基因工程复习总结表.docx
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基因工程复习总结表.docx
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基因工程复习总结表
1.定义
基因工程(geneengineering),又称DNA重组技术(recombinantDNAtechnique)、分子克隆(molecularcloning)和遗传工程(geneticengineering),是上世纪70年代兴起的技术科学.通过特殊的酶处理,使遗传物质在体外发生重组,从而产生自然界从未有过的重组DNA分子(至少包含两种不同生物的DNA片段)。
在他们进入一定的生物寄主后,不仅可以得到维持,而且可以得到扩增,其上的外源基因甚至可以得到表达。
2.孟德尔遗传定律的重新发现者:
荷兰的德弗里斯(H.DeVries)德国的科伦斯(C.Correns).奥地利的契马克(E.Seysenegg-Tschermak)
3.外源DNA进入细菌后,面临两种命运:
一是被限制,即被降解;二是被修饰,即发生甲基化,不被降解。
4.原核细胞中限制和修饰系统
I类酶酶分子:
三亚基双功能;识别位点:
二分非对称序列;切割位点:
距识别位点1000bp;限制性反应与甲基化反应:
互斥;限制作用需要ATP:
需要
II类酶酶分子:
内切酶与甲基化酶分离;识别位点:
4-6bp序列,回文结构;切割位点:
在识别位点中或靠识别位点;限制性反应与甲基化反应:
分开反应;限制作用需要ATP:
需要
III类酶酶分子:
二亚基双能;识别位点:
5-7bp非对称序列;切割位点:
在识别位点下游24-26bp;限制性反应与甲基化反应:
同时竟争;限制作用需要ATP:
不需要
5.命名规则:
生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称
基本名称+菌株名的字母+罗马字母(发现顺序)
HindIII
Haemophilusinfuenzaed株中的第三个酶
EcoRI
基因位于Escherichiacoli抗药性R质粒上
EcoRI
细菌属名细菌种名菌株类型有几种限制酶
6.识别的序列一般为4-8bp,常见的为6bp
Eg:
5bp识别位点EcoRIICCWGGW表示A或T;S表示C或G
7回文结构:
DNA局部双螺旋以某一对称轴旋转180度后,与另一侧的互补片段的顺序完全的DNA结构
8.M表示A或C;K表示G或T;Y表示C或T;R表示A或G
9切割的位置,有的在内部,有的在外部,外部的又有两端、两侧和单侧之分。
10.粘性末端(cohesiveend):
识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后,产生的末端为粘性末端,形成的两个末端是相同的,也是互补的
平末端:
在回文对称轴上同时切割DNA的双链
11.同裂酶:
识别相同序列的限制性内切酶称为~。
它们的切割位点可能不同
同序同切酶:
识别序列和切割位置都相同
同序异切酶(Isoschizomer):
识别序列相同,但切割位点不同
同功多位许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能
同尾酶(Isocaudarner):
不同的限制性内切酶切割DNA产生的末端是相同的,切是对称的,即相同的粘性末端
12DNA末端长度对限制酶切割的影响:
限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求,也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸
*PCR引物设计酶切位点的时候要注意,如果是要对PCR产物进行酶切,则引物末端的酶切位点上要加保护碱基;如果是先将PCR产物连接到T-Vector,再进行酶切,则不需要加保护碱基
13.星星活性:
在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特殊性称为~
原因:
甘油浓度高(>5%),酶过量(>100U/ul),离子强度低(<25mol/L),pH值过高(>8.0),加入了有机溶剂如DMSO、乙醇等,或是铜、锰、钴或锌离子代替了镁离子
抑制星星活性的措施:
减少酶的用量、甘油的浓度,保证体系中没有有机溶剂,提高离子强度,降低pH值(7.0),使用镁离子
14影响内切酶活性的因素:
.DNA纯度DNA纯度低,蛋白质含量高,影响酶切效果
.DNA的甲基化程度
.酶切反应的温度;反应温度一般是37度
.DNA的分子构型:
线性DNA容易切割,超螺旋较难
.缓冲液:
不同的酶,其buffer是不同的
15.甲基化酶对限制酶切的影响:
.修饰酶切位点.产生新的酶切位点对基因组作图的影响
16.DNA连接酶有两种:
大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶
大肠杆菌DNA连接酶:
需要NAD+,只能连接粘性末端,不能连接平末端(后来研究发现也可以连接平末端,效率中等)
T4DNA连接酶:
需要ATP,能连接粘性末端和平末端。
连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺口
17.DNA片段在体外的连接:
1.粘性末端的连接2.平末端的连接3.非互补末端的连接(可以使用同聚物加尾的方法,通过在一群DNA分子3′加上寡聚(dA),同时在另一群DNA分子的3′端加上寡聚(dT)。
末端脱氧核苷酸转移酶有此功能)4.接头的使用
(1)Linker:
是由化学合成的一段由8-16个核苷酸组成的双链寡核苷酸片段,其中具有一个限制性内切酶的识别序列,两端是平末端
(2)adaptor:
是一类由化学合成的、短小的双链寡核苷酸,寡核苷酸的一端是平末端,可与外源DNA相连,另一端是粘性末端,即与某种限制性内切酶切割后的末端相同。
5.PCR产物的连接
(1)T-vector的使用PCR反应使用的Taq酶,具有末端转移酶的活性,可以在PCR产物的3′末端加上1个A。
(2)在引物的5′端加上酶切位点(3)牛痘拓扑异构酶:
该酶可以切割和重新连接DNA分子。
线性双链DNA分子的两端附近放置一个CCCTT序列,可由牛痘拓扑异构酶活化,并插入到质粒载体中。
不需要限制酶和连接酶,反应时间是5min。
18影响连接反应的因素:
连接的温度16-22℃,2h;4℃,overnight
.离子浓度.DNA末端的特性粘性末端、平末端.DNA片段的相对浓度载体与外源基因的比例为1:
1~1:
3.DNA分子量
19大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ:
.具有依赖于DNA的5′-3′方向的DNA聚合酶活性
.具有5′-3′的外切酶活性,能从5′末端降解双链DNA,该酶还能降解RNA-DNA杂合体中的RNA
.具有3′-5′方向的外切酶活性在dNTPs存在的情况下,该活性被抑制
20.klenow片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ,经枯草杆菌蛋白酶处理后,分割成两个片段,其中大片段称为~。
具有5′-3′聚合酶和3′-5′外切酶活性
用途:
1)填充和补平限制性内切酶切割后产生的凹陷的3′末端2)标记DNA片段的末端3)催化cDNA第二链的合成4)用于DNA的序列分析5)催化与单链配对的寡核苷酸引物的延伸,合成杂交探针
21..T4DNA聚合酶
具有依赖于DNA的5′-3′聚合酶活性及单链和双链的3′-5′外切酶活性,且3′-5′外切酶活性非常强,是Klenow片段的200倍,缺乏5′-3′外切酶活性
用途:
不论是凸出的5′端还是3′端,只要满足高浓度dNTPs的要求,该酶都能将末端补平,使DNA便于与街头连接.;可用于3′端凸出DNA的末端标记;3′凹陷末端同位素标记
22.天然的T7DNA聚合酶:
用途:
(1)该酶具有极强的持续聚合能力,可用于引物长距离的延伸;
(2)用于定点诱变中的互补链的合成;(3)3′末端的标记
23.修饰的T7DNA聚合酶该酶的3-5外切酶活性被化学反应选择性地降低或被遗传修饰的方法完全抑制。
用途:
a)作为一种DNA序列分析的工具酶,修饰的T7DNA聚合b)酶具有一系列的理想特性:
加工性能高,无3′-5′外切酶活性,催化脱氧核苷酸类食物(双脱氧核苷酸)的聚合能力同催化正常核苷酸的聚合能力完全一样。
c)能有效地催化低水平的dNTPs,可用来制备标记的底物d)具有很高的比活性,且有失去了3′-5′外切酶活性,因此,可以有效地填补和标记具有5凸出末端的DNA片段之3′末端
24.依赖于DNA的RNA聚合酶
用途:
#.合成单链RNA,用作杂交探针,或在体外翻译系统中用作mRNA
#利用T7RNA聚合酶及其表达系统,能够使外源基因在细菌和酵母中得到表达。
25.末端脱氧核苷酸转移酶,简称末端转移酶,从小牛胸腺中分离出来。
.可以将dNTPs逐个地加到线性DNA分子的3′末端
.底物可以是单链DNA、也可以是具有3′末端凸出的双链DNA
.平末端双链DNA分子不是该没的有效底物,但如果用Co2+离子代替Mg2+离子,也可以成为有效底物
用途:
催化[α-32P]-3′-脱氧核苷酸标记DNA片段的3′末端
.催化非放射性的标记物参入到DNA片段的3′末端
.按照模板,合成多聚脱氧核苷酸的同聚物
26.核酸外切酶(exonucleases)是一类从多核苷酸链的一头开始按顺序降解核苷酸的酶。
.核酸外切酶Ⅶ:
大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ由两个亚基组成,分别为xseA和xseB基因编码
