生物工程 本科 基因实验.docx
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生物工程本科基因实验
基因工程试验
绿色荧光蛋白(GFP)在E·coliBL21中的表达
前言
绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein),简称GFP,这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。
分子质量为26kDa,由238个氨基酸构成,其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光(第65~67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团,是主要发光的位置)。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
其发光团的形成不具物种专一性,发出荧光稳定,且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。
绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定,对多数宿主的生理无影响,是常用的报道基因。
应用:
1.GFP作为报告基因GFP作为基因报告可用来检测转基因效率,把GFP基因连接到目的基因的启动子之后,通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。
2.GFP作为融合标签
GFP最成功的一类应用就是把GFP作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用,或者靶向标记某些细胞器。
3.作为生物传感器
4.检测pH野生型GFP和其许多突变体都具有依赖于pH的荧光变化,因而可以被用来检测活细胞内的pH。
3.2.2检测卤素离子YFP(H148Q)变体不但对pH敏感而且对不同离子也同样敏感,故可以用来检测亚细胞结构中卤素离子的浓度和传递[17]。
5.其他检测应用另外,GFP可以应用于检测电位、氧化还原水平以及在信号转导中作为Ca2+指示剂[18]。
6.GFP在细胞生物学上的应用
GFP具有同宿主蛋白构成融合子的性质,利用这一性质,可以将GFP定位到特定的细胞器和膜系统中,进行细胞生理过程、细胞动力学等的实时观测,或直接应用于定量分析。
7.GFP在筛选方面的应用
1).GFP用于细胞的筛选基于GFP的荧光特性,并且荧光稳定以及检测方法快速、方便,GFP在细胞筛选上得到应用广泛。
2).GFP用于药物的筛选利用GFP对目的物进行标记,追踪GFP,分析目的物在细胞中的变化情况,如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化,从而筛选出与体内信号分子功能相似的化合物。
一.材料
1.1试验仪器
1.5mL离心管,0.2mLPCR管,1mL吸头,100uL吸头,10uL吸头,1mL移液器,100uL移液器,10uL移液器,电泳仪,三角瓶,试管,烧杯,量筒,记号笔,IPTG,氨苄青霉素,TAE缓冲液及其配制,琼脂糖凝胶板及其制备。
1.2试验试剂
大肠杆菌菌株:
E.coliJM109;E.coliBL21
质粒:
pCAMBIA还有GFP基因,作为模板;pMD19-T克隆载体(T载体),用于PCR产物的克隆;pET21b大肠杆菌中的表达载体,表达外源基因用。
培养基:
LB液体培养基,LB固体培养基。
试剂:
taqDNA聚合酶,T4DNA连接酶,氨苄青霉素,限制性内切酶:
EcoRI,HindIII;IPTG;质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司),大肠杆菌感受态(takala,大连宝生物公司);琼脂糖,TAEbuffer,PCR相关试剂:
10Xbuffer,dNTP,Mg2+,H2O。
二.试验方法
实验路线:
用pCAMBIA载体作为模板----PCR扩增GFP基因----DNA电泳检测有无PCR产物----PCR产物和T载体连接----转化大肠杆菌JM109,涂0.2mL菌液和氨苄青霉素于LB平板,37C培养过夜----含重组质粒(pMD18T-GFP)阳性克隆的筛选----阳性菌株接种5mLLB液体试管----37C培养过夜----提质粒(质粒提取试剂盒)-----酶切质粒(EcoRI/HindIII),同时将pET21b载体做同样双酶切----电泳观察----回收pET21b载体和GFP基因片段(胶回收试剂盒)----GFP和pET21b连接----转化大肠杆菌JM109,涂0.2mL菌液和氨苄青霉素于LB平板,37C培养过夜----挑取阳性克隆----接种5mLLB液体试管,37C培养过夜----提质粒-----转化大肠杆菌BL21-----涂0.2mL菌液,IPTG和氨苄青霉素于LB平板,37C培养过夜-----此日在紫外线下观察结果,看是否有绿色荧光出现在大肠杆菌菌落上。
2.1PCR扩增GFP模板(25ul)
2.1.1在灭菌的PCR管里,依次加入:
ddH2O16.5µl
10×PCRBuffer(含)2.5µl
Mg2+0.5µl
dNTP(10mM)2µl
引物1µl/个
模板DNA1µl
Taq酶(5U/µl)0.5µl
总体积25µl
2.1.2混合后按下面程序进行扩增
94℃5min
94℃45s
58℃45s(30个循环)
72℃1min30s
72℃10min
4℃∞
2.1.3GFP扩增引物:
5’端引物:
CCGGAATTCGATGGTAGATCTGAC3'
EcoRI
3’端引物:
CCCAAGCTTTCACACGTGGTGGTG3‘
HindIII
2.2电泳
取8µl采用1%琼脂糖凝胶电泳检查产物情况
2.3和PMD-18T连接→转化E.coliJM109→挑选阳性克隆→培养
取5µlPCR扩增产物与大肠杆菌感受态混合均匀,在0℃吸附30分钟,在42℃热激30秒(大肠杆菌膨胀,细胞表面DNA进入细胞),再在0℃保温2-3分钟(使细胞收缩,防止进入细胞的DNA再出来),加入20µlLB培养基在37℃的温度条件下在摇床上震荡45分钟,取出一定量的培养物涂平板,培养12-16小时。
2.4提质粒
2.4.1取1~5毫升个过夜培养的菌悬液,加入离心管中,12000rpm离心1分钟,尽量吸去上清。
注意:
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加BufferP1,P2,N3的用量;可以适当延长吸附和洗脱时间,以提高洗脱效率。
2.4.2向留有菌体沉淀的离心管中加入250微升BufferP1,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
注意:
如果细菌未彻底混匀,将会影响裂解效果,使提取量和纯度偏低。
2.4.3向离心管中加入250微升BfferP2,温和的上下颠倒混匀4-6次,使菌体充分裂解,此时菌液应变的清亮粘稠。
所用时间不应超过5分钟,以免质粒受到破坏。
注意:
不要剧烈震荡,以免造成所提质粒中出现基因组DNA污染。
如果溶液未变的清亮,提示可能菌量过大,裂解不彻底,应减少菌体量。
2.4.4向离心管中加入350微升BufferN3,立即温和的上下颠倒4-6次,此时将出现白色絮状沉淀,12000rpm离心10分钟,此时在离心管底部形成沉淀。
注意:
BufferN3加入后应立即充分混匀,避免产生局部沉淀。
如果上清中和还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
2.4.5柱平衡:
向已装入收集个管的吸附柱中加入200微升BufferPS,12000rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
2.4.6将步骤4中所得上清液加入到已装入收集管的吸附中,注意不要析出沉淀,12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。
2.4.7向收集管中加入600微升BufferPW,12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的液体。
2.4.8重复步骤7。
2.4.9将吸附柱重新放回收集管中,12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液。
将吸附柱置于室温数分钟,以彻底凉干。
注意:
这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除,乙醇残留会影响后续的酶促反应。
2.4.10将吸附柱置于一个新的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50—100微升BufferEB,室温放置数分钟,12000rpm离心1分钟,将质粒溶液收集到离心管中。
-20℃保存质粒.
