PCR实验检测标准操作规范.docx
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PCR实验检测标准操作规范.docx
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PCR实验检测标准操作规范
PCR检测实验室操作规范
一、PCR实验室的设置及管理
1.目的:
建立实验室的合理设置和科学管理,防止实验污染,保证检测结果的可靠性。
2.适用范围:
本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。
3.负责人:
4.细则:
4.1流感实验室为急传所的专业实验室,从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作等。
4.2本实验室采用实时荧光定量(定性)PCR技术作为病毒基因诊断的主要手段,实验室分为三个区:
试剂准备区(第一区)、标本处理区(第二区)、扩增分析区(第三区)。
每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服,并有明显的区分标识。
标本的接收则在检验科标本接收处进行。
4.3各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等,不可混用。
4.4各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP文件。
4.5严格遵守从“试剂准备区→标本处理区→扩增分析区”的单一流向制度,不得逆向进入前一工作区。
4.6非本实验室工作人员,未经许可不得入内;进修、实习或其他科室人员因科研活动需要,进入实验区域(试剂准备区、标本处理区、扩增分析区)需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行,在本实验室人员监督指导下进行。
4.7实验完毕后做好清洁消毒工作。
二、PCR实验室工作制度
1.目的:
保持良好的工作环境,以确保检测结果的可靠性,防止交叉污染,防止差错、事故及纠纷的发生。
2.适用范围:
所有本实验室人员。
3.负责人:
4.细则:
4.1本实验室进行临床基因扩增检测及相关实验工作,不得进行其它实验操作。
4.2各区的用品不得混用。
4.3在各区的实验操作过程中,操作者必须戴手套和帽子,严格按照操作规程。
4.4试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作(见相关SOP文件)。
4.5标本处理区只能进行临床标本的保存,核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成(见相关SOP文件)。
4.6扩增分析区只能进行DNA或cDNA的扩增、实时荧光PCR扩增产物的分析(见相关SOP文件)。
4.7进行实验时严格执行本实验室的各项操作规程,及时做好各种操作记录,力求准确、可靠。
实验完毕,做好清洁、整理及分析统计等工作。
4.8室内仪器由专人负责,未经许可,不得随意使用或挪用;爱护使用仪器,定期进行保养与维修。
4.9爱护科室财产,注意安全;离开实验室前应关好门窗,检查水、电等。
三、PCR实验室内务管理制度
1.目的:
保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。
2.适用范围:
实验室相关人员及相关清洁工人。
3.负责人:
4.细则:
4.1非本室工作人员未经允许不得进入实验室。
4.2各区的用品不得混用。
4.3实验人员要有强烈的时间观念,按时上下班,不迟到、早退。
4.4进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定,禁止逆向走动。
4.5所有仪器(如PCR扩增仪)须有专人负责,并有使用维护记录;实验人员必须熟悉仪器性能后方允许操作,并严格遵守操作规程。
4.6所有试剂进购、配制、质检、使用均要有记录,未经允许不得随意带出本实验室。
4.7每天了解仪器运转情况及试剂使用情况,确保仪器整洁安全,试剂合格使用。
4.8各区的各种清洁消毒均应有记录,工作衣消毒时注意各区应分开进行处理。
4.9注意保持实验室卫生整洁,严禁在室内抽烟、吃零食,非实验操作人员应尽量少入。
4.10下班前检查门、窗、水、电,节假日应指定人员负责检查实验室的仪器、设备。
四、PCR实验室人员的配置及管理
1.目的:
保证实验室有足够数量的合格的具备开展该类实验能力的实验人员。
2.适用范围:
适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。
3.负责人:
4.细则:
4.1人员要求
4.1.1本实验室工作人员应为医学检验专业或相关专业毕业,具有中级以上技术职称或专科以上学历。
4.1.2实验室工作人员应参加卫生部或省临检中心举办的PCR技术培训,并取得合格证。
4.1.3对于新进入本室的人员,如尚未取得PCR技术培训合格证,应在实验室有培训合格证的上级技术人员的指导下进行实验工作,实验报告由有资格人员出具,并应在最短的时间内取得上岗培训合格证。
