原理卫生福利部食品药物管理署.docx
- 文档编号:25044530
- 上传时间:2023-06-04
- 格式:DOCX
- 页数:18
- 大小:34.80KB
原理卫生福利部食品药物管理署.docx
《原理卫生福利部食品药物管理署.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《原理卫生福利部食品药物管理署.docx(18页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
原理卫生福利部食品药物管理署
健康食品之延緩衰老功能評估方法
920829衛署食字第0920401629號公告
1、前言
老化是許多分子、細胞及系統方面的一種效應改變。
分子與細胞的老化是基因(內在)與環境(外在,如熱、冷、疾病、營養素缺乏等因素)所造成。
而系統的老化是器官某部分的變化,最常見的是皮膚上的變化,例如變硬、變粗及生皺等。
所以老化細分為功能上(function)、行為上(behavior)及外表上(performance)上的變化。
老化現象是一種普遍性(universal)、進行性(progressive)、累積性(cumulative)及傷害性(deleterious)之內外因素所引發之生理衰退。
由於生物個體間、不同人生階段或時期之老化步伐及表現不一,所以無法以單一或簡單的模式來加以描述。
也因為如此,隨年齡的增加,族群間之歧異(diversity/heterogeneity)也加大,增加很多複雜性。
隨著年齡造成的生理功能衰退,有兩種情形,一為純粹與年齡增長有關之功能衰退(age-relatedphysiologicdeterioration),另一為出現伴隨年齡增長之疾病(age-associateddisease),但兩者往往共同存在。
老化學說大致上可分為兩類:
基因預設(geneticprogram)與隨機破壞(stochastic)。
前類學說認為預設的基因結構或基因表現的改變導致老化;另一類則將老化歸因於體內大分子物質像核酸、蛋白質隨時間所累積的隨機破壞超過體內的修復能力,這些隨機破壞可以來自自由基(freeradical)、氧化作用(oxidation)或醣化作用(glycation)等。
持平而論,老化可能是多種因子所共同參與的過程,而遺傳與各種環境因子亦都扮演舉足輕重的角色。
關於老化的原因,迄今已提出的學說和意見不勝枚舉。
其中最具信賴性的學說為自由基學說(freeradicaltheory)。
自由基是指構成物質的原子團在分子狀態下有不成對電子的情形,這種電子結構極不穩定,易與其他分子發生反應。
在所有自由基種類中,以含氧自由基對人體的健康最密切。
它的產生方式有兩種:
一種是由身體內正常新陳代謝所產生,即當細菌、黴菌、病毒或異物等入侵時,體內防衛系統在吞噬異物後,會產生「含氧自由基」。
另一種是受外界不正當因素的影響,例如輻射線或紫外線、抽菸、空氣污染等,甚至心理壓力也會形成含氧自由基。
一但體內自由基的數量超出人體天然防禦的範圍,造成氧化壓力(oxidativestress),則各種疾病與老化便接踵而至。
因此,當自由基形成後就會造成連鎖反應,促使蛋白質、碳水化合物、脂肪、核酸等構成細胞物質的氧化,造成過氧化脂質的堆積,進而破壞體內的細胞膜、蛋白質及核酸等,使生理功能逐漸消失,產生疾病。
