谈清热化湿方调节PI3KAKT 信号诱导自噬维持胃黏膜稳态防治幽门螺杆菌感染相关胃癌的机制.docx

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谈清热化湿方调节PI3KAKT信号诱导自噬维持胃黏膜稳态防治幽门螺杆菌感染相关胃癌的机制

谈清热化湿方调节PI3K-AKT信号诱导自噬维持胃黏膜稳态防治幽门螺杆菌感染相关胃癌的机制

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　　胃癌（gastriccancer，GC）是多因素、多基因参与的一种源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，属于中国高发肿瘤之一，每年新检出人群超过40万，平均年死亡率约为16/10万（男性21/10万，女性10/10万），近年死亡率虽有下降但并不明显。

尽管幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）作为I类致癌因子已为共识，但是关于根除Hp是否能够达到防治胃癌的目的显然是存在争议。

研究发现早期根除Hp在降低胃癌发生率较后期合并异型增生再行根除Hp发生率要高，这提示Hp感染早期所致胃黏膜免疫反应失衡，破坏胃黏膜屏障，导致其他致癌因素更易定植侵袭胃黏膜加重肿瘤的发生有着重要意义。

晚近研究发现，PI3K-AKT信号诱导的胃黏膜上皮细胞自噬异常，导致胃黏膜上皮细胞增殖和凋亡平衡被打破，CDK1、beclin-1等基因过度转录，最终参与胃癌发生有着重要作用。

由此，课题组在前期工作基础上，采用Hp感染+MNU复合法制备胃癌模型，观察清热化湿方防治胃癌的可能机制。

　　1材料

　　1.1实验动物

　　4周龄雄性Balb-c小鼠100只，体质量（18±2）g，购自湖南斯莱克景达实验动物中心，动物许可证号:

SCXK（湘）2011-0003，动物合格证号:

4304701479。

1.2试剂与仪器

　　HpSS1株（CagΙ+）由南昌大学第一附属医院消化研究所惠赠，P110、P-AKT、beclin-1及CDK1一抗购自美国SanTaCruz公司，P110、P-AKT、beclin-1及CDK1引物合成委托广州达安生物技术公司，蛋白质抽提试剂盒及PCR提取试剂盒均购自广州英伟创津公司，德国蔡司倒置相差显微镜，5417R低温离心机，BIO-RAD全自动酶标仪及ABI7500荧光PCR仪等。

1.3实验药物清热化湿方组成:

藿香6g，川朴3g，姜半夏4.5g，赤苓9g，杏仁9g，生苡仁12g，白豆蔻1.8g，猪苓4.5g，淡豆豉9g，泽泻4.5g，黄连12g，栀子12g。

上方6剂，常规水煎浓缩成500mL，含生药1g/1mL药液。

　　2方法

　　2.1幽门螺杆菌（Hp）培养

　　HpSS1株复苏后，接种于含10%脱纤维羊血的琼脂培养基，于5%O2、10%CO2、85%N2微需氧条件下培养48h，经尿素酶及组织染色证实为Hp。

用接种环收集细菌，混悬于细菌转送基中，比浊管控制浓度为109菌落形成单位（CFU）/mL备用。

　　2.2造模方法

　　参照文献报道，全部小鼠适应性喂养1周后，除正常组外，其余实验小鼠先予每日饮用水中加入新鲜配置抗生素混合液，即庆大霉素15mg/kg/d;氨苄青霉素100mg/kg/d，连续饮用5d。

停药3d后，按实验设计将小鼠分为4组，采用Hp感染结合MNU法复制胃癌模型，即先予Hp新鲜混悬液（109CFU/ml）0.3mL灌胃，每周3次，连续8周;第9周起，避光新鲜配置120ppmMNU自由饮水，连续20周。

自第30周起分组给药，模型组予以等剂量生理盐水，治疗组按低、中、高予以不同剂量清热化湿方水提液灌胃连续10周。

末次给药后处死全部小鼠，沿胃小弯纵轴将胃组织分为两半，一半置于10%中性福尔马林中备测、另一半用于电镜、分子生物学检测。

　　2.3指标检测

　　2.3.1胃黏膜组织病理学及超微结构变化应用

　　HE染色和透射电镜检测胃黏膜组织病理学变化，及超微结构、细胞自噬改变，其中胃黏膜病理组织学评价参照2012年中国慢性胃炎共识意见病理评价部分即0级为正常黏膜、1级为胃黏膜慢性炎症、2级为慢性炎症（++）、3级为萎缩性胃炎、4级为不典型增生和癌变。

