大肠杆菌提取DNA.docx

大肠杆菌提取DNA.docx

《大肠杆菌提取DNA.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠杆菌提取DNA.docx（25页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

大肠杆菌提取DNA

中文摘要

目的：

用试剂盒法和碱法提取p16重组质粒的比较。

方法：

1.5ml菌液移入50mlLB液体培养基中培养12h，将试剂盒法和碱法各分3组，每组加入3.0ml菌液，每种方法中有两组是对照试验；紫外分光光度计法测OD值；酶切；琼脂糖凝胶电泳。

结果：

碱裂法的OD值分别为：

1.583；1.575；1.735，质粒DNA的浓度为：

3.060；3.150；2.370。

试剂盒法的OD（260/280）值为：

1.614；1.605；1.656。

质粒DNA的浓度为：

；0.390；0.420；0.600。

结论：

碱法与试剂盒法用统计学分析没有显著差异。

试剂盒法简单、快捷，DNA纯度高，但质粒DNA的浓度低，提取质粒DNA的量少，并且试剂盒价格昂贵，碱法价格低廉，质粒DNA的浓度高，提取质粒DNA的量多，所以具有较强的实用性，适用于一般实验室研究工作。

关键词：

质粒；试剂盒法；碱法；

Abstract

Purpose:

Drawthecomparisonthatp16recombinatedtheplasmidwiththereagentboxlawandalkalilaw.Method:

1.5mlfungusliquidmovein50mlLBliquidculturetrain12h,reagentboxlawandalkalilawall3group,everygroupjoins3.Thefungusliquidof0ml,therearetwogroupsthataretestedbythecontrastineachkindofmethod;ThelawofpurpleotherspectrophotometerexaminesODvalue;Theenzymeiscut;Agar-agarcandygelelectrophoresis.Result:

ItsplitalkaliODthelawoneincluding:

1.583;1.575;1.735,thedensityofplasmidDNAis:

3.060;3.150;2.370.WhetherreagentOD（260/280）,boxoflawvalueis.1.614;1.605;1.656.ThedensityofplasmidDNAis:

;0.390;0.420;0.600.Conclusion:

Alkalilawandreagentboxlawanalysewithstatisticsthatthereisnotremarkabledifference.Thereagentboxlawissimple,swift,DNAishighinpurity,butthedensityofplasmidDNAislow,thereislittlequantityofdrawingplasmidDNA,andthereagentboxcostsanarmandaleg,thealkalilawischeap,thedensityofplasmidDNAishigh,thereismuchquantityofdrawingplasmidDNA,sohavestrongerpracticability,suitablefortheresearchworkofgenerallaboratory.

Keyword:

Plasmid;Reagentboxlaw;Alkalilaw;

前言

P16基因又叫MTS（multipletumorsuppressor1）基因，是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参予细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞株发现有纯合子缺失、突变，认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因，有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。

P16基因已经在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中发现。

纯合子缺失以及无义、错义及移码突变，表明P16基因以缺失，突变方式广泛参予肿瘤形成，检测P16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。

　　质粒是在核体外游离的小型双股DNA分子。

多为共价闭合环状，也发现有线状，分子量在106-108之间。

质粒基因组约为核体的1％，含细菌生命非必需的基因，其功能是控制产生菌毛、毒素、耐药性和细菌素等遗传性状。

质粒能独立复制，随宿主分裂传给子代菌体，有些质粒能与核体DNA整合或脱离，这类质粒称为附加体。

质粒具有与外来DNA重组的功能，所以在基因工程中被广泛应用为载体。

质粒不同，在宿主细胞中的拷贝数也不同。

根据质粒在细胞中拷贝数不同按Rownd的建议，把质粒分为松弛型质粒和严紧型质粒。

严紧型质粒多半是一些具有自身传递能力的大质粒。

其DNA的复制与宿主染色体DNA的复制相偶连，受到某种程度的控制，每个细胞仅有1-2个拷贝。

分子量较大，自身传递是这类质粒的特点。

松弛型质粒多半是分子量最小、不具传递能力的大质粒。

其复制是在松弛控制之下进行的，每个细胞的拷贝数约10-200个。

当向培养基中加入氯霉素时，细菌蛋白质的合成被抑制，细菌染色体DNA和严紧型质粒DNA的复制停止，松弛型质粒DNA的复制继续进行，拷贝数甚至可达到数百个。

基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒。

质粒的提取的方法很多，常用的有碱法、煮沸法和试剂盒法。

试剂盒法虽然效果好，但由于价格昂贵，如果需要大量使用将会增加实验所需成本；而碱法少量提取法效果近似试剂盒法，而且实验成本低，用这种方法提取的质粒DNA不仅可以满足本实验室遗传工程实验的要求，还可以满足大多数分子生物学常规实验的需要，并且结果稳定性好又经济，对实验设备要求不高，非常适合大多数实验室使用。