4.2人员配置
4.2.1实验室应根据工作需要配备足够的工作人员。
4.2.2各级技术人员履行相应的工作职责。
4.3人员培训及考核
4.3.1实验室负责人或负责人指定人员参加每年卫生部PCR室间质评总结会。
4.3.2实验室工作人员每1~2年至少参加1次PCR技术的省级或国家级继续教育项目,参加相关学术交流会议。
4.3.3安排未取得上岗培训合格证的工作人员在合适的时间内参加技术培训。
4.3.4科室不定期组织实验室内部实验人员学习、更新核酸扩增方面的相关知识,提升自身的理论学习水平。
特别是在标本接收区采血、接收标本的人员,需定期对其进行有关核酸扩增技术,标本采集、保存、运输等知识的培训。
一些科室的送检标本由该科室的人员送到标本接收区,对这些临床医护人员也要定期进行有关核酸扩增技术,标本采集、保存、运输等知识的培训。
4.3.5本实验室工作人员每年进行考核一次,考核内容:
a)日常工作质量
b)室内质控测评
c)室间质控测评
d)在抱怨处理中的表现
4.3.6本实验室工作人员实行严格奖惩制度,有下列表现者可受奖:
a)工作质量高,质控测评成绩优秀者
b)有科研能力,并有一定数量和质量的论文发表
c)有独创性工作成果,经鉴定认可者
d)受到有关部门或群众嘉奖者
有下列情况者将受到惩处:
a)工作质量问题较多,质控测评成绩不合格;
b)不遵守规章制度并造成一定影响;
c)不求上进。
4.3.7本实验室工作人员奖惩方法分精神及物质两类,经实验室上报及有关部门批准后执行。
4.3.8本实验室工作人员均建立业绩档案,实行能进能出制度,不断吸收高质量人员,加强培训和提高,对于不适合本室工作的人员要及时调离。
4.4人员管理
4.4.1实验室建立所有工作人员的技术档案,包括:
学历、任职资格、发表论文、研究成果、培训等相关材料复印件。
4.4.2技术档案分文本档案和电子档案,文本档案每年更新1次,电子档案随时更新。
五、PCR实验室清洁程序
1.目的:
保证实验室环境的整洁,防止污染。
2.适用范围:
适于实验室工作环境、实验台面、工作服、移液器等的清洁消毒工作。
3.负责人:
操作人:
4.细则:
4.1实验室地面必须平整、干净,通道要利于通行,没有无用的物品阻碍。
4.2合理规划实验室内物品,做到摆放整齐、有序,无用的或使用效率低的物品放置到储存处,常用的物品要容易寻找到。
4.3抽屉、柜子、文件类物品要作好标记,以方便识别。
4.4实验结束后用2%戊二醛对台面进行清洁,并用移动紫外灯进行消毒。
4.5每天对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭。
每周1次对移液器咀进行75%酒精浸泡15分钟左右,若使用过程中发生污染应随时浸泡处理。
4.6实验过程中如发生标本或试剂外溅,应立即用2%戊二醛滴上,滤纸盖上半小时,然后用酒精擦洗,并用移动紫外灯消毒。
4.7每天实验前开启各区的通风系统,各区实验结束后,分别打开传递窗紫外灯、移动紫外灯(对实验台面消毒)、天花板紫外灯消毒实验室,每次开启30~60分钟。
4.8待紫外灯消毒时间足够后,依次关闭各区紫外灯并记录。
4.9依次清洁三个区的实验台面和地面,各区清洁消毒工具均专用,不可混用,注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。
4.10处理好各区废弃物。
4.11每周将工作服洗涤消毒,不同实验区的工作服隔开洗涤。
六、PCR标本唯一标识编号规则
1.目的:
保证标本编号的唯一性,也是准确发放报告的基础。
2.适用范围:
使用核酸扩增荧光检测实验室所开展的病毒以及基因检测项目:
3.负责人:
操作人:
4.程序:
4.1按检测日期分类标记
根据标本送检的日期,每天的标本对应标记一种唯一的代号。
4.2按检测类型分类标记
根据检测项目的不同,每种检测项目对应标记一种唯一的代号。
4.3按验单接收顺序编号
在同种检测类型的验单中,按验单顺序编号。
4.4特殊标本的编号
如有特殊情况,应在标记前面增加特异字母区别开。
4.5编号步骤
a)对当天送来的标本,根据编号的基本原则编号,每个样本的每个检测项目对应一个唯一的编号。
b)用笔在每张检验申请单和对应的样品管上作好相同的标记。
c)做好标本的接收记录,每个样本的记录都应包括以下信息:
接收时间、医院、科室、送检医生、患者姓名、性别、年龄、标本类别、标本状态、送标本者、接收人、检验单号、标本唯一统编号等。
d)处理好样品、点样后,将反应管放入扩增仪上开始扩增。
f)扩增得到结果后,先在统计簿上填入结果,作好记录,再一一把实验结果填入相应申请单。
g)发放检验报告单。
七、PCR基因扩增实验室的要求
1.目的:
规定在各区内所进行的工作及其操作。
2.适用范围:
所有在本区内进行的工作。
3.负责人:
操作人:
4.程序:
一、临床基因扩增检验实验室的设计
(一)临床基因扩增检验实验室区域设计原则。
原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域:
试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。
