TUNEL染色.docx

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TUNEL染色

相关疾病：

∙

产品名称：

罗氏（Roche）公司Tunel试剂盒英文名称：

Tunel产品货号：

产品规格：

50T试剂级别：

试剂级产品产地：

USA产品商标：

RocheInsitucelldeathdetectionkit-POD法

一、原理：

TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡初期进程中细胞核DNA的断裂情形。

其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdTEnzyme）的作用下，能够连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH结尾，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反映产生很强的颜色反映（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因此在光学显微镜下即可观看凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因此没有3‘-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评判，和通过双色法确信细胞死亡类型和分化时期。

二、器材与试剂器材：

光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：

试剂盒含TdT10×、荧光素标记的dUTP1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：

PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH）或细胞通透液（%TritonX-100in%sodiumcitrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。

三、实验步骤操作流程图：

制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。

具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：

1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：

上面两步是针对石蜡切片样本的处理4.用ProteinaseK工作液处理组织15-30min在21–37°C（温度、时刻、浓度均需试探）或加细胞通透液8min；5.PBS漂洗2次；6.制备TUNEL反映混合液，处置组用50μlTdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μlDNase1，反映在15~25℃×10min，后面步骤同处置组。

7.玻片干后，加50μlTUNEL反映混合液（阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映37℃×1h。

8.PBS漂洗3次；9.能够加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；10.玻片干后加50μlconverter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映37℃×30min。

11.PBS漂洗3次；12.在组织处加50~100μlDAB底物，反映15~25℃×10min；13.PBS漂洗3次；14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后当即用自来水冲洗。

梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观看凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。

可结合凋亡细胞形态特点来综合判定（未染色细胞变小，胞膜完整但显现发泡现象，晚期显现凋亡小体，贴壁细胞显现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）关于培育细胞的预处置：

①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（见备注4），干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保留；②适当方式诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心搜集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞专门好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛（见备注2）中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤将吸附细胞的载玻片在%的TritonX-100（见备注5）中处置5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；后续操作犹如石蜡包埋切片的6—15四、注意事项1.进行PBS清洗时，每次清洗5min。

2.PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。

3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。

4.TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。

不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。

5.如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。

6.用甲基绿（MethylGreen）染液（3-5%甲基绿溶于醋酸巴比妥）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。

然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观看操作。

若是现在利用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。

7.荧光素标记的dUTP液含甲次*酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。

8.试剂保留；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter-POD液一旦解冻，以后就保留在4℃（2~8℃）下，至少在6m内稳固，幸免再次冻存；TUNEL反映液临用前配好后，放至冰上直至利用。

9.结果分析时注意：

在坏死的晚期时期或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN**断，从而引发假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，和细胞外的矩阵成份阻止TdT进入胞内反映，进而产生假阴性结果。

能够选择利用Biotium公司的Tunel试剂盒，是荧光法的成效超级的好，价钱也有优势，若是有需要能够联系《上海开放生物》-Biotium中国总代理，另外还有生物素标记的dUTP试剂（包括不同连接臂长度的产品），能够为您的实验提供更多的选择性，希望能够帮到您！

A、B二液混合，30μl/每片37℃1h

PBS洗3×3min

Streptavidin-HRP1:

20037℃30min

PBS洗3×3min

%DAB+%H2O2显色10min，水洗

苏木素衬染1min，水洗蓝化

吹干后常规树脂封片

观看：

凋亡指数（apoptosisinde×，AI）在一般光镜下持续观看10个高倍视野计数阳性细胞数，换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为AI。

其他

IRAM:

我在做Tunel检测细胞凋亡，用的是Roche公司的试剂盒，步骤如下：

细胞固定（4%多聚甲醛室温40分钟后70%乙醇-20度1小时）--3%H2O2in甲醇室温10分钟%-100in%枸橼酸钠4度冰箱冰上通透3分半钟--加入TUNEl反映混合物，37度湿盒90分钟--加入POD，37度湿盒40分钟--加入DAB100微升，室温10分钟--苏木素2分钟。

其间每步均用PBS洗涤3次，共5分钟。

 我做了两次，但成效均步理想，好象没有看到有细胞核被染成黄色的凋亡细胞（我的细胞应该是有凋亡的），因为试剂有限未做阳性对照，阴性对照结果与实验组无明显差距，实在不明白是怎么回事。

是我的试剂没有配对仍是染色出了问题？

Nevin:

因为我也在用tunel检测细胞的淍亡，看了你的步骤后，提几点意见：

一、“3%H2O2in甲醇室温10分钟”的方式仿佛有点问题，我以为H2O2的浓度偏高，有两种选择：

A，%H2O2in甲醇；或B，3%H2O2。

请注意浓度的转变。

因为H2O2会减弱TdT的活性，可致假阴性。

二、加入TUNEl反映液，要新鲜配制，后放置冰浴中备用。

这也是tunel成功的关键。

3、能够用蛋白酶K消化试试。

totoo:

我的实验是做兔角膜的切片的TUNEL的检测，用的是promega的荧光的试剂盒用FITC标记dUTP反映。

蛋白酶k消化的浓度20ug/ml.10ug/度30分钟。

我的正常的角膜应该有阳性的结果，可是没有阳性？

midas:

对角膜进行的什么处置？

能够先用您盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，若是能够染出来那么能够证明您的盒子应该是没有什么问题的。

totoo:

我已经用盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，阳性对照出结果，而我做的角膜片子而不出结果

pljgirl：

请教列位大侠：

有谁做过细胞凋亡的Tunel染色的吗？

我用的是博士得得MK1020试剂盒1080元20个反映，可是他们得石蜡阳性片我染的专门好，确实是细胞片不怎么着色？

我做Tunel时，加TDT标记液是37度2小时，之前加蛋白酶K消化30秒，没加Trtrion，因为试剂盒没要求，博士得的试剂盒说细胞涂片连蛋白酶K消化都不用，这些操作步骤合理吗？