本次试验仅用碱法和试剂盒法进行对比。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1试剂

菌液（含PCR-P16）：

畜牧兽医学院中心实验室保存

酚；

酚：

氯仿（1:

1）；

氯仿；

无水乙醇：

沈阳第一试剂厂

70%乙醇；

无DNA酶的RNA酶；

EcoRⅠ酶及缓冲液：

宝生物工程（大连）有限公司

XhoⅠ酶及缓冲液；

DNAMarker：

宝生物工程（大连）有限公司

10XLoadingBuffer：

宝生物工程（大连）有限公司

TAE缓冲液；

溴乙锭；

琼脂糖；

试剂盒：

V-geneBiotechnologyLimited

1.1.2仪器

1.5ml消毒的聚丙烯离心管数个；

台式离心机TGL—16B上海安亭科学仪器厂制造；TGL—16B

HZQ—X100水浴振荡器哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；

电泳仪；DYY-5型

电泳槽；DYCp-31D

冰箱；

电热恒温培养箱上海精密实验设备有限公司；

天平；LIBROREB-280

分光光度计（SHIMADIUSPECTROPHOTOMETERUV-120-02）；

微波炉；

紫外线检测仪；捷达科技

微量移液器；

PH仪

漩涡混合器（XW-80A上海精科实业有限公司）

1.1.3主要溶液的配制

LB液体培养基的配制：

细菌培养用胶化蛋白胨0.5g

细菌培养用酵母提取物0.25g

NaCl0.5g

去离子水47.5mL

搅拌溶解后，加入5mol/L的NaOH调节PH至7.0，加入蒸馏水至总体积为50ml，高压灭菌20min（1.034×105pa，温度121℃）。

STE的配制：

NaCl0.1mol/L

Tris·Cl（PH8.0）10mmol/L

EDTA1mmol/L

溶液Ⅰ的配制：

葡萄糖50mmol/L

Tris·Cl（PH8.0）25mmol/L

EDTA10mmol/L

该溶液可以配制成100ml，在10bf/in2（6.896×104Pa）高压下蒸气灭菌消毒15分钟，贮存于4℃。

溶液Ⅱ的配制：

（新鲜配制）

NaOH0.2mol/L

SDS1%

溶液Ⅲ的配制：

5mol/LKac60ml

冰醋酸11.5ml

H2O28.5ml

配制好的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐，6mol/L醋酸（PH4.8）

TE缓冲液的配制：

（PH8.0）

Tris·Cl（PH8.0）10mmol/L

EDTA（PH8.0）1mmol/L

DNA酚/氯仿抽提液的配制：

将平衡酚溶液与氯仿溶液等体积混合，用0.1mol/LTris-HCI（PH7.6）反复抽提，从而平衡这一混合物。

，然后将培植的溶液置入棕色瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/LTris-HCI（PH7.6）液层，保存于4℃。

醋酸钠溶液的配制：

在80ml中溶解40.81g三水醋酸钠，用冰醋酸调节PH值至6，加水定溶至1L。

E.B.溶液的配制：

在100ml中加入1g溴乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后转移至棕色瓶中保存于室温。

溴乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。

1.2方法

1.2.1细菌的培养和菌种的保存

（1）在装有50mlLB液体培养液的锥形瓶中加入100μl氨苄青霉素（0.5g/ml）。

取1.5ml大肠杆菌液移至培养液中，瓶口用灭菌棉塞封口，37℃气浴强烈摇荡过夜。

（2）在无菌环境下取出450μl左右菌种，放入Eppendorf管中，在管中注入同体积经过高压灭菌处理过的甘油，用封口膜将管口封住并振匀，在-20℃下保存菌种。

1.2.2质粒DNA提取的方法

1.2.2.1碱法提取质粒DNA

操作步骤：

（1）取菌液1.5ml置于微量离心管A1、A2、A3中，以12000rpm离心30s，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。

再吸取1.5ml菌液置于微量离心管A1、A2、A3中，以12000rpm离心30s，弃去上清液，用滤纸吸干水分，使细菌沉淀尽可能干燥。

（2）取溶液Ⅰ100µl分别加入到A1、A2、A3中，剧烈振荡，使其混合均匀；

（3）取200µl溶液Ⅱ分别加入A1、A2、A3中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，使其混匀并接触充分，不要振荡，将其置于冰上。

（4）加入150µl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口将管倒置后温和振荡10秒钟，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，将其置于冰上3-5分钟。