这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的,各区域无论是在空间上还是在使用中,应当始终处于完全的分隔状态,不能有空气的直接相通。
根据使用仪器的功能,区域可适当合并。
例如使用实时荧光PCR仪,扩增区、扩增产物分析区可合并;采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪,则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。
各区的功能是:
1.试剂储存和准备区:
贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。
2.标本制备区:
核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。
对于涉及临床样本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。
3.扩增区:
cDNA合成、DNA扩增及检测。
4.扩增产物分析区:
扩增片段的进一步分析测定,如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。
(二)临床基因扩增检验实验室的空气流向。
临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行,防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。
可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。
可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。
(三)工作区域仪器设备配置标准。
1.试剂储存和准备区。
(1)2~8℃和-20℃以下冰箱。
(2)混匀器。
(3)微量加样器(覆盖0.2-1000µl)。
(4)可移动紫外灯(近工作台面)。
(5)消耗品:
一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头。
(6)专用工作服和工作鞋(套)。
(7)专用办公用品。
2.标本制备区。
(1)2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。
(2)高速离心机。
(3)混匀器。
(4)水浴箱或加热模块。
(5)微量加样器(覆盖0.2-1000µl)。
(6)可移动紫外灯(近工作台面)。
(7)生物安全柜。
(8)消耗品:
一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)。
(9)专用工作服和工作鞋(套)。
(10)专用办公用品。
(11)如需处理大分子DNA,应当具有超声波水浴仪。
3.扩增区。
(1)核酸扩增仪。
(2)微量加样器(覆盖0.2-1000µl),(视情况定)。
(3)可移动紫外灯(近工作台面)。
(4)消耗品:
一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)。
(5)专用工作服和工作鞋。
(6)专用办公用品。
4.扩增产物分析区。
视检验方法不同而定,基本配置如下:
(1)微量加样器(覆盖0.2-1000µl)。
(2)可移动紫外灯(近工作台面)。
(3)消耗品:
一次性手套、加样器吸头(带滤芯)。
(4)专用工作服和工作鞋。
(5)专用办公用品。
上述各区域仪器设备配备为基本配备,实验室应当根据自己使用的扩增检测技术或试剂的特点,对仪器设备进行必要的增减。
二、临床基因扩增检验实验室工作基本原则
(一)进入各工作区域应当严格按照单一方向进行,即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区。
(二)各工作区域必须有明确的标记,不同工作区域内的设备、物品不得混用。
(三)不同的工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。
工作人员离开各工作区域时,不得将工作服带出。
(四)实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。
不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
(五)工作结束后,必须立即对工作区进行清洁。
工作区的实验台表面应当可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。
实验台表面的紫外照射应当方便有效。
由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键,因此可使用可移动紫外灯(254nm波长),在工作完成后调至实验台上60~90cm内照射。
由于扩增产物仅几百或几十碱基对(bp),对紫外线损伤不敏感,因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间,最好是照射过夜。
