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8仛糖修饰阿霉素纳米脂质体的pH敏感性研究解析
中固善卅太擎学报
JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2008,39(3):
209—213
羧甲基壳聚糖修饰阿霉素纳米脂质体的pH敏感性研究
徐云龙H,姜厚友,钱秀珍,戎丽娜
(华东理工大学材料科学与工程学院超细材料制备与应用教育部重点实验室,上海200237)
摘要目的:
研究一种由羧甲基壳聚糖修饰的pH敏感阿霉素纳米脂质体,并考察羧甲基壳聚糖的分子参数对其敏感性的影响。
方法:
采用逆相蒸发一pH梯度法制备羧甲基壳聚糖修饰的阿霉素脂质体;用反透析一UV分光光度法测定包封率;用TEM和激光粒度仪分别考察脂质体形态与粒径分布;由药物渗漏实验考察pH敏感性。
并研究羧甲基壳聚糖取代度、相对分子质量和质量分数对脂质体pH敏感性的影响。
结果:
所制纳米脂质体的包封率达87%,形态圆整,粒径分布为(74.7±11.5)nln;羧甲基壳聚糖的羧甲基取代度、相对分子质量、质量分数对修饰的纳米脂质体药物渗漏有不同程度的影响。
结论:
逆相蒸发一pH梯度法可成功制备羧甲基壳聚糖修饰pH敏阿霉素纳米脂质体;调变羧甲基壳聚糖的取代度、相对分子质量和质量分数均可实现羧甲基壳聚糖修饰阿霉素纳米脂质体的pH敏智能控释。
关键词羧甲基壳聚糖;纳米脂质体;阿霉素;pH敏感性
中图分类号R944.1文献标识码A文章编号1000—5048(2008)03—0209—05
pH—sensitivityinvestigationofcarboxymethylchitosanmodifieddoxorubicinnanoliposomes
XUYun—lon91+,JIANGHou.you,QIANXiu—zhen,RONGLi—na
KeyLaboratoryforUltrafineMate融ofMinistryofEducation,School矿^fⅡ切记fsScienceandEngineering,EastChina£恸渺of
ScienceandTechnology,Shanghai200237,China
AbstractAim:
ToprepareapH-sensitivedoxorubicin(DXR)nanoliposomesmodifiedbycarboxymethylchitosan(CMCT),andtoinvestigatetheeffectsofmolecularparametersoftheCMCTonthepH.sensitivity.Methods:
CMCT-modifiedDXRliposomeswerepreparedbypH—gradientplusreverse—phaseevaporationmethod.1’heencapsulationefficiency,morphology,particlesizedistribution,pH-sensitivityandtheeffectsonpHsensitivityofCMCTsubstitutiondegree.molecularweightandconcentrationwereinvestigated.Results:
ItwasshownthattheencapsulationefficiencyofCMCT—modifiedDXRnanoliposomesWasabove87%.Theliposomeswerespheri.calwithparticlesizedistribution(74.7±11.5)nm;CMCTsubstitutiondegree,molecularweightandconcentra・tionhaddifferenteffectsonthepH.sensitivityofDXRnanoliposomes.Conclusion:
Thereverse.phaseevapora-tion—pHgradientmethodhasthepotentialinthepreparationofCMCT—modifiedpH-sensitivenanolipo-¥omes.CMCTsubstitutiondegree。
molecularweightandconcentrationcanbeadjustedtoobtainCMCT.modifiedDXRnanoliposomeswiththecharacteristicsofanintelligentpH.sensitivecontrolled—release.