若能增加生物體內抗氧化防禦系統之作用,以分解活性氧物質,則能有效減少細胞傷害,延緩生物體的衰老與死亡。
生物體內的抗氧化防禦系統大致可分為:
一級防禦系統(primarydefensesystem)及二級防禦系統(secondarydefensesystem)。
一級防禦系統如維生素C、維生素E、glutathione及抗氧化酵素如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶及穀胱甘肽過氧化酶(glutathioneperoxidase)等,其作用可直接清除活性氧物質或抑制活性氧物質之氧化;二級防禦系統包括脂質分解酵素(lipolyticenzyme)、蛋白質分解酵素(proteolyticenzyme)及DNA修復酵素(DNArepairenzyme)等,其負責清除活性氧物質之氧化性產物,修復受損的細胞及彌補在一級防禦系統中無法清除的自由基衍生物。
在衰老學說中有一假說為「脂褐質累積」學說。
脂褐質含30~70%蛋白質,20~50%脂質,4~7%碳水化合物及微量金屬。
其主要堆積在有絲分裂後的細胞,例如神經元、心肌細胞、視網膜細胞等。
脂褐質是經由蛋白質的水解及多元不飽和脂肪酸氧化後之產物,亦是脂質氧化和糖化作用的聚合物,故可以利用periodicacid-schiffstain和SudanblackB等特殊染色劑的染色後經過組織切片進行特異性標識。
過去二十年有關老化機制(mechanismofaging)的理論與資料眾多,每一種理論很難以一種簡單、直接的方式,明白解釋原因與結果之間的關係。
因而老化研究的目的乃在:
(1)檢測老化的經常性或一般性之持續變化;
(2)確認某些變化來自老化而非來自疾病,界定健康與疾病的分野;(3)了解老化現象的根本原因及伴隨老化而來的疾病。
並將所得到的結果分析作綜合研判,建立基本資料庫,以得到新的發現或發掘新的問題。
貳、實驗項目與實驗方法
一、動物實驗
(1)生存實驗
利用生物的整個生存過程來觀察受試物對壽命的影響。
(1)小鼠生存實驗
a.條件:
選用小鼠12月齡小鼠,每組40隻,雌雄各半;
b.分組:
隨機分成1個正常對照組和3個實驗劑量組,其中一組為人體每公斤體重每日推薦攝取量,小鼠擴大10倍(必要時得依受試物之特性另定之),作為其中1個劑量,以此為基礎,另設兩個劑量。
c.實驗方法:
一般用灌胃法,摻入飼料法或加入飲水法給予受試物,從12月齡開始給予,直到死亡。
然後每天統計其死亡鼠數,直至全部自然死亡。
比較實驗組與對照組的平均壽命和最高壽命,畫出其生存曲線圖,計半數動物死亡的天數。
(2)大鼠生存實驗
a.條件:
選用大鼠18月齡大鼠,每組30隻,雌雄各半;
b.分組:
如同小鼠生存實驗,但其中一組為人體每公斤體重每日推薦攝取量大鼠擴大5倍。
c.實驗方法:
如同小鼠生存實驗,從18月齡開始給予,直到死亡。
(3)果蠅生存實驗
a.條件:
選用果蠅Oregen品系,雌雄分組,每個分組雌雄果蠅各200隻,分裝在10個培養管內,每管20隻。
b.分組:
需有四種劑量組,受試物推薦劑量=每天每人推薦攝入量(g)/3000×100%,以此濃度為中間劑量,按3倍組距上下各設1或2個劑量組。
若受試物處理時使用了普通培養基中未使用的溶劑,則還應另設1個溶劑對照組。
