蛋白操作相关试剂.docx
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蛋白操作相关试剂
蛋白操作相关试剂
1)蛋白Marker
SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)低等分子量蛋白质标准
使用说明书
产品介绍:
本试剂为冰冻干燥的六种已知分子量的蛋白质混合物,用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,快速测定蛋白质的分子量,测定范围为14,400-97,400道尔顿。
中等分子量蛋白质标准的组成:
RabbitphosphorylaseB97,400Dalton、
BovineSerumAlbumin66,200Dalton、
Ovalbumin42,700Dalton、
CarbonicAnhydrase31,000Dalton、
TrypsinInhibitor20,100Dalton、
Lysozyme14,400Dalton)
使用方法:
开封后溶于60ul的双蒸水,分装于3个小管内(每管20ul),于沸水中加热5分钟后,保存于-20℃。
使用前于室温融化,加DTT至100mM,于沸水中加热5分钟后上样。
如果用银染检测蛋白,须将本产品用1×的上样缓冲液(50mMTris-HCl,PH6.8,10%甘油,2%SDS,0.05%溴酚蓝,100mMDTT)稀释50倍后再上样。
产品电泳图谱:
10-20%SDS-PAGEgelandCoomassieBlueR-250stained
建议使用分离胶浓度:
10%或12%的均一胶,10%-20%的梯度胶
使用次数:
用CoomassieBlueR-250染色每个包装可使用3次,若用银染可使用150次
储存条件:
未开封的冰冻干燥试剂可保存于4℃,开封溶解后保存于-20℃,可保存1年以上。
注意:
试剂溶解后避免反复冻融,可根据使用量分装于小管保存于-20℃。
2)蛋白酶抑制剂
3)WestBlot试剂
HRP偶联二抗
抗小鼠IgGAP或HRP偶联物
山羊抗鼠IgGAP或HRP偶联物专为Wstern杂交,噬菌斑/克隆筛选实验中获得最大信噪比而设计。
以抗IgG抗体亲和纯化。
若用于ELISA,推荐工作稀释度高于杂交。
特异性山羊抗鼠IgGAP偶联,鼠IgG,H+L链
交叉反应?
?
?
与细菌,昆虫及哺乳动物细胞的交叉反应最小
提供形式稳定溶液,-20℃保存
工作浓度山羊抗鼠IgGAP偶联:
1:
5000-1:
10000(ELISA1:
50000)
山羊抗鼠IgGHRP偶联:
1:
5000-10000(ELISA1:
50000)
AP和HRP印迹显色底物
底物适用于Western.斑点印迹显色,满足显色所需要的灵敏和低背景。
经检测与Novagen所提供的相关检测试剂盒配合使用,具良好重现性。
AP检测试剂包括BCIP和NBT标准溶液,提供20ⅹAP缓冲液,用于AP偶联物的高灵敏度生色检测。
采NBT/BCIP系统,阳性条带会产生深蓝紫色条带,不易褪色。
若要获得更高灵敏度,推荐使用化学发光方法检测。
CDP-Star?
AP底物和SuperSignal?
HRP底物都具备低于纳克级的灵敏度,可直接使用。
CDP-Star?
底物还包括Nitro-Block?
Ⅱ信号增强剂以增加标准NC膜的信噪比。
显色剂:
PIERCE化学发光检测试剂
A-B液用于检测HRP偶联的二抗,如ELISA、WesternBlot等酶底物反应,可做定量分析。
产品分为两个级别:
SuperSignalELISAFemtomaximumSensitySubstrate,检测下限10-11g
产品特点:
37℃或室温下工作,产生强烈的光信号
低背景,高信噪比
检测下限Fg级,适于大规模筛选试验
室温保存和运输,不必要4℃保存
室温六个月4℃12个月的保质期,6小时的工作液稳定性
信号可以在黑色或白色背景下读取数值
37075SuperSignalELISAFemtomaximumSensitySubstrate100ml
SuperSignalPicoChemiluminescentSubstrate检测下限10-12g
产品特点:
37℃或室温下工作,产生强烈的光信号
低背景,高信噪比
检测下限Pg级,完全满足实验室检测需求
室温保存和运输,不必要4℃保存
8小时工作液的稳定性,只有10%的信号削减
信号可以在黑色或白色背景下读取数值
37070SuperSignalPicoChemiluminescentSubstrate100ml
4)总蛋白纯化试剂
细菌裂解试剂概述
从细胞或组织中纯化蛋白时,第一步是破碎样品和抽提相关蛋白组分,这一步骤十分关键,通常用激烈的机械或酶处理使蛋白暴露于降解性条件,会直接影响目的蛋白的完整性和活性。
为了解决这一问题,研究者用Novagen开发的BugBuster,YeasBuster和CytoBuster等蛋白抽提试剂,是特别组方的去污剂,分别用于从细菌,酵母和哺乳动物细胞中温和、有效的抽提可溶性蛋白,避免采用机械处理造成的蛋白破坏。
rLysozyme?
