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定量PCR中ct值的含义
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
一. 实时荧光定量PCR原理
所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct值的定义
在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念——Ct值。
C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图1所示)。
图1.Ct值的确定
2. 荧光域值(threshold)的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:
threshold=10´SDcycle6-15
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕,起始拷贝数越多,Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值(如图2所示)。
因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图2.荧光定量标准曲线
4. 荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:
荧光探针和荧光染料〔2〕。
现将其原理简述如下:
1)TaqMan荧光探针:
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
如图3所示。
图3.TaqMan荧光探针工作原理
2)SYBR荧光染料:
在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
二.内标在传统定量中的意义
1.几种传统定量PCR方法简介〔3〕:
1)内参照法:
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。
上游引物用荧光标记,下游引物不标记。
在模板扩增的同时,内标也被扩增。
在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板〔4〕。
2)竞争法:
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。
在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。
扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数〔5〕。
3)PCR-ELISA法:
利用地高辛或生物素等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。
常规的PCR-ELISA法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的〔6〕。
2.内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差。
同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验,所得结果有很大差异(见图4),因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。
加入内标后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性。
但即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
图4.相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图
终点处检测产物量不恒定;Ct值则极具重现性
三.内标对荧光定量PCR的影响
1.实时荧光定量PCR无需内标
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。
因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:
1)Ct值的重现性
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
(见图4)
2)Ct值与起始模板的线性关系
由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
2.内标对实时荧光定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著〔7,8〕。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较,得出的结论是:
内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的,而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方〔9〕。
AppliedBiosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准,可实现多色荧光同时检测,但定量检测仍然采用外标准曲线的方法,而不用内标进行定量。
综上所述,利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域〔10,11,12,13〕。
参考文献
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荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念
基线(Baseline):
是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大。
接近一条直线,这样的直线即是基线。
荧光域值(threshold)的设定:
一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR第3—15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
CT值:
表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。
反之亦然。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数。
纵坐标代表CT值。
因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
扩增曲线
PCR过程中,以循环数为横坐标,以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线
判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面:
1、曲线拐点清楚,特别是低浓度样本指数期明显,扩增曲线整体平行性好,基线平而无上扬现象,低浓度样本扩增曲线指数期明显。
2、曲线指数期斜率与扩增效率成正比,斜率越大扩增效率越高。
3、标准的基线平直或略微下降,无明显的上扬趋势。
4、各管的扩增曲线平行性好,表明各反应管的扩增效率相近。
熔解曲线
对PCR产物加热,随着温度的升高,双链扩增产物逐渐解链,导致荧光强度下降,到达某一温度时,会导致大量的产物解链,荧光急剧下降。
利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同,因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同,可通过此对PCR的特异性进行鉴定。
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