c.實驗方法:
收集羽化後8小時內未交配的果蠅進行分組,用二氧化碳氣體麻醉,待果蠅完全麻醉後倒出,雌雄分組,每個分組雌雄果蠅各200隻,分裝在10個培養管內,每管20隻。
每個劑量組均應準備2~3管裝有相同數目果蠅的後備管,作為遇到特殊情況時的補充。
成蟲從分窩2週後開始並重新給予受試物(雌雄果蠅按培養管分別秤重,計算平均體重)。
果蠅放入受試物培養基後實驗即正式開始,每天定時觀察紀錄果蠅的死亡數,每4天更換一次培養基,一直觀察到果蠅全部死亡。
實驗結束,計算半數死亡天數,平均壽命和平均最高壽命(每組最後死的20隻果蠅的平均存活天數為該組的最高壽命)。
(二)生化實驗
1.動物選擇:
老齡動物、過氧化損傷處理動物或國際認可之老化模型動物任選其一。
2.劑量分組及受試物試驗期間:
設1個空白對照組,1個模型對照組及3個受試物劑量組,根據人體每日每公斤體重推薦攝取量,小鼠擴大10倍(大鼠擴大5倍),必要時得依受試物之特性另定之,作為其中1個劑量,以此為基礎,另設2個劑量。
每組大鼠單一性別8-10隻,小鼠單一性別10-15隻。
受試物經口連續至少給予30天,視研究必要可延長實驗期間。
3個劑量組經口給予不同濃度受試物,模型對照組和空白組給予同體積溶劑。
3.實驗方法:
(1)老齡動物
選用15月齡大鼠、12月齡小鼠,按血中MDA水平分組,隨機分為1個老齡對照組和3個受試物劑量組,另增設1個少齡對照組(大鼠3月齡,小鼠8週),30天後犧牲動物測氧化指標和生化指標。
(2)過氧化損傷模型動物
(A)D-半乳糖模型:
a.原理:
D-半乳糖供給過量,大量產生活性氧,打破了受控於遺傳模式的活性氧產生與消除的平衡狀態,引起過氧化效應。
b.動物模型方法:
選3月齡健康成年的小鼠,用D-半乳糖1.2g/kg.bw頸背部皮下注射模型,注射量為0.1ml/10g.bw,每日1次,連續6週,取血測MDA,按MDA水平隨機分組,如上述之分組方式。
在給受試物同時,除空白對照組外,各組繼續給予D-半乳糖1.2g/kg.bw頸背部皮下注射,空白對照組皮下注射生理鹽水,30天後,犧牲動物測氧化指標和生化指標。
(B)輻照模型:
a.原理:
電離輻射通過直接破壞生物膜中不飽和脂肪酸和間接通過水輻解產生自由基,引發脂類過氧化。
b.動物模型方法:
選18-22g健康成年小鼠,隨機分5個組,如上述之分組方式。
30天後,除空白對照組外,各組給予5-8Gy60Coγ射線全身一次性照射,照射後第3、4天犧牲動物,取肝組織(或第9、10天犧牲動物,取睪丸組織)測氧化指標和生化指標。
(C)溴代苯模型:
選18-22g健康成年小鼠,隨機分5個組,如上述之分組方式。
30天後,動物禁食過夜,給受試物0.5-1小時後,除空白對照組外,各組灌胃0.3mol/L溴代苯油,灌胃量0.2ml/20g.bw,空白對照組灌胃同體積植物油,大約18-22小時後犧牲動物,取肝組織測氧化指標和生化指標。
(3)老化模型動物
依國際認可老化模型動物之特徵,選用適當月齡之小鼠,分1個老齡對照組和3個受試物劑量組,另增設1個少齡對照組。
30天後,犧牲動物測氧化指標和生化指標。
二、人體實驗
1.背景說明:
一種健康食品必須以科學方法證明可延緩人體內至少一個以上器官功能衰老的速率或延長服用者之壽命,才能充分取信大眾此食品確有抗老防衰之效能。