newfish：

我用的是中山的蛋白酶K不是石蜡片采纳么？

细胞不用吧！

做那个实验有几个关键的地址，不能干片固定咱们一样用4％多聚甲醛30分钟。

染色时不要只是看试剂盒怎么说，还要一张一张染，在镜下观看看到染上了再终止。

另外你能够用苏木素复染！

！

DONGHAIJU：

我此刻正在做细胞凋亡的TUNEL检测，用的是Boehringermannheim公司的试剂盒，结果还不错，3600元50次反映，你的实验步骤是如何进行的？

可否写下来讨论一下缘故？

刚开始我的实验也是没有结果，后来改变的实验步骤，结果就出来了，成效也不错。

我的实验步骤可能如下：

一、石蜡切片脱蜡至水，

二、%H2O2的甲醇液室温作用5分钟，lPBS清洗两次，每次5分钟

3、20ug/ml蛋白酶K处置，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗，

4、加入TUNEL反映混合液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育1小时，PBS清洗，

五、3%BSA室温作用20min,PBS清洗

六、POD转换液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗

7、DAB显色5~10min，自来水冲洗，

八、苏木素复染，盐酸酒精分化20s，自来水冲洗20min，

九、梯度脱水50%，70%，80%，90%，100%

（1），100%

（2），2min/次

二甲苯透明两次，10min/次，中性树胶封固，镜下观看。

大灵通：

我想做细胞爬片，然后加不同浓度增进凋亡的药物，然后做TUNEL检测凋亡情形。

问题有二：

一、随药物浓度升高，凋亡比例愈来愈高（我做流式取得的结论），可是很多调亡细胞都漂了，那会可不能阻碍TUNEL结果？

不明白我说明白没有？

确实是说尽管调亡细胞增多，可是漂的愈来愈多，玻片从培育液里拿出来细胞都留在培育液里了！

可是文献上也都是这么做的呀。

他们的细胞莫非凋亡了也都留在片子上的么？

二、在用4%多聚甲醛固定细胞时，4%多聚甲醛是4度的仍是常温的？

我用的是博士德的试剂盒，没说要4度，文献上有的写用，有的没提，我到底用不用呢？

zhaoqingshan：

其实，确实是如此的，凋亡的细胞在开始走向凋亡的通路的时候，或许在分岔口就已经离开贴壁了。

有两点建议：

一、听说国产的TUNEL试剂盒质量不太好，我以前用的是Roche的；

二、4%多聚甲醛用常温固定15-20分钟即可；

3、显然，凋亡的细胞大多数已经离开玻璃片了，因此应该把漂浮起来的细胞搜集，然后甩片粘在玻璃片上，才能充分说明问题。

4、Tunel最后还得采纳图像分析的方法计算结果，比较主观，只能算是半定量。

你也能够用Tunel试剂上流式啊！

大灵通：

TUNEL最后是要做记数的，若是随药物浓度升高细胞凋亡增多，但却都漂了。

举个例子，比如在A浓度时细胞实际凋亡40%，B浓度时细胞实际凋亡80%，可是因为很多凋亡细胞漂起来了的，极可能最后发觉B浓度的片子反而凋亡数少，因为细胞都跑了。

乃至B浓度时片子上都没有什么细胞了呀！

若是要搜集漂的细胞，那以什么比例往片子上涂？

因为这涉及最后凋亡的比例呀。

而且文献上关于细胞爬片没有这么做的，都是捞出片子就做固定，乃至还有效PBS洗5分钟再固定的，莫非他们就没有我的问题？

zhaoqingshan：

不做爬片不行吗？

做流式啊！

尽管，我也接触图像处置和分析很多时刻，个人以为仍是比较主观的。

做几个爬片当样子，出几张漂亮点的图就好了。

wangzhang：

可否试探一下固定的机会呀，也确实是说，细胞凋亡是有一个进程的，可不能够，分不同的时段固定，比较一下，在何时固定的细胞脱落的又少，还能看出不同呢。

必然要用TUNEL看爬片吗？

我曾将药物处置过的细胞离心后，悬于Hochest33258,若是药物的凋亡作用明显的话，也能专门好的看出来。

大灵通：

流式我已经做完啦，是用PI染色的。

共5个药物浓度组：

0，5，10，20，40，都是作用24小时。

我发觉随药物浓度升高，凋亡比例不断增加。

除流式，TUNEL也是我实验的一部份。

我确实是想用细胞爬片做TUNEL,也是5个药物浓度组：

0，5，10，20，40，也是作用24小时，观看凋亡比例。

在做流式的时候我就发觉：

随浓度升高，漂的细胞不断增加，凋亡比例也不断增加。

因为做流式是不怕细胞漂的（最后搜集瓶内所有细胞上流式细胞仪），可TUNEL就不一样啦！

你看我如此行不，药物作用到时刻后，轻轻从孔里掏出玻片（我用的是12孔板内放小玻片的方式），尽可能不晃动，使漂的细胞也被带上来一部份，然后当即固定。

每一个浓度都如此操作，尽管不太正规，但象青衫说的那样，会出几个好片子，凋亡比例我内心有数哇！

要不还有啥方法呀？

zhaoqingshan：

那样是不行的，因为不洗掉血清的话，固定的时候会很难看的，而且血清中的蛋白会黏附在细胞上被固定了。

zhizuchangle：

也即将做TUNEL了，我可能也会碰到类似大灵通的问题，我打算用96孔板做TUNEL,如此能够节省试剂，象大灵通所说的，冲洗时会把凋亡的细胞一路洗掉，确实很让人头疼，那个问题应该如何解决啊，

victoh：

（TO大灵通一、）事实上TUNEL更大的意义在于检测体内凋亡，假设做体外定量研究贴壁生长的细胞时，应该将悬浮的细胞搜集起来，只是如此统计起来较为麻烦，固然能够别离计数贴壁/悬浮的细胞数量，培育细胞做TUNEL要紧用于定性的研究。

（TO大灵通二、）我平常将PFA置于4度冰箱内保留，历时掏出即用

用TUNEL检测细胞凋亡，想比较各组的凋亡率的不同用什么统计方式

pengwenf09:

请问，用TUNEL检测细胞凋亡，因为是率的比较。

应该用卡方查验，但如果是我想比较两两之间的不同又该用和种查验呢？

maokai123:

是不是t查验

pengwenf09:

我感觉是不是更应该用单因素方差分析。

maokai123:

查查excel的帮忙吧里面有比较详细的推荐。

不确实是比较两组样本不同在必然置信水平下的显著性吗？

你看看excel推荐的函数直接套用就好了。

鄱译问题

武林高手：

那位高手帮忙翻译一下：

TUNELstainingwasperformedaccordingtosupplierdirectionsusinginsitucelldeathdetectionkit,fluorescein（BoehringerMannheim）.Sectionsweredeparaffinized,rehydrated,andwashedwithPBSfor10minfollowedbywashingwithpermeabilizationsolution%TritonX-100,%sodiumcitrate）for5minandthenwashedtwicewithPBS.Sectionswerethenincubatedwithlabelingsolution（BoehringerMannheim）for1hinhumidchamber.AfterthreewasheswithPBSsectionswereblockedinblockingsolutionsuppliedbytheZymedkitfor30min.Sectionswereincubatedovernightwithrabbitanti-ErbB-4antibodiesatafinalconcentrationof1:

100.FollowingthreewasheswithPBS,sectionswereincubatedwithrhodamine-conjugatedgoatanti-rabbitIgG（1:

100finaldilution）for2h,washed,andmountedforimmunofluorescentmicroscopy.