核酸外切酶Ⅶ是一种单链核酸外切酶,能从5′或3′末端降解DNA分子,不需要Mg2+
27.核酸外切酶Ⅲ:
由大肠杆菌xthA基因编码,降解DNA的速度取决于DNA分子的碱基成分,C≥A~T≥G
主要活性:
从3′-5′的方向催化双链DNA的降解
其他活性:
无嘌呤无嘧啶位点特异的核酸内切酶活性,3-磷酸酶活性和RnaseH酶的活性
主要应用是通过3′-5′活性,使双链DNA分子产生单链区,经过如此修饰的DNA,配合使用Klenow酶,可作为标记DNA的底物,制备探针。
3′隐蔽端与5′隐蔽端相比,优先降解3隐蔽端的双链DNA分子。
27.λ核酸外切酶催化双链DNA分子自5′-p末端进行逐步的加工和水解,但不能降解5′-oH末端
用途:
将双链DNA转变成单链的DNA,供按双脱氧法进行DNA序列分析;从双链DNA分子中移除5′突出末端,以便用末端转移酶进行加尾
28.单链核酸内切酶a)主要功能是催化RNA和单链DNA分子的降解,也可作用于双链核酸分子的单链区,这种单链区可以小到1个碱基。
b)可以测定杂交核酸分子(DNA/DNA或RNA/DNA的杂交程度c)给RNA分子定位.d)测定真核生物中内含子的位置e)探测双螺旋的DNA区域f)移除双链中突出的序列g)打开双链cDNA合成期间形成的发荚环结构
29.载体(vector)是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分,通过实验手段可使其它的DNA片段连接在它的上面,而进行复制,作为基因工程的载体,必须具备以下几个性能:
.分子较小,可携带比较大的DNA片段。
.能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
.要有尽可能多种限制酶的切割位点,但每一种限制酶又要最少的切割位点(多克隆位点multiplecloningsites,MCS)。
.有适合的标记,易于选择。
.有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达,并且尽可能是高效的表达。
.从安全角度考虑,要求载体不能随便转移,仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
30.质粒(plasmid)是存在于细胞中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。
质粒是环形双链的DNA分子,但酵母的杀伤质粒(killerplasmid)是一种RNA质粒。
质粒具有三种构型:
.共价闭合环形DNA(cccDNA),通常呈超螺旋的SC构型,其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构
.开环DNA(ocDNA),即OC构型,两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构,另一条链出现有一至数个缺口
.线性DNA,即L构型。
质粒DNA经适当的核酸内切酶切割之后,发生双链断裂而形成线性分子
31.作为基因克隆载体的质粒DNA分子,具有三个共同的组分:
复制基因(replicator)、选择标记基因(selectionmakergene)和克隆位点
32.质粒编码一些重要的非染色体控制的遗传性状,包括抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子等。
还有一类质粒,它们究竟赋予寄主细胞何种表型,迄今仍不清楚,因此,这类质粒称为隐蔽质粒(crypticplasmid
33.质粒的类型
1)F质粒:
又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。
它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
F质粒,又称F因子,即致育因子,在寄主细胞中以三中不同的形式存在:
以染色体外环形双链质粒DNA形式存在,其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA片段,这样的细胞称为F+细胞;.以染色体外环形双链质粒DNA形式存在,同时在其上携带有细菌的染色体基因或DNA片段,这样的细胞称为F′细胞:
以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上,这样的细胞称为Hfr细胞(高频重组细胞)
2).R质粒:
通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因,并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞,使后者也获得同样的抗菌素抗性能力
3).Col质粒:
即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
34.分类:
.结合型质粒(conjugativeplasmid),又叫自我转移质粒,除了具有自主复制所必需的遗传信息之外,还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因
.非结合型质粒(non-conjugativeplasmid),又称非自我转移的质粒,具有自主复制的遗传信息,但失去了控制细胞配对和结合转移的基因,因此,不能从一个细胞自我转移到另一个细胞
35.质粒转移的必备条件
ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点—顺式作用(cis-action)
ii.细胞附属物—性纤毛,由蛋白质构成—反式作用
ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用
质粒转移类型
ⅰ.自我转移(Self-transmissible)
ⅱ.辅助转移(Donation)—可转移质粒仅具备oriT,若无辅助质粒,前者不会发生接合转移。
若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质,前者便会发生接合转移。
ⅲ.重组转移(conduction)—若质粒无oriT,该质粒只有整合到辅助质粒DNA中,重组质粒便可转移。
36.质粒不亲和性(plasmidincompatibility),也称不相容性,是指在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。
37.低拷贝数的质粒:
每个寄主细胞中仅有1-3份拷贝,这类质粒为严谨型复制控制的质粒(stringentplasmid)
高拷贝数的质粒:
每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝,这类质粒为松弛型复制控制的质粒(relaxedplasmid)
(质粒的拷贝数,是指生长在标准的培养基条件下,每个细菌细胞中所含的质粒DNA分子的数目)
38.质粒载体必须具备的基本条件:
.具有复制起点一个质粒只有一个复制起点,但少数情况下有两个复制起点,但其中只有一个有活性.具有抗菌素抗性基因.具有若干限制酶单一识别位点.具有较小的分子量和较高的拷贝数
39.质粒载体的选择记号
抗菌素名称
作用方式
抗性机理
氨苄青霉素(Amp)
干扰细胞壁合成之末端反应而杀死细胞
Ampr编码β-内酰胺酶,可切割氨苄青霉素的β-内酰胺环,使之失去杀菌能力
氯霉素(Cml)
同50S亚基结合,干扰蛋白质合成,抑菌剂
Cml编码乙酰转移酶,特异地使氯霉素乙酰化而失活
卡那霉素(Km或kan)
同70S亚基结合,导致mRNA发生错读,杀菌剂
编码氨基糖苷磷酸转移酶,可对卡那霉素进行修饰,从而阻止其同核糖体之间发生相互作用
链霉素(Sm)
同30S亚基结合,导致mRNA发生错读,杀菌剂
编码一种特异性酶,对链霉素进行修饰,抑制其同30S亚基结合
四环素(Tet)
同30S亚基结合,阻止蛋白质的合成,抑菌剂
编码的酶对细菌膜结构进行修饰,阻止四环素从培养基运到细胞内
40.不同类型的质粒载体:
高拷贝数的质粒载体.低拷贝数的质粒载体.失控的质粒载体.插入失活型的质粒载体.正选择的质粒载体.表达型的质粒载体
41.重要的大肠杆菌质粒载体优点
(1)较小的分子量10kb以内DNA分子纯化过程中可避免断裂,pBR322易于自身纯化,且可克隆6kb左右的外源DNA
(2)较高的拷贝数经氯霉素扩培后达1000~3000copys/cell
(3)具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。
插入失活(图解)
41.pUC质粒载体的优点:
.具有更小的分子量和更高的拷贝数;适用于组织化学方法检测重组体α-互补;.具有多克隆位点MCS区段
42.α-互补:
LacZ′基因编码的α-肽链是β-半乳糖苷酶的氨基末端的短片段,它同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补时,便会产生有功能活性的β-半乳糖苷酶分子。
于是便可以应用X-gal和IPTG显色技术检测转化子。
重组子为白斑,非重组子为蓝斑
43.穿梭质粒载体(shuttleplasmidvector):
是一类有人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号,因而可在两种不同的寄主细胞中存活的质粒载体
44.质粒载体的稳定性问题:
(1)不稳定性类型;分离不稳定性;结构不稳定性
(2)影响稳定性主要因素;新陈代谢负荷;拷贝数差度
45.噬菌体的核酸;双链线性DNA(最常见)双链环形DNA.单链环形DNA.单链线性DNA.单链RNA
46.