溶液与Bugbuster试剂配合使用可以增加细菌的裂解效果。
加入Benzonase?
核酸酶可特异性降解污染的DNA和RNA,以制备可以立即用于目的蛋白纯化的无核酸,低粘度的抽提物。
蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”式混合试剂可防止粗提物中目标蛋白降解。
PopCulture?
试剂用于从液体培养的E.coli抽提蛋白,不需要离心收集细胞。
直接将0.1体积的PopCulture加到相应体积的培养基和细胞中可以在抽提时完整地保存蛋白的生物活性。
PopCulture试剂可以与rLysozyme溶液,蛋白酶抑制剂以及Benzonase核酸酶配合使用,以便得到最佳的细胞裂解效果和低粘度的,已经去除核酸的抽提液。
这种抽提方法与磁性的或滤膜亲和纯化机制的机器人自动纯化RoboPop?
试剂盒结合使用,可以完成高通量蛋白纯化工作。
昆虫细胞专用PopCulture试剂用于从培养体系中的杆状病毒感染的悬浮培养细胞,或者组织培养板贴壁培养细胞抽提蛋白,不需要离心操作。
采用这种改进方法,可以使纯化操作更为流畅,提高目的蛋白产量,也更适合表达筛选和亲和纯化的自动化。
BugBuster蛋白抽提试剂
BugBuster?
蛋白抽提试剂用于温和破啐大肠杆菌细胞壁并释放可溶性蛋白,可以替代机械方法,如弗氏压啐或超声处理等激烈处理,具有简单,快速,低成本的特点。
用于在纯化的准备阶段或其它应用中释放表达产物蛋白。
该专利配方采用的是一种能够使细胞壁穿孔而不使可溶性蛋白变性的去污剂混合物设计。
实际操作时将离心收集的细胞悬于BugBuster中。
此时,加入Benzonase?
核酸酶可将低抽提物中由于染色体释放而导致的高粘度。
简单孵育后,离心去除不可溶的细胞啐片。
澄清的抽提物可立即用于Novagen提供的亲和介质(包括GST?
Bind?
His?
Bind?
和S?
Tag?
树脂,或其它层析基质)纯化。
结合到亲和树脂上后,过量的BugBuster可通过用相应缓冲液洗柱子轻易去除。
在表达蛋白不可溶的时,BugBuster也可用于制备高纯度包涵体。
BugBuster试剂,BugBuster加Benzonase,BugBuster纯化试剂盒
标准BugBuster试剂以室温稳定,Tris-缓冲的“1ⅹ”即用型液体形式提供。
500ml试剂与10000uBenzonase核酸酶捆绑提供,用于制备低粘度抽提物并从蛋白制备物中去除核酸。
BugBuster和Benzonase与普通蛋白酶抑制剂兼容。
BugBuster纯化试剂盒含有纯化His?
Tag?
和GST?
Tag?
融合蛋白所必需的BugBuster,Benzonase.缓冲液和树脂。
BugBuster?
HT高通量蛋白抽提试剂
BugBusterHT包括BugBuster蛋白抽提试剂和Benzonase?