Tunel后在封锁液中封锁30分钟Why?

用的是什么封锁液？

situ,permeabilization,Triton是什么意思？

qxm：

insitu：

在原位，原处。

permeabilization：

破膜，在细胞膜上打孔的意思。

TRITON确实是用来破膜的

jpxq：

翻译如下，不妥的地方请纠正：

依照试剂说明书用原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL染色。

荧光素（BoehringerMannheim公司提供）.切片脱腊入水，用PBS洗。

10min后用通透液%TritonX-100,%枸橼酸盐）通透5min（破膜），然后用PBS洗2次。

切片置于湿盒用标记液（BoehringerMannheim公司提供）孵育1h。

用PBS洗三次后切片用封锁液（Zymed试剂盒）封锁30分钟。

切片与终浓度为1：

100的rabbitanti-ErbB-4抗体孵育留宿。

PBS洗三次，切片和罗丹明标记的羊抗兔IgG（终浓度为1：

100）孵育2h，洗后用荧光显微镜计数检测。

另外，因为检测系统用到了生物素标记（文中没有提供），因此封锁液是为了封锁外源性的生物素。

zhongweigao01：

大体赞同jpxq的翻译：

是的，tunel的检测是在标记液后用【内源性】的生物素的封锁液的（不是外源性），即Zymed试剂盒

xwwq:

如何翻译TUNEL（terminaldUTP-biotinnickend-labeling）技术

pengding3:

dUTP-生物素粘性结尾标记技术

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方式  

   细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分时期的进程，染色体DNA第一在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。

然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依托的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。

DNA双链断裂或只要一条链上显现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH结尾可在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-结尾，从而可进行凋亡细胞的检测，这种方式一样称为脱氧核糖核苷酸结尾转移酶介导的缺口结尾标记法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因此没有3’-OH形成，很少能够被染色。

低分子量的DNA分离后，也可利用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。

TUNEL或缺口翻译法事实上是分子生物学与形态学相结合的研究方式，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特点，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培育的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一样的组织化学和生物化学测定法要高，因此在细胞凋亡的研究中已被普遍采纳。

   一、过氧化物酶标记测定法 

   原理：

脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，能够掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH结尾，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。

在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反映，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因此可在一般光学显微镜下进行观看。

   毛地黄植物是地高辛的唯一来源。

在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因此非特异性反映很低。

抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反映不到1％，假设此抗体的Fc部份通过蛋白酶水解的方式除去后，那么可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

   本方式能够用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培育的或从组织中分离的细胞凋亡测定。

检测晚期凋亡。

 大体原理：

 对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上biotin结合（每一个链霉亲和素至少能够再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反映，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判定细胞凋亡发生情形。

罗氏试剂盒  

一、试剂一、酶浓缩溶液5×50μl——结尾脱氧核糖核酸转移酶 （10×）

二、试剂 二、标记溶液5×550μl——含有核苷酸混合液的反映液 （1×）

三、试剂 3、转化剂-POD ——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后4℃保留）

四、 二、所需的溶液和仪器 

10mM Tris/HCl（~）、PK配制、DAB、饭盒、吹风机、3%H2O2甲醇溶液、PBS、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精） 1, 充分脱蜡和水化。

脱蜡能够先60度20min，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗2次共5min,100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗3min×5；

②3%过氧化氢甲醇中浸洗10-15min，抑制内源性过氧化氢酶。

③用蛋白酶K（20μg/ml溶于Tris/HCl中，~）室温孵育15~30分钟。

④PBS洗约5min*2次，擦干样品周围的水。

现在期配制TUNEL反映混合物——从试剂2中掏出100μl标记溶液作为两个阴性对照；将试剂1中取5μl+试剂2中45μl标记液中，配成50μl TUNEL反映混合物混匀（即配即用，4℃避光！

） 

⑤标记反映：

滴加50μl的TUNEL反映混合液，在湿盒中37℃孵育60分钟（为防蒸发和保证TUNEL 反映混合物均匀散布，能够在孵育进程中加盖盖玻片）。

PBS洗5min*3次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果。

⑥信号转化和分析：

擦干样品周围的水分，加入50ul转化剂-POD，湿盒中37℃孵育20~30分钟（能够在孵育进程中加盖盖玻片）。

PBS洗5min*3~5次    ⑦加入50~100μl DAB底物溶液，室温（10~25℃）孵育5~10 min，PBS洗5min*3次。

（苏木素染1-3秒，