Keywordscarboxymethylchitosan;nanoliposomes;doxorubiein;pH-sensitivity
nisstudywassupportedbyShanghaiLeadingAcademicDisciplineProjectandshnghaiNanotechnologySp∞ialFoundationfNo.0652nm027)
脂质体做为药物载体可以改变药物的体内分药物送到特定靶位,提高靶向性h51。
肿瘤组织在布,减少治疗剂量和降低毒性‘卜3。
。
脂质体纳米化局部缺血时,肿瘤间质液出现异常酸化现象‘6川,能克服药物在体内输送中遇到的各种生理屏障,将利用肿瘤组织pH值比正常组织低的特性,设计和
收稿日期2007-11-08‘通讯作者Tel:
021-64252019E—mail:
xuyunlong@ecugt.edu.s311
基金项目上海市重点学科建设和上海市纳米科技专项资助项目(No.0652nm027)
210
中目善秆太参学报
10umd
ofChi加Pharmaceutical踟溉灯
第39卷
研究在生理范围内稳定的pH敏感型脂质体,不但
可以进一步提高靶向性,而且可以实现药物的智能控制释放¨1。
pH敏脂质体释药机制主要有pH敏感型聚合物的溶蚀、溶胀,pH敏感性药物溶解度的变化,pH敏感型聚电解质的构象改变等M’9,旧J。
目前研究的pH敏感型脂质体主要有两种:
一种是利用某些具
pH敏感的类脂在低pH值时脂肪酸羧基质子化形
成六方晶相,破坏双分子层的稳定性而释放药物¨卜121;另一种是含有聚乙烯醇(PEG)等聚电解质的脂质体。
Similes等【6’9’”1研究发现某些聚电解质在pH改变时会发生构象变化,导致脂质双层结构重排并释放内容物。
其中聚乙基丙烯酸(PEAA)因在生理范围内对pH具有高度敏感性而受到广泛研究¨…。
羧甲基壳聚糖(carboxymethylchitosan,CM.CT)是壳聚糖经羧甲基化反应后得到的一类甲壳素衍生物,既含有弱碱阳离子(一NH,+)基团,又含有弱酸阴离子(一C00一)基团,是一种两亲性聚
电解质。
关于CMCT作为pH敏聚电解质和立体稳定剂修饰脂质体,以及其不同取代度、相对分子
质量、浓度与释药特性之间关系的研究尚未见报道。
本文采用逆相蒸发.pH梯度法制备阿霉素纳米脂质体,尝试以CMCT为修饰剂对纳米脂质体进行改性;并期望通过羧甲基取代度、相对分子质量与CMCT质量分数对修饰的纳米脂质体pH敏感性影响的研究,为pH敏感性脂质体提供一种新型修饰剂,为肝、脑等恶性肿瘤靶向治疗提供一种新型药物载体和控释系统。
1材料
1.1
药品与试剂
大豆卵磷脂(上海源聚生物科技有限公司);
胆固醇(上海政翔化学试剂研究所);PBS(pH
4.0,
pH6.8,pH
7.4,按2005年版《中国药典》标准配制,其他pH值的由这3种以适当比例混合得到,
离子强度均为0.10);阿霉素(浙江海正药业股份有限公司,批号U061031);羧甲基壳聚糖(浙江玉环海洋生物有限公司,取代度(SD)分别为0.60、0.90和1.20);其余试剂均为分析纯。
1.2仪器
R205系列旋转蒸发仪(上海申生科技仪器
厂);SY2200型超声波发生器(上海三友超音设备有限公司);¥54型紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司);PHS-2C型pH计(上海三信仪表厂);透射电镜(日本JEM一1200一EXII型);Nicomp380粒度仪(美国Pss公司);Zetasizer3000HS型Zeta电位分析仪(英国马尔文公司);TP2A型ZTY
智能透皮试验仪(河南巩义市英峪予华仪器厂)。
2方法
2.1
不同相对分子质量CMCT的制备¨纠
采用H:
O:
氧化法对CMCT进行降解,以获得
不同相对分子质量的CMCT。
称取取代度为1.2的CMCT
2
g,放人100mL烧杯中,加入蒸馏水50
mL,磁力搅拌至全溶;加入30%H:
0:
溶液适量,于磁力搅拌器上搅拌,分别在室温反应3、9和15h
后结束。
将反应液放入干燥箱内恒温60℃下烘干,即得相对分子质量依次降低的CMCT-H、CM・CT—M和CMCT—L。
2.2
阿霉素纳米脂质体的制备¨钊
精密称取一定比例的磷脂、胆固醇溶于适量混
合溶液(氯仿.甲醇,2:
1)中,减压蒸干混合溶液至
形成一层均匀的脂质薄膜。
加适量pH4.0的PBS溶解后间歇超声(超声5s停5s地循环超声)
3