(六)实验室的安全工作制度或安全标准操作程序,所有操作符合《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。
三、临床基因扩增检验实验室各区域工作注意事项
(一)试剂储存和准备区。
贮存试剂和用于标本制备的消耗品等材料应当直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过扩增检测区,试剂盒中的阳性对照品及质控品不应当保存在该区,应当保存在标本处理区。
(二)标本制备区。
由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染,可通过在本区内设立正压条件,避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。
为避免样本间的交叉污染,加入待测核酸后,必须盖好含反应混合液的反应管。
对具有潜在传染危险性的材料,必须在生物安全柜内开盖,并有明确的样本处理和灭活程序。
(三)扩增区。
为避免气溶胶所致的污染,应当尽量减少在本区内的走动。
必须注意的是,所有经过检测的反应管不得在此区域打开。
(四)扩增产物分析区。
核酸扩增后产物的分析方法多种多样,如膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法(放射性核素标记或非放射性核素标记)、直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法、质谱分析等。
本区是最主要的扩增产物污染来源,因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。
在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时,必须使用洗板机洗板,废液必须收集至1mol/LHCl中,并且不能在实验室内倾倒,而应当至远离PCR实验室的地方弃掉。
用过的吸头也必须放至1mol/LHCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理,如焚烧。
由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等,故应当注意实验人员的安全防护。
八、PCR废弃物的处理程序
1.目的:
保证实验室、实验人员和外部环境的安全。
2.适用范围:
核酸扩增荧光检测实验室常用化学试剂(NaOH、EDTA、乙醇、生理盐水等)、
实验室废弃物的处理;
3.负责人:
操作人:
4.细则:
4.1科室职责应对本室工作人员讲明本程序在预防交叉、实验室污染及切断传播途径中的重
要性,并要求严格执行。
4.2实验室所有垃圾,装入专用污物袋内,各区备有:
生活垃圾袋(黑色)及生物污染垃圾
袋(黄色)。
使用过的一次性消耗品(如试管、吸头、离心管、等),先放入10%次氯酸钠溶
液中浸泡2~4小时后,再放入黄色垃圾袋内,使用过的手套、鞋套等直接放入黄色垃圾袋
内集中处理。
4.3夹取标本的工具,如钳、镊、接种环、吸管等,用后均应消毒清洁,进行微生物检验时,
应重新灭菌,金属工具可烧灼灭菌或消毒液浸泡;玻璃制品干热或压力蒸汽灭菌。
4.4一次性塑料痰盂,用2%戊二醛液浸泡2~4小时后,放入黄色垃圾袋内集中处理。
4.5废弃标本如血、尿、胸水、腹水、脑脊液、唾液、胃液、肠液、关节腔液等用10%的84
液浸泡2~4小时后,集中处理。
4.6盛标本的容器,若为一次性使用的纸质容器及其外面包被的废纸,放入污物袋里
处理;对可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器,煮沸15分钟或加入10%次氯酸钠溶液浸泡2~4小时,消毒液每日更换,消毒后用洗涤剂及流水刷洗,沥干,用于微生物培养采样者,用压力蒸汽灭菌后备用。
4.7废弃标本及其容器装入黄色垃圾袋内、封闭,污物处理中心处理。
九、基因扩增检测实验及结果分析
1、目的:
保证扩增及结果分析的标准化、规范化。
2.适用范围:
适用于本室使用的普通离心机。
3.负责人:
操作人:
4、标准程序:
4.2.8发放报告:
及时登记检测结果记录,发放临床报告。
4.3实验结果无效的判断标准:
出现下述四种情况中的任何一种或多种,当次实验结果不可
发,查找原因,重做实验。
4.3.1阴性对照出现扩增。
4.3.2阳性对照无扩增。
4.3.3大批甚至所有的标本都扩增了。
4.3.4室内质控血清检测结果出现失控情况,实验失控的具体标准详见室内质控标准操作程
序。
4.4实验结果有效的判断标准:
达到下列要求后,当次实验有效,可以发放结果。
4.4.1阴性对照没有扩增,阳性对照扩增。
4.4.2阳性标准品梯度曲线平滑均匀,斜率、截距和相关系数三个参数的数值均在范围内。
4.4.3室内质控血清检测结果处于在控状态,具体标准详见
十、临床标本的保存操作程序
1.目的:
临床标本正确保存,以便必要时复查。
2.适用范围:
分子诊断室的所有临床检测标本。
3.负责人:
操作人:
4.程序:
4.1处理前的标本保存
a)全血标本可4℃下短期(24h内)保存,长期保存则需分离出血清(血浆),保存于-20℃下。
b)咽拭子、痰或胸腹水、脑脊液、脓液标本短保存于-70℃下。
