RTPCR检测穹窿海马伞切割后大鼠海马内Lhx8mRNA的表达变化.docx

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RTPCR检测穹窿海马伞切割后大鼠海马内Lhx8mRNA的表达变化

RT-PCR检测穹窿海马伞切割后大鼠海马内Lhx8mRNA的表达变化

作者：

秦建兵，金国华，蒋媛媛，王磊，朱蕙霞，田美玲，张新化

【摘要】　　目的：

探讨切割穹隆海马伞大鼠海马与正常海马内Lhx8mRNA表达的差异。

方法：

36只SD大鼠随机分成6组，每组6只。

1组为正常对照组，其余5组分别为切割穹窿海马伞后3、7、14、21和28d组。

取各组大鼠的海马组织，提取总RNA，采用半定量RT-PCR法分析穹隆海马伞切割后海马内Lhx8mRNA的表达变化。

结果：

海马内Lhx8mRNA的表达量在切割后第3d开始升高，7d时达到最高水平，以后逐渐下降，于28d时恢复至正常水平。

结论：

切割穹窿海马伞后海马中Lhx8mRNA表达的增高可能与神经干细胞向胆碱能神经元分化的再生机制有关。

【关键词】穹窿海马伞切割海马Lhx8逆转录－聚合酶链反应大鼠

　　[Abstract]Objective:

ToobservethedifferenceofLhx8mRNAexpressioninhippocampibetweenthefimbriafornixtransectedratsandnormalones.Methods:

36SDratswererandomlydividedinto6groups,6ratsineachgroup.Grouponewasthecontrolgroup,andtheotherswere3rd,7th,14th,21stand28thdaygroupafterfimbriafornixtransected.ThenhippocampiwereisolatedandtotalRNAwasextracted.Semi-quantitativereversetranscriptase-polymerasechainreaction（RT-PCR）analysiswasusedtodetecttheexpressionsofLhx8mRNAinhippocampi.Results:

TheexpressionlevelofLhx8mRNAstartedtoincreasefromthe3rddayafterfimbriafornixtransection.Thepeakappearedonthe7thday,andtheexpressiondecreasedslowlytopre-transectionlevelonthe28thday.Conclusion:

TheincreaseofLhx8mRNAexpressionafterfimbriafornixtransectedmightberelatedtotheregenerationmechanismofdifferentiationofneuralstemcellsintocholinergicneuronsinhippocampus.

　　[Keywords]Fimbriafornixtransection;Hippocampus;Lhx8;Reversetranscription-polymerasechainreaction;Rat

　　移植于切割穹窿海马伞齿状回中的神经干细胞较正常侧海马齿状回中植入的神经干细胞更易于存活、迁移和向神经元分化[1,2]。

体外实验也证实切割穹窿海马伞的海马提取液能明显促进神经干细胞向神经元和胆碱能分化[3]。

这些结果提示切割穹窿海马伞后海马中某些能诱导神经干细胞存活、迁移和向神经元分化的信号物质表达增高。

Lhx8是LIM同源盒基因家族中的一员，它主要选择性的表达在MGE（medialganglioniceminence,MGE）区，对于胆碱能神经元的分化有至关重要的作用[4]。

但迄今为止Lhx8基因在病理模型中的表达研究仍是空白。

本研究旨在观察切割穹窿海马伞后大鼠海马内Lhx8mRNA表达是否增高，以推测Lhx8与切割穹窿海马伞海马促进移植入其中的神经干细胞向神经元或胆碱能神经元分化关系。

　　1材料和方法

　　1.1实验动物SD大鼠36只（南通大学实验动物中心提供），雌雄不拘，体重220～250g，随机分成6组，其中1组为正常对照组，其余5组分别为手术后3、7、14、21和28d组，每组6只。

　　1.2切割大鼠穹窿海马伞上述各手术组SD大鼠，经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent（0.2ml/100g）麻醉后，固定于立体定位仪，暴露前囟，确定前囟坐标A（矢状轴）、L（冠状轴）、V（垂直轴），根据Paxinos图谱确定左右两侧穹隆海马伞的切割范围。

先在颅骨上确定右侧两点即：

（1）A1=A－1.4、L1＝L－4和；

（2）A2＝A－1.4、L2＝L－4；左侧两点即；（3）A3=A－1.4、L3＝L＋1和（4）A4＝A－1.4、L4＝L＋4，每点各钻一小孔，用刀片将右侧

（1）和

（2）、左侧（3）和（4）点间颅骨划开一条骨缝，将针刀插入脑内至切割深度即V1－4＝V+5.4，来回切割3次，退出针刀，待无颅内出血后用骨蜡封闭骨缝，缝合皮肤，肌注青霉素，动物按性别分笼饲养。

　　1.3RNA的提取和保存正常组及手术后各组大鼠经上述方法麻醉后，断颈处死，无菌条件下剥去颅骨和硬脑膜，再去除大脑皮质和胼胝体，证实两侧穹窿海马伞被切断后，取出两侧海马组织，用Trizol法提取RNA，沉淀用50μlDEPC-H2O溶解。