由於不同器官衰老的速率與原因未必相同,即使證明某食品可延緩甲器官老化,也不可據以推論此食品也延緩乙器官老化,必須針對不同器官逐一求證才符合科學之精神,但研究者可同時觀測多個器官功能隨老化所發生之變化。
2.計畫執行單位:
需委託國內外大學食品、營養、醫藥等相關研究所或醫學中心執行,需有臨床試驗專家或醫師參與,並遵循衛生主管機關有關人體試驗之規定。
3.受試食品:
必須有科學文獻佐證其成分具有延緩器官功能衰老或延長壽命之效能,並經健康食品安全性評估方法證明在有效劑量範圍對人體不會有顯著急、慢性不良反應。
4.受試者:
未服用任何藥物身心健康之成年人,需包括部分老年人(六十五歲以上),需有對照組與實驗組,每組不少於二十人,由臨床試驗專家視實驗特性與設計之需要,依學理推算適當之受試人數,以免樣本太小無法統計。
受試者須被充分告知試用食品之可能不良反應,並簽立同意書,才能收案。
5.觀察指標之選定:
實驗設計者依其所欲證明可延緩老化之器官,並參酌以往科學文獻評估該器官功能之方法,決定所需觀察之效能指標。
例如:
使用肌酸酐廓清率來評估腎絲球功能,使用FEV1來評估肺功能。
針對每一器官選定之指標項目愈多,且每一指標皆因測試食品之使用而改善,則說服力愈強。
此外,也必須訂有不良反應之觀察指標。
6.試驗流程:
收集受試者基本資料與所有觀察指標之基礎值後,實驗組投予試用食品,對照組服用安慰劑至少六個月。
安慰劑之外型應力求與試用食品相同。
試驗期間與期終需追蹤觀察指標若干次。
期滿後兩組對調,原對照組改服試用食品,實驗組改服安慰劑,重複整套觀察流程一次。
觀察期間之設定由臨床試驗專家依每一器官老化之速率,食品之效能與受試者之特性推估而定。
實驗過程宜採雙盲方式進行,開方者與受試者不知服食之內容。
受試者並應避免干擾觀察指標之因子。
三、判定基準:
(1)動物實驗(生存及生化)與人體實驗都要做。
若人體試驗沒顯著延緩衰老效果,但動物實驗看到有不錯的結果,建議可允許標示為〝在動物實驗表明有延長生命作用〞。
(2)動物之生存實驗可簡化,果蠅不用做(因為不是哺乳動物),其中大鼠或小鼠之材料可選其中之一項即可。
(3)人體實驗可多加功能性的血液檢查。
參、生化實驗測定項目
一、氧化指標
(一)氧化修飾後蛋白羰基功能基含量測定1-3
(1)分光光度測定法:
取血清或腦脊液(serumorCSF),並將樣品先行將核酸去除。
檢體先在6000g離心10分鐘,當280/260nm波長之比率小於1.0時,表示核酸含量多。
故檢體必須加入10%streptomycinsulfate直到其最終濃度為1%。
試管放置於常溫10分鐘,而後在6000g離心。
將上清液與沈澱物(precipitate)分開,分析步驟如下:
試劑
空白管
樣品管
萃取蛋白
1.0c.c.
1.0c.c.
10mMDNPH(in2.5MHCl)
-
4.0c.c.
2.5MHCl
4.0c.c.
-
混勻,避光常溫培育60min,每15分鐘vortex一次
20%TCA(w/v)
5.0c.c.
5.0c.c.
放置於冰浴10分鐘,離心5分鐘,上清液棄除,收集沈澱,以4.0c.c.的ethanol/ethylacetate清洗3次,棄除未經作用之過剩DNPH以及脂肪。
6Mguanidinehydrochloride
2.0c.c.
2.0c.c.