min成均匀乳液,用pH7.4的PBS调节pH至碱性,加入适量阿霉素溶液后再间歇超声数次,每次
3
rain,水浴条件下水合3h,0.2斗m微孔滤膜过滤
即得阿霉素纳米脂质体。
2.3
pH敏纳米脂质体的修饰
分别向“2.2”制得的阿霉素纳米脂质体中加
入适量不同取代度、不同相对分子质量和不同质量分数的CMCT溶液,水合0.5h,即得CMCT修饰的pH敏阿霉素纳米脂质体。
2.4脂质体包封率的测定
2.4.1
阿霉素标准曲线的制备以去离子水为溶
剂配制低浓度的盐酸阿霉素溶液,以去离子水为参照液,分光光度计在300~700nm范围内扫描,在
480
nm处出现最大吸收。
空白脂质体经“2.4.2”
所述方法分离处理后在此处几乎无吸收,其影响可忽略,因此选择480am为测定波长。
精密配制浓度分别为0.8,1.6,2.4,3.2,4.0
峭./mL的阿霉素标准溶液,在480am处测定吸收度
(A),同一样品取3次实验的平均值。
以c为横坐
‘
第3期徐云龙等:
羧甲基壳聚糖修饰阿霉素纳米脂质体的pH敏感性研究
21l
标,A为纵坐标进行线性回归,得标准曲线。
结果表明,在0.8—4.0一mL浓度范围内,线性良好,回归
方程为:
A=0.246
5+0.103
2c(r=0.9992,n=5)。
2.4.2游离阿霉素的反透析分离与包封率精密移取脂质体溶液lmL,以pH
6.8PBS25
mL稀释后作为外液,另精密量取pH6.8的PBS20
mL,置PBS
浸泡24h的透析袋中作内液,4℃恒温,每间隔30分钟搅拌一次,透析6h,每隔l小时从内液中取样
5
mL,同时补加同温同体积新鲜缓冲液,测定所得内
液的吸收度,同一样品取3次实验的平均值。
根据阿霉素标准曲线,可以换算出吸收度对应的游离阿霉素在所有内液中的浓度,可计算出游离的阿霉素量,按下式计算包封率(EE):
EE=(,n总一,n游)/m总×100%
2.4.3
回收率将上述反透析后的剩余物用无水
乙醇破膜并定容为25mL,测定吸收度,同一样品取3次实验的平均值。
计算其所对应阿霉素的量作为
rn包。
根据公式:
回收率=(m包+m游)/m总X100%。
2.4.4重现性制备3批CMCT修饰的阿霉素脂质体样品,分别测试包封率。
2.5脂质体形态与粒径的观测
取适量脂质体,以PBS稀释至较低浓度,滴于铜网上,以质量分数为2.0%的磷钨酸负染,放置至成膜均匀,多余液体挥干,透射电镜下观察产物形态。
另取适量脂质体,以PBS稀释至较低浓度测定粒径分布。
2.6
Zeta电位测试
精密吸取适量的阿霉素纳米脂质体和以质量
分数为0.20%的CMCT修饰的阿霉素纳米脂质体,利用Zeta电位分析仪测定Zeta电位。
2.7
pH敏感性实验
分别以pH5.0,5.5,6.0,6.1,6.3,6.5,7.0的
PBS代替“2.4.2”中pH6.8的PBS作外液,按“2.4.2”所示方法测定包封率,按下式计算药物渗
漏(RE)百分率:
RE(%)=1一EE
以阿霉素的RE对pH值作图,即得脂质体药物渗漏的pH敏感性曲线。
3结果与讨论
3.1回收率测定与重现性
按“2.4.3”所述方法测得平均回收率为
89.2%,表明回收率较高。
测得3批脂质体的包封率分别为87.02%、
86.78%和87.4l%,说明上述方法修饰阿霉素脂
质体重现性好。
3.2脂质体形态与粒径
图1为CMCT修饰的阿霉素纳米脂质体的
TEM图片。
由图1可以看出,CMCT修饰的阿霉素纳米脂质体为均匀分散的球形小单室纳米脂质体,脂质体颗粒间彼此独立,外观圆整。
lrtgure
1
TEMofCMCTmodified
doxorubicin(DXR)nanoliposomes
图2为CMCT修饰的阿霉素纳米脂质体的粒径分布图。
从图2可以看出,脂质体粒径范围为(74.7-4-11.5)nm,分布较窄。
H舭2
ParticlesizedisuibufionofCMCTmodifiedDXRnanolipostmles
3.3
Zeta电位
脂质体经CMCT—L修饰前后,表面Zeta电位
由一54.1mV显著降低为一23.4mV。
这可能是由于阿霉素纳米脂质体表面带负电荷,羧甲基壳聚糖带正电荷,水合作用时由于静电吸附作用,羧甲基
壳聚糖可以紧密地吸附在阿霉素纳米脂质体外表
面,形成较稳定的脂质体。
3.4pH敏感性实验
3.4.1
取代度的影响羧甲基壳聚糖是一种含有
(一NH,+)阳离子基团和(一C00一)阴离子基团的
两性聚电解质,当介质偏酸性时,CMCT因荷电分
‘
212
中田摹卅久参学报