（5）以12000rpm离心5min，小心吸取上清液，转移到新的3个离心管中，并加入等量酚：

氯仿（1：

1）500µl，离心2min，轻轻拿出，吸取上清液约400µl（不要碰到蛋白层，宁可少取）。

（6）加入2倍容积800µl乙醇（室温），并加入40µl醋酸钠，放入冰箱冷冻2h，用微量离心机12000rpm离心5min，上清液，将离心管倒置于滤纸上，吸干水分。

（7）加入1ml70%乙醇洗涤双链DNA沉淀，吸去上清液，使沉淀尽可能干燥，放入干燥箱中干燥约30min。

（8）用50µlTE溶解核酸，振荡，保存于冰箱中，过夜。

（9）加入3µlRNA酶，放置37℃水浴箱中1h，加500µlTE，以12000rpm离心5min，吸取上清液转移到新的3个离心管A1、A2、A3中，并加等量酚：

氯仿（1：

1）500µl，以12000rpm离心2min。

加2倍体积无水乙醇1000ml，再加入40µl醋酸钠。

放入冰箱中冷冻2h。

（10）取出以12000rpm离心5min，弃去上清液，用1ml70%乙醇洗涤双链DNA沉淀。

吸去上清液，使沉淀尽可能干燥，放入干燥箱中干燥约30min，直至透明。

加入50µlTE，保存于冰箱中。

1.2.2.2试剂盒法提取质粒DNA

实验准备：

（1）将随试剂盒携带的RNaseA1全部加入BufferS1中，混合均匀，4℃密闭贮存。

（2）在BufferW2中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀。

室温密闭贮存。

操作步骤：

（1）吸取1.5ml菌液分别置于3个离心管B1、B2、B3中，以12000×g离心30s，弃尽上清。

再吸取1.5ml菌液置于B1、B2、B3中，以12000×g离心30s，弃尽上清。

（2）分别在B1、B2、B3中，用250µl已加入RNaseA1的BufferS1，用漩涡混合器充分悬浮细菌沉淀。

（3）分别加入250µlBufferS2，温和但充分地上下翻转混合4～6次，不超过5min。

BufferS2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶解效率。

（4）分别加入400µlBufferS3，温和地上下翻转8～10次，室温静置2min。

12000×g离心10min。

避免剧烈混合。

（5）将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，将步骤4中的离心上清加入DNA-prepTube中，2500×g离心1min。

（6）弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，分别加500µlBufferW1，2500×g离心1min。

（7）弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，分别加入700µl已加无水乙醇的BufferW2，2500×g离心1min，以同样的方法再用700µlBufferW2洗涤一次。

（8）将DNA-prepTube置于1.5ml离心管中，12000g离心1min。

（9）将DNA-prepTube置于另一清洁的1.5ml离心管B1、B2、B3中，在silica膜中央加60µlEluent，室温静置1min。

12000×g离心1min洗脱DNA，放入冰箱中保存。

1.2.2.3质粒DNA的酶切

在碱法和试剂盒法中，分别取出A1，B2管（1.5ml离心管）作一下步骤：

去离子双蒸无菌水15ml

Lodingbuffer2µl

质粒2µl

EcoR1酶1µl

在37℃的水浴中过夜。

1.2.2.4琼脂糖凝胶电泳

制作0.9%的琼脂糖凝胶：

（1）称取0.9g的琼脂糖，放入三角瓶中，再加100ml0.5*TBE（Tris-硼酸-EDTA）电泳缓冲液。

（2）在微波炉中加热使琼脂糖溶解，（液体比要超过三角瓶容积的一半，以1/3较好）用滤纸塞于瓶口，留出缝隙，以防瓶盖在加热时被蒸汽冲开。

（3）制胶模具的两端用医用橡皮膏封好，再其边缘加上少量琼脂糖溶液，凝固后有防泄露作用。

（4）将琼脂糖倒入模具，凝胶厚度一般为0.5cm。

迅速在模具一端安插上梳子，检查有无气泡。

（5）室温下30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固（低熔点凝胶应于4℃凝固），小心取出梳子，并撤除模具两端的橡皮膏，将凝胶放置于电泳槽中准备电泳。

琼脂糖凝胶电泳：

（1）将提前制作好的0.9%琼脂糖凝胶块置入电泳槽内（琼脂糖凝胶浓度与线形DNA分辨范围，如表2-2），并向电泳槽内注入电泳缓冲液，缓冲液的高度应覆盖过胶面1cm左右。