核酸酶。
BugBusterHT基本可以解决常规细胞裂解程序导致的常见的生物工艺问题,只需一步就可以从大肠杆菌中温和抽提可溶性蛋白,而且可以避免蛋白暴露于热和氧化性环境所遭到的破坏,并可通过核酸消化降低粗提物粘度。
制备的蛋白抽提物很容易通过常规纯化技术分级。
BugBusterHT特别适用于高通量蛋白纯化。
BugBuster10ⅹ浓缩型蛋白抽提试剂
BugBuster10ⅹ浓缩型是BugBuster蛋白抽提试剂系列专利产品中特有有浓缩配方,不含盐或缓冲成分。
用它替代即用型标准1ⅹBugBuster,研究者可以根据实际需要的稀释度加入缓冲成分。
BugBuster10ⅹ具有标准BugBuster的所有生物工艺优点,还可以自由控制目标蛋白最大抽提效率和活性所必需的PH,试剂浓度和缓冲添加剂。
BugBuster(无一级氨基)蛋白抽提试剂
BugBuster(无一级氨基)是BugBuster的一种特殊配方,用于蛋白抽提物中一级氨基干扰的情况,如蛋白固定化或交联。
BugBuster(无一级氨基)使用的PIPPS缓冲液具有与Tris-缓冲BugBuster相似的缓冲容量和PH范围,但不与金属离子形成复合物,使它特别适合于抽提金属依赖性蛋白。
PopCulture试剂
PopCulture试剂是一种浓缩去污剂配方试剂,可以不需要离心收集细胞,直接加入E-coli培养物并高效抽提蛋白。
重组蛋白在粗提物中即可分析,也可以加入亲和树脂,洗基质—目的蛋白复合物以去除培养基和细胞残片,接着从基质上交纯化的蛋白洗提下来。
整个培养,抽提和纯化步骤都可以在原来的培养管或多孔板里进行。
这种直接在培养基体系中进行蛋白检测和纯化操作特别适合蛋白组学研究和其它高通量操作要求,它使整个过程变得省时而方便。
用这种方法,用His?
Bind?
和GST?
Bind?
树脂(1,2)纯化培养物,已经获得了非常完整的融合蛋白。
采用His?
Mag?
或GST?
Mag?
磁化琼脂糖珠注可以实现全部操作在一个管里进行,而且也不需要纯化柱和离心(3).加入rLysozyme?
溶液或采用pLysS宿主菌有助于提高本方法抽提蛋白的效率。
也可以考虑加入Benzonase?
核酸酶以降低抽提物的粘度。
PopCulture试剂以即用型Tris—缓冲试剂形式提供,室温条件下很稳定。
特点
不用从培养基中分离细胞
不用机械方法破坏细胞
纯化前不需要对细胞粗提物进行处理
直接从培养体系粗提物中亲和纯化目的蛋白
在一个培养管或孔中完成所有的细胞培养和纯化操作
PopCulture纯化试剂盒
PopCulture试剂也和His?
Mag或GST?
Mag琼脂糖珠和相应的缓冲试剂组成试剂盒一起提供,也有加上rLysozyme溶液的试剂盒,采用磁化分离,使抽提和亲和纯化更加方便。
这些试剂盒足够用于40ⅹ3ml培养物纯化,依琼脂糖珠结合能力不同,3ml培养物的融合蛋白产量达His?
Tag?
375ug或GST?
Tag?
150ug。
rLysozyme溶液
rLysozyme溶液包含高纯度的,功能稳定的重组溶菌酶,用于裂解E.coli。
该酶催化细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酰胺键水解。
rLysozyme特殊的大肠杆菌裂解活性(1700KU/mg)比鸡蛋白裂解酶高250倍。
裂解酶的活性在生理PH条件下最高。
在使用BugBuster,BugBusterHT和PopCulture溶液的同时,只需加入极少量的rLysozyme(3-5000U/g细胞糊),即可加强蛋白抽提效果。
不使用蛋白抽提试剂时,直接裂解E.coli也可按每1.0g细胞糊45-60KUrLysozyme达到很好的效果。
该产品以即用型形式提供,裂解酶保存在50%甘油,50MmTris-HCL(Ph7.5),0.1NaCL,0.1MmEDTA,1MmDTT以及0.1%TritonX-100中,浓度为30KU/ul.裂解酶溶液保存条件为-20℃.