JournalofChinaPharmaceuticalUnive聆ity第39卷
子链链间静电相互作用加强,加上链内氢键作用与疏水基团的疏水相互作用,CMCT分子链构象发生转变,分子链卷曲程度逐步增加,形成线团;随pH升高,CMCT分子内羧基被中和形成羧酸根负离子,负电荷间的相互排斥又使CMCT形成松散线团构象。
将CMCT结合于脂质体表面,由环境pH变化引起CMCT构象的改变,迫使磷脂双分子层发生重排,破坏脂质体膜的屏障性质,从而使被包封的药物迅速释放…1。
图3为不同羧甲基取代度的CMCT—L修饰的
阿霉素纳米脂质体在不同pH的PBS中阿霉素的渗漏百分率。
由图3可见,当pH6.2~7.0时,阿
霉素渗漏百分率随着取代度的增大而降低,这是由
不同取代度CMCT的溶解性质不同导致的。
pH小于6.2时,阿霉素渗漏百分率随着取代度的增大而增大,这是因为羧甲基取代度大的分子中含有较多的羧酸基团,可解离形成更多的羧酸根负离子,这种负电荷间的相互排斥作用使CMCT采取更松散
的线团构象,迫使磷脂双分子层发生重排,破坏脂
质体膜的屏障性质,从而增加了脂质体的药物释放。
0.7
莲0.6
量0.5
E
蓉o.4
0r35.0
5.5
6.06,5
7.0
pH
一●一WitlI鲫tCMCT;一▲一SD0.9;一T—SD0.6;一★--SD
I.2
Figure3
Releaseprofilesof
DXR
nanoliposomesanddifferentsubsti・
tution
degree(SD)CMCTmodified
DXR
nanoliposomes
3.4.2相对分子质量的影响图4为不同相对分
子质量CMCT修饰的阿霉素纳米脂质体在不同pH的PBS中阿霉素的渗漏百分率。
由图4可见:
pH6.3—7.O时,不同相对分子质量CMCT修饰的脂质体阿霉素渗漏百分率没有明显变化,这是因为在此pH范围内,CMCT在PBS中均处于溶解状态,相对分子质量大小对溶解状态的影响很小;pH小于6.3时,阿霉素渗漏百分率随着相对分子质量的减小而降低,这是因为脂质体经CMCT修饰后,其表面包覆的一层CMCT起了屏障保护作用,可以阻
止阿霉素通过脂质膜向外渗漏,减缓药物释放,而且CMCT相对分子质量越小,在脂质体表面的包覆越均匀,形成的保护层也越致密,其药物释放相应越少。
一一一H讪MW;一・一MediumMW;一・一L脚MW
Figure4Releaseprofilesofdifferentmolecular
weight(MW)CMCT—
modified
DXR
nanoliposomes
3.4.3质量分数的影响图5为不同质量分数
CMCT-L修饰的阿霉素纳米脂质体在不同pH的PBS缓冲液中阿霉素的渗漏百分率。
由图5可见,渗漏速度随着CMCT质量分数的增大,先降低到一
定程度后又逐渐升高,阿霉素渗漏百分率变化不明
显。
这是因为脂质体经质量分数0.08%以下的CMCT修饰后,表面吸附的一层CMCT阻止了阿霉素通过脂质膜向外渗漏,随着CMCT质量分数的增加,药物释放速率变缓;经质量分数0.08%以上的CMCT修饰后,随CMCT浓度增大,有更多的分子链发生构象改变,足以破坏表面CMCT层的屏障保
护作用,药物释放速率加快。
O7
O6
O5
摹奄盈。
一a
O4
O35.0
5.5
6.06.5
7.0
pH
一一珈.04%;一●珈.08%;一▲—O.10%;一T—O.20%;一●一
0.40%Figure5ReleaseprofilesofdifferentconcentrationsofCMCTmodi—
fled
DXR
nanoliposomes
第3期徐云龙等:
羧甲基壳聚糖修饰阿霉素纳米脂质体的pH敏感性研究
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4结论
本文利用纳米脂质体、CMCT的特性,将纳米技术与pH敏智能释药技术相结合,通过阿霉素纳米脂质体与CMCT的相互吸附作用,制备了一种新型pH敏纳米脂质体。
CMCT修饰后的阿霉素纳米脂质体不仅具有显著的pH敏智能控释特征,而且包封率较高,稳定性好。
羧甲基壳聚糖的羧甲基取代度、相对分子质量、质量分数对修饰的阿霉素纳米脂质体的pH敏感性均有不同程度的影响。
因此,通过调变羧甲基壳聚糖的取代度、相对分子质量、质量分数,即可实现CMCT修饰阿霉素纳米脂质体的pH敏智能控释。
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