注意
1)为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,重复步骤10.BufferEB在65-70水域预热,适当延长吸附和洗脱时间,可以增加提取效率。
2)洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。
若用水作洗脱液,应保证其pH值在7.0-8.5,pH值低于7会影响洗脱效率。
3)如果使用TE洗脱,需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。
2.5表达载体和目的蛋白的酶切
酶切质粒(EcoRI/HindIII),同时将pET21b载体做同样双酶切。
2.6胶回收
试剂盒组成
Dp209_02(50次)
Dp209_-3(200次)
平衡液LB
30ml
120ml
溶液胶PN
50ml
2*100ml
漂洗液pw
15ml
50ml
洗脱缓冲液EB
15ml
30ml
吸附柱CA2
50个
200个
收集管(2ml)
50个
200个
说明书
1份
1份
2.6.1将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切出多余部分),放入干净的离心管中,称取重量。
注意:
若胶块的体积过大,可将胶块切成碎块。
2.6.2向胶块中加入3倍体积BufferPG:
当琼脂糖凝胶浓度〉2﹪时,建议使用6倍体积BufferPG。
2.6.350℃孵育10分钟,其间不断温和的上下颠倒离心管,以确保胶块充分溶解。
入股还有微解的胶块,可再补加一些溶胶液或继续放置几分,直至胶块完全溶解。
2.6.4柱平衡:
向已装入收集管中的吸附柱中加入200微升BufferPs,12000rpm离心2分钟,倒掉艘集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
2.5.5将步骤3或步骤4中所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中,室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟,倒掉吸附柱中的废液,将吸附柱放回收集管中。
2.6.6向吸附柱中加入650微升BufferPW,12000rpm离心1分钟,倒掉吸附柱中的废液,将吸附柱放回收集管中。
2.6.712000rpm离心2分钟,倒掉吸附柱中的废液。
将吸附柱置于室温数分钟,以彻底凉干。
注意:
这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除,乙醇残留会影响后续的酶促反应。
2.6.8将吸附柱放到一个新离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加50微升BufferEB(pH8.5),室温放置2分钟,12000rpm离心2分钟,收集DNA溶液。
-20℃保存DNA。
注意:
1)洗脱液的pH值对于洗脱效率哟很大影响。
若用水作洗脱液,应保证其pH值在7.0-8.5。
2)为了提高DNA的回收量,可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中,重复步骤10。
3)洗脱体积不应小于30微升,体积过少会影响洗脱效率。
4)如果用TE脱,需要考虑其中含有的EDTA是否会影响后续的酶促反应。
5)回收大于10kb的DNA片段时,BufferEB应在50℃水浴中预热,适当延长吸附和洗脱时间,可增加回收效率。
2.7重组质粒的构建
2.7.1jm109和BL-21感受态细胞的制备
1)将0~4℃保存的jm109和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37℃下250r/min过夜培养16h。
2)将分别接种过夜菌:
LB按1:
50的比例接种于2mL的LB液体培养基中,37℃活化培养2~3h至OD=0.3~0.5。
3)取1.5mL菌液转入EP管中,置于冰上10min,然后于4℃下5000r/min离心5min。
弃上清液,沉淀加入0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2缓和悬菌。
冰上放置15-30min后,4℃下5000r/min离心10min。
4)弃上清液,沉淀用0.1mL预冷的0.1mol/LCaCl2(含15%甘油)缓和悬菌,放在-20℃冰箱内保存。
2.7.1感受态细胞的转化
1)取制备好的感受态细胞100μl,冰上解冻,均匀悬浮。
2)加入2μl酶连产物,轻轻混匀,冰上静置10-30min。
3)42℃水浴中热击70sec后,冰上放置2min。
4)加入200μlLB液体培养基,37℃,50-100rpm振荡培养1h。
5)取200μl悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上,用涂布器均匀涂布,平皿正放静置1-2h后,封口膜封好平皿,37℃培养倒置12-16h。
2.7.3碱法提质粒
1)感受态细胞经转化培养后,平皿内有但菌落长出。
2)用灭菌吸头挑取单菌落,浸没于2mL含有抗生素的LB液体培养基中,37℃,180r/min振荡培养过夜。
3)取1.5ml培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于4℃、11000r/min离心1分钟,吸弃上清。
4)向离心管中加入150l用冰预冷的溶液Ⅰ,用微量移液器吹打重悬沉淀。
5)加入200l新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口,快速颠倒离心管5次,冰上放置5分钟。