单位定义:
1u裂解酶是25℃时,每分钟使1.0ml以50mMTris-HCL,Ph7.5稀释的0.5XBugBuster重悬的(1mg/ml)Tuner(DE3)cells降低0.025A450单位所需的酶量。
Benzonase核酸酶
Benzonase核酸酶是来自Serratiamarcescens,经基因工程改进的核酸内切酶。
它能降解所有形式(包括单链,双链,线性和环状)的DNA和RNA而没有蛋白裂解活性,在广泛条件范围具有很高的特异性。
它将核酸完全消化成3-5碱基长度(杂交限度以下)的5’-单磷酸寡核苷酸,最适合从重级蛋白中去除核酸的操作,符合FDA关于核酸污染的处理规程。
Benzonase迅速水解核酸的能力使该酶成为降低粘度以减少处理时间和增加蛋白产量的最佳选择。
该酶与BugBuster蛋白抽提试剂配合使用,可以一起加入细菌,从而消除粗提物中的核酸,降低粘度。
该酶包括两个30KDa亚基,在PH6-10,0-42℃发挥功能,活化要求1-2MmMg2.该酶在存在离子和非离子去污剂,还原剂,PMSF(1mM),EDTA(1mM)和尿素条件下也有活性。
活性被150mM单价阳离子,100mM磷酸根,100mM硫酸胺或?
100mM盐酸胍所抑制。
Benzonase核酸酶以超纯(SDS-PAGE99%)和纯品(90%)级提供。
这两种产品都没有可检测的蛋白酶活性(?
1ⅹ106单位/毫克蛋白)。
99%纯度级产品经过内毒素测试,0.25EU/1000单位。
产品以含50%甘油的0.2um过滤溶液提供,-20℃保存。
单位定义:
1单位定义为在30分钟内使⊿A260值降低1.0(相当于完全消化37ugDNA).
YeastBuster酵母专用蛋白抽提试剂
YeastBuster酵母专用蛋白抽提试剂用于从Saccharomycescerevisiae和Pichiapastoris酵母细胞中,快速,高效而温和地抽提可溶活性蛋白。
采用试剂处理,可以避免激烈的机械处理造成的氧化和热度升高对目的蛋白的破坏作用。
这种Novagen的专利配方包括性质温和的去污剂,蛋白稳定试剂,tris磷酸(THP)还原试剂(THP浓缩液单独提供)。
这种使用方便的试剂可以避免采用玻璃珠研磨细胞,超声波处理或压榨法等的传统机械式操作或用β-1,3-葡聚糖酶裂解酶消化。
使用时,先离心收集细胞,再将细胞用YeastBuster重悬。
短时孵育后,离心去掉细胞残片,粗提物即可用于下步操作。
这样处理得到的粗提物中蛋白产量大,活性蛋白比例高,并且完全适合用GSTBind和Ni-NTAHisBind固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化方法进行纯化。
该试剂以100ml和500ml两种包装形式提供。
特点
温和,快速,高效地从酵母细胞抽提蛋白
避免了重复性差的研磨法,超声波法或压榨法对酵母细胞的破坏
与传统方法相比,可溶蛋白产量大,活性高
粗提物可以直接用于Ni-NTAHisBind和GSTBind亲和纯化
CytoBuster蛋白抽提试剂
CytoBuster蛋白抽提试剂采用可以从哺乳动物和昆虫细胞中高效抽提可溶性蛋白的去污剂专利配方。
CytoBuster温和的非离子成分可以分离功能活性的内源或表达蛋白,而不需要诸如超声处理或冻融等二级处理。
CytoBuster配方独特,可以直接用于Western杂交,免疫沉淀和激酶/磷酸酶分析。
该试剂与蛋白酶抑制剂,激酶抑制剂和磷酸酶抑制剂兼容。
室温保存。
用GeneJuice转染试剂编码S?