具体步骤严格按试剂盒操作说明进行，由两名病理科医生盲评。

　　2.3.2胃黏膜P110、P-AKT、beclin-1及CDK1mRNA表达

　　应用实时荧光定量PCR技术，以β-Actin为目的基因对照，检测胃黏膜P110、P-AKT、beclin-1及CDK1mRNA表达，具体实验步骤严格按试剂盒操作。

P110、P-AKT、beclin-1、CDK1及GAPDH引物序列委托广州达安基因公司合成。

内参照β-Actin引物序列为:

上游引物:

5’-GATTCCACCCATGGCAAATT-3’，下游基因:

5’-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3’，扩增片段长度95bp;P110引物序列为:

上游引物:

5’-CGCTGCTGAAGAGTTTCCAAG-3’，下游引物:

5’-GTACGGGATCTGGGACGTCA-3’，扩增片段长度114bp;p-AKT引物序列为:

上游引物:

5’-CTTCTCTGTGGCGCAGTGC-3’，下游引物:

5’-ACATGGAAGGTGCGTTCGAT-3’，扩增片段长度108bp;beclin-1引物序列为:

上游引物:

5‘-AAGACAGAGAGCGATGGTAG-3’;下游引物序列为:

CDK1引物序列为:

上游引物:

5’-GGATCTACCATACCCATTGACT-3’，下游引物:

5’-CTGGGCTGTGGTAAGT-3’，扩增片断长度为270bp;5‘-GTTGTTACAGTGAGACCTACACAC-3‘，扩增片断长度127bp。

　　2.3.3胃黏膜P110、P-AKT、beclin-1及CDK1蛋白表达

　　应用Western-blot技术，以GAPDH为对照，检测胃黏膜P110、P-AKT、beclin-1及CDK1蛋白表达，采用凝胶成像系统扫描，以特异性条带浓度与面积的乘积为有效值，反映蛋白表达水平。

（具体步骤:

蛋白制备—SDS-聚丙烯酰__胺凝胶电泳—转膜、封闭、抗原抗体反应—显色、检测分析）。

　　2.4统计学分析

　　应用SPSS19.0forWindows统计软件，所有实验数据用均数±标准差（珋x±s）表示，符合正态分布资料采用单因素方差分析（ANOVA）检验;若为非正态分布资料采用Mann-WhitneyU秩和检验来比较两组间差异是否有统计学意义。

　　3结果

　　3.1小鼠一般情况变化

　　正常组小鼠呈自然增长;模型组小鼠死亡3只，懒动、毛发稀疏、耗食量减少;治疗组小鼠未见死亡，毛发稀疏，耗食量减少，模型组及治疗组小鼠胃黏膜尿素酶测试阳性达到90%以上。

　　3.2小鼠胃黏膜组织病理学变化及超微结构变化

　　光镜下见正常组小鼠胃黏膜组织形态正常，可见少许炎性细胞浸润;模型组小鼠胃体、胃窦黏膜重度慢性炎症100%，不典型增生占65.3%，低分化腺癌57%;治疗组小鼠胃窦黏膜轻-中度慢性炎症，不典型增生占24%，未见癌变，以中、高剂量组更为明显。

与模型组比较，有统计学意义（P<0.05）。

电镜下见正常组:

上皮细胞单层柱状排列，细胞游离面上微绒毛发达密集，整齐排列;细胞间复合连接清晰可见。

模型组:

上皮细胞微绒毛稀疏甚至脱落消失，细胞间复合连接松解消失，核固缩，出现核周隙，异染色质块状分布于核膜下;线粒体肿胀变大，嵴断裂;粗面内质网扩张，细胞处于坏死期。

治疗组:

镜下可见上皮细胞体积明显变小，核染色质边集、核固缩，核膜断核碎裂，细胞器明显扩张肿胀、碎裂，其中，中、高剂量组镜下可看到上皮细胞明显变小、空泡化，凋亡小体形成，可见大量细胞自噬。