(1)溶菌生长周期噬菌体(烈性噬菌体)
(2)溶源生长周期噬菌体(温和噬菌体)
47.温和噬菌体(temperatephage):
既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体
溶源性细菌(lysogen):
具有一套完整的噬菌体基因组的细菌
溶源化(lysogenization):
用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌
原噬菌体(prophage):
在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA。
超感染免疫性:
溶源性细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体在感染,溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性,称为~。
48.λ噬菌体感染了寄主细胞之后,究竟是发生溶菌反应还是溶源反应,这是由cI基因和cro基因编码的蛋白质,同λ噬菌体的两个操纵基因(OL,OR)之间的相互作用来决定的;如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态,那么噬菌体便可以进入溶菌周期,否则进行溶源周期。
49..λ噬菌体载体构建依据
.λ噬菌体是一种温和噬菌体
.能承载较大的外源DNA片段λDNA头部可包装约36.4~51kb(自身的75%~105%),且约有20kbλDNA可缺失(生长非必需)
.在λDNA上有多种限制性内切酶位点
该载体主要有如下特点:
(1)筛选简便;
(2)可克隆的片段大,最大可达23kb,而质粒最大仅10kb左右;
(3)转化效率高。
*λ噬菌体载体可分为:
插入型载体;替换型载体
注意:
λ噬菌载体作为载体,其重组噬菌体DNA大小只能:
38kb~52kb。
体外包装:
λ噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白
50.单链DNA噬菌体载体:
优点:
.单链DNA噬菌体的复制,是以双链环形DNA为中间媒介的,复制形式的DNA(replicationformDNA,简称RFDNA);.RFDNA和ssDNA,都能够转染感受态的大肠杆菌细胞;.单链DNA噬菌体颗粒的大小,是受其DNA多寡制约,即不存在包装限制的问题
;.应用这类单链DNA噬菌体,可以容易地测定出外源DNA片段的插入方向
;.可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子
51.粘粒载体(cosmid),又称柯斯质粒载体,或黏粒载体,是一类人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
特点:
.具有λ噬菌体的特性
.具有质粒载体的特性
.具有高容量的克隆能力仅具有一个复制起点、1-2个选择记号和cos位点,分子量只有5-7kb,最大可容纳45kb的外源片段
.具有与同源序列的质粒进行重组的能力
52.酵母人工染色体
1.原理
酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)
包含3个关键序列:
.自主复制DNA序列(autonomouslyreplicatingsequence,ARS)ARS的功能是确保染色体在细胞周期中能够自我复制
.着丝粒DNA序列(centromereDNAsequence,CEN)确保复制的染色体能够平均分配到子细胞中
.端粒DNA序列(telomereDNAsequence,TEL)与端粒酶结合,完成染色体的末端复制
2.优缺点:
优点:
克隆容量大
缺点:
.片段大,稳定性差,不便操作.文库中的嵌合现象严重
嵌合现象(chimaerism)是指一个YAC克隆中的DNA片段来自两个或两个以上的染色体
.YAC内部有重排现象.缺失,使文库不完整;.YAC转化酵母的转化率并不十分理想;.YAC的分子结构与酵母的天然染色体的分子结构有一定的相似性,故从转化细胞中分离YAC时,不易与酵母染色体分开
53.细菌人工染色体:
BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的
缺点:
.BAC载体插入的片段一般为100-350kb,没有YAC大(100-1000kb).BAC是通过电击法转化大肠杆菌,对大片段DNA有限制作用
优点:
.在寄主细胞中具有相当的稳定性。
由于复制子来源于F因子,拷贝数低,遗传100代仍很稳定.BAC文库中几乎不存在嵌合现象.BAC电击转化效率比YAC高10-100倍.BAC以超螺旋形式存在于寄主中,而YAC为线性,便于操作.BAC文库筛选方便,可用菌落原位杂交
.BAC载体上的插入片段可以直接进行测序以获得末端序列
54.大肠杆菌表达体系
a)优越性:
.对大肠杆菌的背景知识,特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解;
.是一种安全的基因工程实验体系,拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体;
.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达;
.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉,易用于批量生产。
b)大肠杆菌中表达体系的不足:
.真核基因,在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。
.真核基因的转录信号同原核的不同。
细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。
55.最佳启动子具备的条件
第一必须是将启动子,能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上
第二这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平,因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下,使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件
第三这种启动子应是诱导型的,能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。
(IPTG)
56.启动子封堵作用:
由一个上游启动子驱动的转录作用,当其通读过下游启动子时,便会使该启动子的功能受到抑制,将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象,叫做启动子封堵作用。
*转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性,从而提高蛋白质产物的水平。
57.转译起始序列5’-末端结构特征,决定mRNA的转译起始效率。
mRN
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