Tag融合蛋白的pTriEx载体转染COS-1细胞。
48h后,用CytoBuster蛋白抽提试剂处理细胞。
等体积样品经SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色和Westernblot.STag融合蛋白用S-蛋白AP底物和NBT/BCIPAP底物Westernblot检测。
PerfectProteinWesternMarkers同时用S-proteinAP底物检测。
昆虫PopCulture试剂
昆虫PopCulture试剂是一种新型去污剂配方的裂解液。
这种试剂专门设计用于从培养的昆虫细胞抽提蛋白,不需要离心操作。
这种改进的方法能同时获得细胞内的和释放到培养基中的蛋白,使纯化蛋白的操作更加简便,目的蛋白产量也有所提高。
昆虫PopCulture试剂适合自动化表达水平监测,也能与Ni-NTAHisBindIMAC和GSTBind亲和纯化配合使用。
昆虫PopCulture试剂纯化的细胞来源可以是培养板中的悬浮或巾壁培养的昆虫细胞。
特点:
不必从培养基中分离细胞
亲和纯化前,不需要对细胞抽提物进行分级分离
同时从细胞和培养基中收集蛋白,蛋白产量更高
直接将目的蛋白从培养体系亲和吸附到树脂上
可以和蛋白酶抑制剂混合试剂(cocktails)配合使用
为高通量自动表达水平和纯化监测设计
适合用于杆状病毒感染培养细胞
a.细菌中抽提可溶性蛋白
b.酵母细胞中抽提可溶性蛋白
c.哺乳动物中抽提可溶性蛋白
d.昆虫细胞中抽提可溶性蛋白
e.蛋白提取液中去除核酸Benzonase核酸酶
f.溶菌酶
5)融合蛋白纯化
融合蛋白
His.BindHisMag纯化试剂盒概况
His?
Bind?
家族产品品种齐全,研究者可以根据实际需要选择到最为合适的纯化试剂盒,采用固定化金属亲和色谱(IMAC)一步法快速纯化带有His?
Tag?
序列的融合蛋白。
His?
Tag序列(6,8或10连续的组氨酸残基)与固定化在NTA-和IDA-基质树脂上的二价阳离子(Ni2)结合。
当未结合的蛋白被淋洗掉后,目的蛋白即可采用咪唑或PH较低的缓冲液洗脱下来。
Novagen的这套通用的纯化系统可以被用来在温和,非变性的条件下,或6M胍盐或尿素的条件下纯化蛋白。
Novagen提供的各种His?
Bind基质可以满足几乎所有融合蛋白纯化要求。
具体包括:
小规模纤维素基质的柱或筒,可以同时纯化多种样品:
大包装易用型琼脂糖基质,进行批量纯化的重力流柱;用于最短时间快速处理多个样品的His?
Mag琼脂糖磁珠;以及达到生产级高速纯化要求的Superflow?
和Fractogel树脂。
基质有些预结合了Ni2,有些没有结合;NTA和IDA结构的都有。
BugBuster?
Ni-NTAHis?
Bind和His?
Bind纯化试剂盒
BugBuster蛋白抽提试剂是用于从E.coli高效抽提可溶性蛋白的即用型溶液,可以避免机械处理破坏细胞。
BugBuster?
Ni-NTAHis?
Bind纯化试剂盒和BugBusterHis?
Bind纯化试剂盒包括BugBuster试剂和相应的树脂,将准备可溶性细胞粗提物亲和纯化His?
Tag融合蛋白结合起来。
PopCulture?
His?
Mag磁化纯化试剂盒
PopCulture试剂是一种全新的去污剂缓冲液,用于不需要从E.coli培养体系收集细胞而直接抽提蛋白的操作。
PopCultureHis?
Mag纯化试剂盒结合了PopCulture和His?
Mag琼脂糖磁珠,缓冲液以及rLysozyme?
溶液,适合小规模培养物。
PopCulture?
His?
Mag?
磁化纯化试剂盒
PopCulture?
His?
Mag?
纯化试剂盒用于从E.coli纯化带有His?
Tag?
融合标签的蛋白,而有需要收获细胞的操作。
试剂盒将以PopCulture抽提培养体系和以His?
Mag琼脂糖磁珠亲和纯和结合起来。
PopCulture试剂是一种以去污剂为主要成分的浓缩试剂,可以直接加入E.coli培养体系,高效抽提蛋白,整个操作都不需要进行离心;而采用His?