4.2报告发出后的标本保存:
a)提取的核酸标本当天检测可置4℃保存,如当天不检测应置-20℃保存。
报告发出后第二天丢弃。
b)原始血清/血浆样本在报告发出后放入低温冰箱-20℃保存1个星期,以备复查。
超过1个星期保存期的标本由室负责人酌情处理,一般按生物传染性物品统一处理。
c)血清/血浆标本放置低温冰箱保存时须有记录,按编号顺序存放,并由专人负责管理。
4.3特殊标本的处理:
对暂不检测的项目和规定时间外收到的零散样本,要随时登记和交班,以免漏检,遗失和延误检验。
对特殊样本或特殊病人的样本,实行“首接”负责制,所谓特殊样本是指难于采集的样本,以及特殊病人的样本一律实行“首接”负责制,无论那位工作人员,一旦收到样本后,均须负其责任,不得以任何借口推托,及时和正确保管和转送样本到有关实验室或有关人员,同时作交班记录和双签名。
十一、临床标本的采集、运送、接收程序
1.目的:
规范临床待检标本的正确采集、送检和处理。
2.适用范围:
分子诊断室的所有临床检测标本。
3.负责人:
操作人:
4.程序:
4.1标本的采集
4.1.1标本由临床各科室接受过临床基因扩增检测有关标本采集、保存、运输知识培训的医护人员采集并送至实验室。
4.1.2标本采集要求
a)血液标本:
用2ml真空采集管或1.5ml高压灭菌离心管采集血液标本,血标本采集后在2小时内送达实验室。
离心(检验单与标本一道)后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml的离心管中,编号。
b)痰标本:
用带盖的无菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰标本送检。
(对于无痰或少痰的患者,可用45℃加温的100g/LNaCl水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出;对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰,用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射,用棉拭子采集标本。
)标本在室温下保存不能超过24小时。
4.2标本的运送
标本采集后,密闭、标(贴)姓名,应尽可能快的送至检测实验室,如运送时间需2小时以上,必须用冰盒送至实验室。
4.5接收
4.5.1严格对各类样本的查对和双签制度,对病房各样本及时进行验收,查对,不符合要求的样本一律退回,并有书面记录。
十二、PCR生物安全防护措施
1.目的:
预防工作人员在实验过程中被感染或污染。
2.适用范围:
适用于本室所有工作人员。
3.负责人:
操作人:
4.细则:
4.1实验人员在实施生物防护措施时,应严格遵守各项相应的规章制度,建立起强烈的生物防护意识。
4.2每天更换废液缸的2%戊二醛溶液,并保证2%戊二醛溶液用量为废液缸内总液量的五分之一左右。
配置消毒液时,正确量取足量的消毒剂(用量杯,保证浓度),水的用量也要正确,缸体密封性良好。
4.3实验台面日常清洁时使用75%的酒精擦拭。
4.4每区每次实验后紫外灯照射30~60分钟,如有需要可延长照射时间。
4.5所有来自病人的血液或体液标本均应视作传染源,因此在标本的采集、运输过程中,标本容器应完好无泄漏。
4.6处理标本时应穿工作服、戴手套,以免沾上皮肤。
如手或其它部位的皮肤沾上血液或体液标本以及试剂,应立即冲洗干净。
有下列情况之一者,需另外消毒:
手接触有传染性的微生物,水龙头、水池肥皂可能被污染,工作服可能被大量细菌污染。
消毒剂可用“84”消毒液。
4.7在实验过程中,病人标本(血液、体液)或试剂不慎溅入眼内应立即用清水洗。
4.8实验过程中在使用针具等锐器时,尽量小心防止受伤。
若被锐器刺破时,应立即脱下手套,尽量挤压伤处,使血流出,然后用碘酒、酒精消毒,必要时进行预防补救措施。
4.9在实验过程中病人标本(血液、体液)外漏时,应立即用2%戊二醛滴上,滤纸或纱布盖上半小时,然后用酒精擦洗,并用紫外灯消毒。
4.10实验完毕离开时,应脱下所有该实验区个人防护装备。
4.11实验完毕后应对实验室进行紫外消毒。
4.12遇有意外事故应立即报告科室负责人,当事人应立即注射相关疫苗或进行预防性治疗,并进行医学观察,严重者应报告技术负责人。
十三、PCR实验室化学试剂配制程序
1.目的:
保证实验中用到的各种溶液符合实验要求。
2.适用范围:
核酸扩增荧光检测实验室常用溶液:
4%NaOH溶液、75%酒精、消毒剂(三氯异氰尿酸或二氯异氰尿酸钠)、2%戊二醛溶液等。
3.负责人:
操作人:
4.程序:
4.4化学试剂的配制:
4.4.1用具:
干燥洁净的250ml量桶一只,1000ml量桶一只,1000ml烧杯一只,三角烧瓶两只,天平一架,100ml塑料试剂瓶、2000ml广口瓶各一只。
4.4.2配制步骤:
4.4.2.1配制4%NaOH溶液:
a)用天平称取4克分析纯的NaOH固体,置于一只三角烧瓶中。
b)用250ml量桶准确取100ml水,缓缓注入盛放NaOH
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