取少量样品进行紫外定量，用甲醛变性电泳鉴定RNA质量，其余样品保存于－70℃冰箱中备用。

　　1.4半定量RT-PCR选用磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH）基因为内参照。

反应中所用GAPDH上游引物为：

5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物为：

5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，扩增产物为452bp；Lhx8上游引物为：

5'-ATGTATTGGAAGAGCGATCAG-3'，下游引物为：

5'-TCATTGGATGGGGTAACAAGGGC-3'，扩增产物为1102bp。

GAPDH和Lhx8的cDNA序列查自GenBank，引物由上海英骏公司合成。

PCR反应：

将目的基因与内参基因的引物置同一管内行PCR扩增，反应体系按试剂DNA聚合酶（MBI公司）说明书操作。

预变性94℃、3min，然后94℃、45s，60℃、30s，72℃、65s，30个循环；最后72℃、10min。

PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，捷达图像分析系统对凝胶各泳道中的GAPDH和Lhx8条带进行光密度扫描。

　　1.5统计学方法以各泳道中Lhx8与GAPDH条带的光密度比值表示Lhx8mRNA的相对表达量，建立相对表达量柱形图。

数据输入Stata7.0统计软件，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验（SNK法）。

　　2结果

　　2.1RNA分析3μlRNA样品经甲醛－琼脂糖凝胶变性电泳，120V电压电泳25min，紫外灯下观察到28SRNA∶18SRNA约为1.5∶1，5SRNA呈淡云雾状，表明样品为RNA，且无降解。

另取样品在蛋白核酸测定仪上检测OD值，各组OD260/OD280均在1.8~2.0，说明所提取的RNA纯度较高，无污染。

　　2.2半定量RT-PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，以DL-2000DNAMarker为标准，扩增产物及内参大小与预期结果相符（分别为1102bp和452bp）。

穹隆海马伞切割后不同时间点Lhx8mRNA相对表达量如图2所示。

方差分析和均数两两比较表明，切割后28d组与正常对照组相比，Lhx8mRNA的相对表达量差异无统计学意义（P>0.05），3d、7d、14d和21d组与正常对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）；比较切割后不同时间组，各组间的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。

说明Lhx8mRNA表达量自切割后第3d开始升高，7d时达到最高水平，以后开始下降，于28d左右恢复至正常水平。

　　3讨论

　　3.1Lhx8基因与胆碱能神经元的发育神经干细胞以其自我更新、增殖和多向分化潜能等特性已经成为治疗中枢神经系统损伤和退行性疾病的理想细胞材料。

如何调控神经干细胞向神经元尤其是向特定表型的神经元（如胆碱能、多巴胺能等神经元）分化，已成为研究人员关注的热点和难点。

Lhx8[4]是最近新鉴定的LIM同源盒基因家族中的成员之一，又称为L3、Lhx7，特异性地在胚胎基底前脑和口腔间质中表达。

Zhao等定向敲除小鼠Lhx8基因后发现胆碱能标记的神经元减少，从而发现Lhx8在胆碱能神经元的分化中起积极的作用[4]。

Manabe等利用RNA干扰技术发现Lhx8的选择性定位和它的功能性配体对于基底前脑中的胆碱能神经元的发育有重要作用[5]。

关于Lhx8在病理状态下的脑组织如切割穹窿海马伞后的海马中表达的变化，以及在穹窿海马伞切割后的海马胆碱能神经元的再生中是否扮演着重要角色则尚未见有报道。

　　3.2切割穹窿海马伞海马中Lhx8mRNA的上调可能与胆碱能神经再生有关穹窿海马伞中不仅含有海马锥体细胞层和齿状回颗粒层细胞投射至丘脑前核、乳头体核、隔外侧核及斜角带核的传出纤维，而且还含有基底前脑内侧隔核和斜角带垂直支投射到海马的胆碱能传入纤维[6,7]。

内侧隔核的胆碱能神经元发出纤维经海马伞和背侧穹窿这一隔-海马通路与海马结构建立广泛的联系，这一胆碱能投射系统被认为与学习记忆和认知功能密切相关[8]。

穹窿海马伞切断后，阻断了隔区等相关经穹窿海马伞投射到海马的胆碱能神经纤维，使该侧海马失去了胆碱能神经支配，导致乙酰胆碱缺失，使得海马内的微环境发生变化，而引起切割侧海马中某些物质的表达增强，而这些物质对激活自体的神经干细胞或植入的神经干细胞向神经元或胆碱能神经元分化起到了促进作用[2]。

结合本课题组此前研究的结果，推测本实验切割侧海马Lhx8mRNA的表达上调，除了可能是切割穹窿海马伞后海马中的细胞对抗损伤的一种反应外，更可能是海马中启动了胆碱能神经再生机制，是对抗海马内乙酰胆碱递质缺失后的一种反应。

但究竟是变化了微环境中的哪些物质，通过什么信号传导途径引起Lhx8mRNA的表达上调，以及表达上调的Lhx8mRNA的细胞定位等情况则还需进一步研究。

【参考文献】

[1]金国华,张新化,田美玲,等.大鼠海马内移植神经干细胞的存活和迁移[J].神经解剖学杂志,2003,19（4）:

378-382.

[2]张新化,金国华,秦建兵,等.穹窿海马伞切割侧海马对植入神经干细胞分化为神经元的影响[J].神经解剖学杂志,2004,20（4）:

360-364.

[3]金国华,张新化,田美玲,等.穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用[J].解剖学报,2004,40

（2）:

141-145.

[4]ZhaoY,MarinO,HermeszE,etal.TheLIM-homeoboxgeneLhx8isrequiredforthedevelopmentofmanycholinergicneuronsinthemouseforebrain[J].ProcNatlAcadSciU