6)加入150l用冰预冷的溶液Ⅲ,轻轻混匀,冰上放置3~5分钟。
7)用微量离心机于4℃、11000r/min离心5分钟,吸取上清转移到另一离心管。
8)加等体积氯仿400l抽提,振荡混匀,用微量离心机于4℃、11000rpm离心2分钟,将上清转移到另一离心管中。
9)吸取上清液300l,向上清中加入2倍体积的无水乙醇,混匀后,于室温放置2分钟;用微量离心机于4℃、11000rpm离心5分钟,弃上清。
10)用70%乙醇洗涤2次,再次4℃、11000rpm离心5分钟,沉淀于空气中干燥。
向已干燥的离心管内加20l超纯水溶解质粒DNA,加入2l10mg/mlRNA酶,37℃处理1小时后于-20℃贮存。
2.7.4酶切鉴定
1)取提取的质粒8l于另一微量离心管中,加入2lBamHI和NotI的酶切混合液,轻弹管外混匀反应物。
2)离心,使溶液聚集在管底部。
3)37℃,酶切反应。
2.7.5琼脂糖凝胶电泳
1)称取0.8g琼脂糖,放入到锥形瓶中,加入100mL1×TAE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全融化,冷却至60℃左右。
2)轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中,静置冷却30分钟以上。
3)将胶板除去封胶带,加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米,轻轻拔除梳子。
4)吸取10l的质粒与2l的上样液混匀,吸取混合液将加入加样孔。
5)接通电泳槽与电泳仪的电源,设置电泳数据U=100V,I=30mA。
6)当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处,停止电泳。
7)在凝胶成像分析系统中观察结果。
2.7.6PCR-聚合酶链式反应
1)将PCR管放置在冰盒上,按如下表格加入PCR反应体系各成分
PCR反应体系
各成分的量
template
0.1l
P1(20mM)
0.2l
P2(20mM)
0.2l
dNTPs(10mM)
0.4l
Taqs(5U/l)
0.2l
10×PCRbuffer
2l
ddH2O
16.9l
Total
20l
2)将PCR管放入PCR仪中,设定PCR仪的循环参数。
预变性95℃3min,变性95℃30s,退火60-55℃30s,延伸72℃1min10个循环,每个循环降0.5℃。
变性95℃30s,退火55℃30s,延伸72℃1min20个循环,72℃延伸2min。
3)PCR扩增完毕后,取出PCP管放在冰盒上。
4)取8l扩增后产物,进行琼脂糖电泳检测。
2.7.7pET-21b-GFP重组质粒转化到大肠杆菌jm109
1)取100μl感受态jm109,冰上慢速解冻,均匀悬浮。
加入2μl经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP,轻轻混匀,冰上静置10-30min。
2)42℃水浴热激70s,冰上放置2min。
3)加入200μl含抗生素的LB液体培养基,37℃,60r/min震荡培养30min。
4)吸取200μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上,用涂布器均匀涂布,平皿正放静置1-2h后,封口膜封好平皿,37℃培养倒置12-16h。
2.8转化大肠杆菌BL21,重组绿色荧光蛋白(GFP)的诱导表达。
1)挑选阳性克隆,取GFP重组菌接种于5mlLB培养液(含Kana100mg/l)中,37℃150-220r/min过夜培养。
2)取100μl感受态BL21,冰上慢速解冻,均匀悬浮。
加入2μl经过酶切鉴定成功提取重组质粒pET-28a-GFP,轻轻混匀,冰上静置10-30min。
3)42℃水浴热激70s,冰上放置2min。
4)加入200μl含抗生素的LB液体培养基,37℃,60r/min震荡培养30min。
5)吸取200ul菌液在涂有氨苄青霉素和IPTG培养基LB平板继续培养,37℃过夜.
4)用紫外线照射菌体沉淀,保存照片。
三.实验结果和分析
在紫外灯的照射下,培养基呈现绿色荧光。
实验成功。
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95-97
作业题:
(1)基因工程的一般步骤是什么。
答.1.目的基因的分离或合成
2.将目的基因与载体DNA连接,构建重组DNA分子-表达载体
3.将重组DNA分子导入受体细胞,并获得具有外源基因的个体
4.转基因生物的检测与鉴定
5.转基因生物的安全性评价
(2)找到pMD18-T的载体图,说明其使用原理;是否还有同样作用的载体在销售,这些载体叫什么名字。
答:
使用原理:
在pMD18-T的lacz插入外源DNA片断,切断了lacz基因编码序列的连续性,使之失去活性,产生出重组pMD18-T质粒,转化入大肠杆菌细胞。
先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上,筛选出具Ampr菌落.
其他载体:
噬菌粒载体pUC118和pUC119,M13载体,穿梭质粒载体,pUC质粒载体
(3)什么是表达载体,pET21b中含有哪些跟基因表达相关的DNA序列(顺式作用元件)?
答:
能使插入基因进入宿主细胞表达的克隆载体,包括原核表达载体和真核表达载体,可以是质粒、噬菌体或病毒等。
典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列,并在适当位置有可插入外源基因的限制性内切酶位点。
顺势作用元件包括:
启动子,增强子,调控序列和可诱导元件等
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