（2）将1µlLodingbuffer加入到2µl样品溶液中混合，然后用微量注射器注入样品槽中。

在最后一个样品槽中加入DNAMarker，作为对比。

（3）连接电极、设定合适的电压（120V 44mA）及转换时间，并开始电泳，同时观察染料到到琼脂糖凝胶的2/3时断电，停止电泳。

（4）电泳结束后，取出琼脂糖板，将其放入含EB的水溶液中着色10min，放入紫外线检测仪，观察结果。

1.2.2.5DNA浓度与OD值的测定：

实验步骤如下：

（1）打开紫外分光光度计预热10min。

（2）在一个比色杯中加入蒸馏水,体积超过比色杯的2/3作为对照，放入样品槽，仪器调零。

（3）吸取5µlDNA样品，置于另一比色杯中，加入2985μl蒸馏水（DNA浓度被稀释600倍），打匀，放入另一样品槽。

（3）在260nm和280nm分别读出样品光密度值。

2结果和分析

2.1结果

2.1.1DNA溶液的OD值

表1.样品OD值结果表

方法

OD（260nm）

OD（280nm）

浓度（µg/µl）

OD值（260/280）

A1

A2

A3

0.102

0.096

3.060

1.583

0.105

0.111

3.150

1.575

0.079

0.092

2.370

1.735

B1

B2

B3

0.013

0.012

0.390

1.614

0.014

0.013

0.420

1.605

0.020

0.018

0.600

1.656

样品浓度（µl/ml）=OD（260nm）值×50µg/1000µl×600倍。

数据的统计学检验：

在统计学上，把小概率事件在一次实验中看作是实际上不可能发生的事件，称为小概率事件不可能原理

SX1-X2=

（

S12+S22

）0.5

n

t=

X1-X2

SX1-X2

Df=

（n1-1）+（n2-1）=4

注：

N为样本数

X1为碱法OD值平均数

X2为试剂盒法OD值平均数

S12为碱法均方

S22为试剂盒法均方

SX1-X2为均数差异标准误

经统计学计算t=0.111，∣t∣0.05

即差异不显著，可以认为两组数值无差别

2.2.2琼脂糖凝胶电泳结果

D1J2M

图1.经过酶切质粒DNA的电泳图

D1为碱法

J2为试剂盒法

M为DNAMarker

D1D2D3J2

图2.没去RNA的电泳图

D1~D3为碱法

J2为试剂盒法

2.2.分析：

（1）通过表1可见，试剂盒法B1、B2、B3的OD值在1.6~1.8之间，说明试剂盒提取DNA的纯度高，但DNA的浓度低，提取质粒DNA的量较少。

碱法A1、A2的OD值小于1.6，纯度不高，但DNA的浓度高，提取质粒DNA的量比试剂盒法多。

（2）通过图1与图2可以观察出，RNA去除的比较好。

碱法与试剂盒法的电泳结果几乎没有区别，但从DNA的浓度来讲，碱法的要好于试剂盒法的，不知是什么原因浓度对电泳结果没有影响，使得电泳结果几乎没有区别，还需进一步研究。

（3）通过统计学计算分析，这俩种方法没有显著差异，鉴于试剂盒法价格比较昂贵，不适合大批量实验，而碱法价格低廉，适合实验室使用，具有较强的实用性。

3讨论

3.1质粒概述

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

质粒是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。

是一种环状的双链DNA分子。

存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

通过细菌间的接合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，是分子克隆常用的载体之一。

质粒DNA制备是进行分子克隆的第一步。

因此分离纯化质粒DNA，在遗传工程和质粒的分子遗传学研究中是重要的一环。

质粒DNA能够携带外源基因进入细菌进行扩增或表达外源基因，作为基因的运载工具，在DNA重组技术，DNA测序，转基因等方面具有广泛的应用价值，因而质粒DNA的分离与提取是实验室内最常用的实验技术。

1946年，Lederburg和Tatum发现的F因子是最早发现的质粒，因为F因子与高等生物细胞质中的染色体外遗传单位极为相似，1952年，由Lederburg正式命名为质粒。

确切的说，质粒是细菌内共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要的媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。

3.2质粒提取的主要步骤：

已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：

细菌培养物的生长；细菌的收获和裂解；质粒DNA的纯化。

3.2.1细菌培养物的生长

　　从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（有含有行当抗生素的液体培养基中生长），然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。

现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。

此时，不必造反性地扩增质粒DNA。

然而，较长一代的载体（如pBR322）由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。

氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。

这样，像pBR322－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。

多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml）已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

3.2.2细菌的收获和裂解

　　细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。

选择哪一种方法取决于3个因素：

质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。

尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

（1）大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。

将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。

这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

（2）可用更剧烈的方法来分离小质粒。

在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过碱处理使之裂解。

这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。

当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

（3）目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。

然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。

大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。

有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。

3.2.3质粒DNA的纯化

　　常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性