加入上述試劑可將沈澱物溶解。
Vortex混勻並放置常溫10分鐘。
若有不沈澱之雜質,用離心法將之棄除。
每一樣品要在335-390nm波長掃描(以空白管做為blank),羰基含量可以最大吸光之吸光度(peakabsorbance)求取之(以吸光係數ε=22,000M-1C-1計算濃度)。
同時,樣品管之蛋白量要以280nm之吸光度求取之。
最後配合樣品管之蛋白量,即可換算成nmol/mg之羰基量。
故總羰基量可以下式求取之:
Abs(355-390nm)
2.2x104/106
Absorption(Abs)
ε
c(nmol/ml)==
=Abs(355-390nm)x45.45nmol/ml
組織之羰基量測定:
步驟與上述相同,但要事先做組織之homogenization。
將150-200mg組織放入塑膠盤(plasticdishes),加入3.0c.c.homogenizingbuffer。
用剪刀將組織剪成細片,常溫放置15分鐘,將含蛋白之溶液分離,並在6000g離心,將雜質去除。
用280/260nm之比率判別是否含核酸太高。
如果太高,則用streptomycinsulfate去除。
(2)高效率層析測定法(High-performanceliquidchromatography):
使用TCA或硫酸胺(ammoniumsulfate)濃縮獲取沈澱物。
將沈澱物分為兩組,其中一組充當derivatizationblank,另一組樣品則用來做derivatization。
將樣品放於有蓋之1.5ml塑膠試管。
加入3倍體積之derivatization試劑,混勻,藉以溶解樣品。
放置在常溫15-30分鐘。
使用in-line之濾網棄除不溶物。
將樣品注射進入儀器分析條件:
HPLCcolumn:
Column:
ZorbaxGF450(Mac-Modanalytical,ChaddsFord,PA,USAorDionex,Sunnyvale,CA.USA);Mobilephase(6.0MGuanidinehydrochloride,0.5MpotassiumphosphatepH2.5);flowrate:
2min/ml;注意波長276及370nm之層析圖譜。
計算:
(εprotein276)(Area370)
22,000(Area276-0.43Area370)
測定moleofcarbonylpermoleofprotein=
[note:
ε276nm=9460(43%ofthatat370nm)]
但如果測定一個peak內有若干物質時,其使用之計算式為:
Areaxflow
εMxpathlength
mol=
(二)測定血漿蛋白含硫功能基及谷胱甘肽4-6
(1)血漿全部含硫功能基之測定
方法:
0.20ml之plasma放置於1-ml試管中,依序加入0.6mlTris-EDTAbuffer(Trisbase0.25M,EDTA20mM),pH8.2.,40µl10mMDTNB及3.16ml絕對甲醇(Absolutemethanol)。
將所有試管以管蓋蓋住,等待呈色產生(15-20分鐘)。
在3000g離心10分鐘(常溫狀況下)。
讀取上清液之吸光度(412nm;A)減去DTNB之空白管吸光度(B)故全部之血漿含硫功能基是可由下式求取之:
TotalSHgroups=(A–B–0.03)x(4.0/0.2)/13.6
=(A–B–0.03)X1.47(mM)
[Note:
0.03=Sampleblank;吸光係數=13,600M-1cm-1]
方法:
50µlplasma+1.0mlTris-EDTA,讀取吸光度(A1),加20µl10mMDTNB於上管。
在常溫放置15分鐘,再度讀取吸光度(A2),並測DTNB之空白管取光度(B)
則TotalSHgroups=(A2–A1–B)X(1.07/0.05)/13.6
=(A2–A1–B)X1.57(mM)
(2)血漿谷胱甘肽濃度測定:
0.5ml血漿+0.5mlcold10%TCA
放置於冰浴中10分鐘,並在3000g離心15分鐘
0.2ml的上清液+1.7mlphosphate/EDTAbuffer+0.1mlOPD試劑
放置於室溫15分鐘,測定螢光強度(激發波長=350nm;放光波長=420nm)
樣品之谷胱甘月太量,則可由GSH之標準曲線上換算求得
注意事項:
抽煙之血漿檢體會干擾(A)及(B)之測定結果。
棄除上述干擾之方法為先將血漿之蛋白(50µl)用1ml5%TCAin5mMEDTA)沈澱,再將沈澱物浮懸在Tris-EDTAbuffer後,再做呈色反應。
(三)DNA之8羥基-2’-去氧鳥嘌呤核苷之高效率層析法之測定7,8
(1)DNA樣品之製備及水解