　　3.3小鼠胃黏膜P110、P-AKT、beclin-1及CDK1mRNA表达

　　模型组胃黏膜P110、P-AKT、beclin-1及CDK1mRNA表达呈上升趋势，治疗组P110、P-AKT、beclin-1及CDK1表达明显下降，有统计学意义（P<0.05）。

　　3.4小鼠胃黏膜P110、P-AKT、beclin-1及CDK1蛋白表达

　　模型组胃黏膜P110、P-AKT、beclin-1及CDK1蛋白表达呈上升趋势，治疗组P110、P-AKT、beclin-1及CDK1蛋白表达明显下降，有统计学意义（P<0.05）。

　　4讨论

　　中医学对于胃癌的认识较早，但关于胃癌的病名首见于《医学衷宗参西录》“至西人则名为胃癌，所谓癌者，如山石之有岩，其形凸出也”。

本病病位在胃，涉及脾、肝，病理改变可分为3个层次，初期病情较轻主要是因情志不舒、饮食不节，损伤脾胃所致;中期是因初期脾胃气滞所致肝气郁结，进而气机失调，血滞成瘀，日渐成积;最后即形成本虚标本，气滞，痰瘀热毒为标。

课题组以清热化湿为基本大法，自拟清热化湿方前期临床观察发现该方具有明确改善炎实，是由气血进一步瘀积所致。

证属本虚标实，脾胃亏虚为症，缓解Hp感染相关胃病的效用;离体实验发现清热化湿方可能通过介导PKC磷酸化，导致Hp感染的炎症信号无法传递至细胞内，使得CD14、MMP-1表达下降，诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的效用。

　　本研究结果发现，胃癌胃黏膜上皮细胞自噬改变与组织病理学呈正相关变化，P110、P-AKT、beclin-1及CDK1蛋白及mRNA表达上升，而治疗组在取得组织病理学改善同时，其P110、P-AKT、beclin-1及CDK1蛋白及mRNA表达亦呈下降趋势，有统计学意义。

胃癌发病机制尚不明确，它是涉及多因素、多环节、多基因，与饮食、感染、环境、遗传等因素关系密切的疾病。

自噬作用是普遍存在于真核细胞的一种代谢过程，可清除机体代谢废物和受损细胞器，并且降解后产生的氨基酸、核苷酸等营养物质可以被细胞循环再利用，从而避免了代谢废物积累引起的各种突变的发生，有效地减少了肿瘤发生的可能性;同时可诱导无法生存的细胞主动性死亡。

由此，自噬在维持细胞的稳态或促进细胞生存方面起着重要作用，它与细胞的生长、增殖以至肿瘤的发生、发展关系密切。

细胞自噬是通过感受器和效应器共同调节的一个多途径的生物学过程，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶体蛋白途径（PI3K/AKT/mTOR）在自噬的调控中有重要的作用，mTOR是参与自噬信号通路的主要感受器，是细胞自噬的能量和营养状态的感受器，在调节细胞自噬方面起关键的作用。

　　PI3K是一类脂质激酶，其主要的生化功能是促使磷脂酰肌醇的3-羟基基团磷酸化，研究证实胃癌患者PI3K/AKT信号通路常常被激活，并参与胃黏膜上皮细胞生长、肿瘤形成及侵袭等。

而细胞自噬体形成是通过PI3K第Ⅲ类激酶合成的PI3P分子来启动信号的，这种激酶一般是在与beclin-1相互作用后方可激活。

beclin-1结合PI3K激酶合共因子AKT信号共同组成的自噬核心复合物促使了自噬装配所必需的膜修饰，调节CDK1表达，激活细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号，诱导胃黏膜上皮细胞自噬性依赖死亡。

那么，如果能够阻断PI3K信号通路即可能通过增强癌细胞的凋亡和自噬来抑制胃癌细胞的增殖活性，达到发挥防治胃癌的生物学效应。

综上所述，通过本研究笔者认为清热化湿方可能通过调控PI3K-AKT信号，诱导细胞自噬，下调beclin-1及CDK1表达而发挥防治胃癌的效用。

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