Mag磁化琼脂糖珠纯化,使纯化操作完全在一个试管中完成,不需要过柱和离心。
PopCultureHis?
Mag纯化试剂盒包括PopCulture试剂,His?
Mag琼脂糖磁珠,相应的缓冲液以及rlysozyme?
溶液。
这个试剂盒可以用于40ⅹ3ml培养物,3ml培养物的His?
Bind?
融合蛋白产量可达375ug,实际产量依磁珠结合能力不同而不同。
这个试剂盒与Novagen的Magnetight?
磁性分离架配合使用。
特点
不需要从培养基中分离细胞
不需要机械操作破坏细胞
不需要在纯化前对细胞抽提物进行分级分离
直接将培养抽提物用亲和纯化树脂纯化目的蛋白
实现在单一的试管或孔中快速完成对整个细胞培养体系的培养,抽提和纯化操作
BugBuster?
Ni-NTAHis?
Bind?
和His?
Bind纯化试剂盒
BugBuster?
Ni-NTAHis?
Bind?
和His?
Bind纯化试剂盒分别包含Ni-NTAHis?
Bind或His?
Bind树脂,His?
Bind缓冲试剂盒(仅限His?
Bind试剂盒),Benzonase核酸酶以及BugBuster蛋白抽提试剂,可以方便地进行可溶性细胞抽提物以及亲和纯化His?
Tag?
融合蛋白。
BugBuster蛋白抽提试剂可以温和的瓦解E.coli细胞壁并释放出可溶性蛋白。
操作时,一般将离心收获的细胞重悬在BugBuster中。
此时,可以加入Benzonase?
核酸酶以降低因染色体DNA释放造成的抽提物过高的黏性。
抽提较大的蛋白时,也可加入rLysozyme?
溶液以增强抽提效率。
短进孵育后,离心除去不溶的细胞残片。
抽提物上清液即可用于Ni-NTAHis?
Bind和His?
Bind树脂亲和纯化。
当目的蛋白与亲和树脂结合后,多余的BugBuster很容易用相应的缓冲液洗掉。
采用BugBusterNi-NTAHis?
Bind试剂盒,是在还原环境纯化蛋白
如果考虑多次反复使用His?
Bind树脂,可以选用BugBusterHis?
Bind纯化试剂盒。
His?
Tag?
亲和树脂和?
缓冲液试剂盒
NTA和IDA化学基团
使用His?
Tag?
/His?
Bind?
技术,可根据作为序列的组氨酸与固定化金属离子(通常为Ni2或Cu2)的亲和力来进行纯化。
金属螯合到固相支持物共价结合的反应性基团上,最学用的螯合物包括氮川乙酸(NTA)和亚氨二乙酸(IDA),它们分别具有四个和三个与金属离子相互作用的位点。
在天然和变性条件下,这两种化学基团和亲和介质以及其目标蛋白的结合,洗涤和洗脱条件的特性不尽相同。
实际应用中,NTA因多一个螯合位点,使纯化过程中金属浸出最小,并与还原三硫键的20Mmβ-巯基乙醇相容。
缓冲液中存在其它螯合或还原成分时,由于IDA树脂的高金属浸出率纯化结果通常不够好。
然而,IDA介质可以循环使用几百次而性能基本保持不变。
对于不同介质,可以通过改变条件以形成最优化的特定的纯化系统,从而使目的蛋白的纯化效果达到最佳。
最为常见的就是通过调整天然条件下洗涤和洗脱缓冲液的咪唑浓度,尽量减少非特异结合蛋白的共纯化。
HisBind和HisMag基质选择指南
HisTag亲和树脂和缓冲液试剂盒
HisBind柱
为方便使用而设计的His?
Bind柱预装了1.25ml柱订体积的Ni结合His?
Bind树脂。
顶部和底部的玻璃丝确保上样和走柱时缓冲液均匀流动而干扰最小。
使用BugBuster?
和Benzonase?
核酸酶制备的细菌裂解物进行纯化,效果更好。
HisBind和His?
Bind快速纯化缓冲液试剂盒
HisBind缓冲液试剂盒是一套经过测试优化的缓冲液,配合IDAHis?
Bind树脂一起使用,通过金属螯合层析方便快速地一步
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