(A)DNA之萃取步驟:
將1克之組織加入4c.c.之homogenizingbuffer(0.3Msucrose,0.025MTris,0.002MEDTA,finalpH7.3)後做homogenization10-15秒,加入同體積的DNAextractionsolution[1.0MLiCl,2Murea,0.04Msodiumcitrate,0.005MdisodiumEDTA,2%sodiumdodecylsulphate(SDS),pH6.8,此溶液並通過0.45µmmembrane過濾,且貯存在室溫]。
RNA-freeDNA,加入RNase(100µg/ml)在50℃條件下培育30分鐘,再加入proteinaseK(100-300µg/ml),在50℃條件下培育30-120分鐘,接著加入等體積chloroform/isoamylalcohol(24/1),使水相/有機相互相混合約15分鐘,2000-3000g離心5分鐘使水相及有機相分開,取水相再重覆chloroform/isoamylalcohol(24/1)萃取,至少三次。
最後取水相,加入1/15體積之3Msodiumacetate(pH=5.3)及2-2.5倍體積之95%酒精,並在3,000~4,000g條件下離心使核酸沈澱,沈澱的核酸以70﹪酒精清洗二次,然後Airdry樣品並將之溶於Tris/EDTAsolution(0.010MTris,0.001MEDTA,pH7.4)。
最後測定在260及280nm之吸光度,並以260nm之吸光度計算DNA濃度(當260/280比值接近1.8時,則DNA不再含有蛋白)。
(B)DNA之水解(DNAdigestion):
將DNA用0.25mlTris/EDTA溶解,加入0.025ml0.5Msodiumacetate,pH5.1以及2.75μl1MMgCl2,將上面混合液加熱至100℃(水浴)5分鐘(以製備單股DNA),速將其放入冰浴5分鐘,加入10µgnucleaseP1(1mg/ml之水液放置於4℃,可重覆稀釋使用),並在37℃條件培育60分鐘,利用8μl1MTrisbase調節pH至7.8,加入2μl(2units)alkalinephosphatase並在37℃條件下培育60分鐘,最後加入4μl5.8M醋酸(aceticacid)使酵素沈澱。
將混合液過濾(0.2µmHPLCfilter)。
濾過液將可注射至HPLC。
(2)HPLC-ED方法偵測8-OHdG
利用WatersAssociates(Milford,MA,USA)510模式的solventdeliverysystem[含Rheodyne7125(Cotati,CA,USA)injector]及3µmSupelcosil(B,PA.USA)LC-18-DBcolumn(15cmx4.6mm)。
Mobilephase[50mMKH2PO4buffer,pH5.5及甲醇(90:
10v/v)]。
Flowrate為0.8ml/min(backpressure2000psi)。
SamplesareanalyzedbyseparateUV[Kratosmodel773UVdetector(Westwood,NI,USA)]andEC[Bioanalyticalsystem(WestLafayette),IN,USA]LC-4Bamperometricdetectionsystem[使用polytetrafluoro-ethyleneCPTFEtubing]。
(四)以血球為模式評估抗氧化製劑對降低自由基氧化損傷評估方法9-12
(1)全血離心後,將血漿及buffycoat棄除。
紅血球以10mMphosphatebuffer,pH7.4(含135mMNaCl)(PBS)洗三次。
再將血球加入PBS使其hematocrit約為10%。
將製劑放入10%FCS[最後濃度為1:
105~104(w/v)],然後加入25mMAAPH。
另外一管則僅含10%FCS,亦加入25mMAAPH做為control。
將所有試管在37℃條件下培育6小時。
(2)分析項目:
在定時(1,2,3,4,5或6小時)分別取出適量紅血球,同時測定四項指標。
即(A)溶血度(B)血中谷胱甘月太量(C)脂質過氧化指標—MDA(D)SDS-PAGE胞膜蛋白型式。
倘若製劑有保護作用,則以上四種指標與control比較會有明顯差異。
(五)定量磷脂膽鹼過氧化氫(Phosphatidylcholinehydroperoxide,PCOOH)以及磷脂乙醇胺過氧化氫(Phosphatidyl
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 原理 卫生 福利 食品 药物 管理