1.638
14
1.234
0.092
0.134
1.638
16
1.261
0.092
0.134
1.638
18
1.279
0.092
0.134
1.638
20
1.289
0.092
0.134
1.638
22
1.296
0.092
0.134
1.638
24
1.311
0.092
0.134
1.638
26
1.321
0.092
0.134
1.638
28
1.332
0.092
0.134
1.638
30
1.340
0.092
0.134
1.638
图3沸水下酶的动力学曲线
由图3可知,沸水浴中温度较高,酶的反应活性较低,几乎失活,说明酶参与反应时应该有一个最适当温度。
图4加入Na2S2O3对酶活性的影响
由图4可知,当提取液中加入Na2S2O3,吸光度几乎不变,酶的反应活性较低,几乎失活,说明Na2S2O3对酶的活性有抑制作用。
图5加入Na2EDTA对酶活性的影响
由图5可知,当加入EDTA后,曲线斜率几乎接近于零,这表明当加入EDTA后酶的催化活性降低,酶几乎失活。
参考文献
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影响唾液淀粉酶活性的因素的探究
2.1仪器与试剂
2.1.1实验仪器
1)试管2)烧杯3)量筒4)玻璃棒5)白磁板6)铁三角架7)酒精灯8)恒温水浴锅9)冰浴10)试管夹11)试管架
12)唾液淀粉酶液:
实验者先用蒸馏水嗽口,然后含一口蒸馏水于口中,轻嗽一、二分钟,吐入小烧杯中,用脱脂棉过滤,除去稀释液中可能含有的食物残渣。
并将该滤液稀释一倍。
2.1.2实验试剂
1)1%淀粉溶液(含0.3%NaCl):
将1g可溶性淀粉与0.3g氯化钠,混悬于5ml的蒸馏水中,搅动后缓慢倒入沸腾的95ml蒸馏水中,煮沸1分钟,冷却后倒入试剂瓶中。
2)碘液:
称取2g碘化钾溶于5ml蒸馏水中。
再加1g碘。
待碘完全溶解后,加蒸馏水295ml,混合均匀后贮于棕色瓶内。
3)班氏(Benedict)试剂:
将17.3g硫酸铜晶体溶入100ml蒸馏水中,然后加入100ml蒸馏水。
取柠檬酸钠173g及碳酸钠100g,加蒸馏水600ml,加热使之溶解。
冷却后,再加蒸馏水200ml,最后,把硫酸酮溶液缓慢地倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中,边加边搅拌,如有沉淀可过滤除去或自然沉降一段时间取上清液。
此试剂可长期保存。
4)0.4%的HCl溶液
5)0.1%的乳酸溶液
6)1%Na2CO3溶液
7)1%NaCl溶液
8)1%CuSO4溶液
9)0.1%淀粉溶液
2.2实验步骤
1.淀粉酶活性的检测:
取一支试管,注入1%淀粉溶液5ml与稀释的唾液0.5~2ml。
混匀后插入1支玻棒,将试管连同玻棒置于37℃水浴中。
不时地用玻棒从试管中取出1滴溶液,滴加在白磁板上,随即加1滴碘液,观察溶液呈现的颜色。
此实验延续至溶液仅表现碘被稀释后的微黄色为止。
记录淀粉在水解过程中,遇碘后溶液颜色的变化。
向上面试管的剩余溶液中加2ml班氏试剂,放入沸水中加热10分钟左右,观察有何现象?
为什么?
2.pH对酶活性的影响:
取4支试管,分别加入0.4%盐酸(PH≈1)、0.1%乳酸(PH≈5)、蒸馏水(PH≈7)与1%碳酸钠(PH≈9)各2ml,再向以上四支试管
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- 提取 及其 活性 影响