地中海贫血基因检测操作规程益生堂.docx

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地中海贫血基因检测操作规程益生堂

α-地中海贫血基因检测操作规程（益生堂）

一、目的：

对筛查出来的地贫疑似病例和需要进行地贫产前诊断的夫妇提供进一步的确认。

二、适用范围：

适用于益生堂PCR扩增、琼脂糖电泳技术等分析的操作。

三、原理：

应用特异的PCR引物选择性地扩增不同类型的α-地中海贫血基因，通过琼脂糖凝胶电泳的带型分析，诊断α-地中海贫血基因缺失型。

四、操作规程

（一）标本收集、标本保存、标本转运

1、静脉采血：

从肘静脉或手背静脉抽取静脉血1mL以上，将血液沿管壁缓慢注入加有EDTA或枸橼酸钠的试管内，轻轻混匀，即为抗凝全血。

羊水的采集：

由临床医师经腹壁行羊膜穿刺取得。

采集羊水时速度不宜太快，标本抽取量也不宜太多，一般10-15mL即可。

2、标本一经采集，则应尽快送至实验室检测，抗凝全血室温放置不超过4小时，4℃保存不超过一周，-20℃保存不超过半年，应避免反复冻融。

3、标本装入试管密封，再装入塑料袋中，置冰壶或泡沬箱加冰袋密封运输，在运输过程中应避免剧烈震荡。

4、注意事项

（1）抗凝时，不能用肝素抗凝。

（2）采集羊水穿刺羊膜要在妊娠16周羊水达到200mL以后才能进行。

（二）全血DNA提取操作规程

1、所需试剂及仪器：

试剂由益生堂生物技术（深圳）有限公司提供，包含核酸提取试剂、扩增管、模条、无水乙醇，1.5mL离心管.

仪器有黑马和博日扩增仪、台式高速离心机、旋涡振荡器、真空旋转干燥仪、电泳仪、电泳槽、分子杂交仪、凝胶成像系统。

2、实验前准备工作

2.1、准备好1.5mL无菌离心管及无菌吸头。

2.2、变性液在每次使用前应充分摇匀以保证提取质量。

3、操作步骤

（1）在1.5mL离心管中加入250μL充分摇匀的变性液及100μL抗凝全血，充分混匀，室温放置5分钟。

也可选择以下操作步骤，以获得更高质量的DNA：

在1.5mL离心管中加入1mL无菌水及100μL抗凝全血，充分混匀，室温放置5分钟以裂解红细胞。

13000rmp离心1分钟，弃上清，保留管底白细胞块。

在白细胞块中加入250μL充分摇匀的变性液，充分混匀至没有白细胞块，室温放置5分钟。

（2）8000rpm离心5秒钟，弃去上清，管底可见红褐色沉淀。

将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。

在沉淀中加400μL洗涤液I，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。

将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。

共洗涤3次。

每洗涤一次，管底沉淀物颜色会逐渐变浅，洗涤完3次后的沉淀物近无色。

如果沉淀仍然带有浅黄色，可用同样方法多洗一次。

（3）在沉淀中加500μL洗涤液II，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。

将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。

共洗2次。

（4）最后在沉淀中加500μL无水乙醇，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。

将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。

（5）沉淀置于真空旋转干燥仪中干燥约5-10分钟或者56℃干燥箱中干燥约10-20分钟，当沉淀完全干燥成白色粉末后加入100μL溶解液并混匀。

离心管置于56℃保温10分钟。

8000rpm离心5秒钟，将含有基因组DNA的上清液移到一支新的离心管中，可获得约3-6ugDNA。

变性液：

GuSCN+DTT+硅胶

洗液I：

GuSCN+DTT

洗液II：

乙醇溶液

溶解液：

TE

4、注：

变性液使用前必须充分摇匀；变性液和洗涤液I如有沉淀析出请温育溶解后使用；本试剂盒亦可用于培养的细胞基因组DNA的提取；此基因组DNA可用于PCR扩增、限制性内切酶消化等不同的分子生物学实验。

（三）羊水DNA快速提取操作步骤:

1、8mL羊水8000rpm离心5分钟，弃去上清小心保留管底沉淀，把管底白色沉淀转移到1.5mL离心管中。

（或在1.5mL离心管中加入充分混匀的羊水样本，8000rpm离心5分钟，弃去上清重复以上操作5-6次收集沉淀细胞。

）

2、细胞沉淀液转移到1.5mL离心管后，8000rpm离心5分钟，用微量移液器小心吸走部分上清，保留50μL的沉淀，加入125μL充分摇匀的变性液，充分混匀后室温放置5分钟。

3、8000rpm离心5秒钟，弃去上清，将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。

在沉淀中加150μL洗涤液I，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。

将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。

共洗涤3次。

4、在沉淀中加250μL洗涤液II，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。

将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。

共洗2次。

5、最后在沉淀中加250μL无水乙醇，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。

将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。

6、沉淀置于真空旋转干燥仪中干燥约5-10分钟或者56℃干燥箱中干燥20分钟以上，当沉淀完全干燥成白色粉末后加入50μL溶解液并混匀。

离心管置于56℃保温10分钟。

8000rpm离心5秒钟，将含有基因组DNA的上清液移到一支新的离心管中。

7、注：

变性液使用前必须充分摇匀；乙醇必须干燥完全，有机溶剂抑制PCR扩增。

（四）PCR扩增操作流程

1、所需物品和设备

设备：

离心机、微量移液器（1000l,200l,50l,10l）、PCR扩增仪、超净工作台

材料：

PCR扩增管、已灭菌的移液器吸头（1000l,200l,10l）、PCR反应液、一次性手套、一次性吸水纸，冰盒或冰袋、专用工作服和工作鞋、专用办公用品等。

2、PCR前准备

2.1、在PCR扩增仪上设定所要使用的PCR扩增程序

2.2、穿PCR实验室专用工作服，带一次性手套；确保超净工作台内有PCR专用移液器、移液器吸头、标记笔及离心管架；

2.3、用75%的酒精擦拭超净工作台及PCR所用到的移液器、离心管架等物品，并放入超净工作台中，开启紫外照射30分钟杀菌（这些物品均为PCR专用，放在超净工作台内）；

2.4、将30ml10%次氯酸钠加入放在超净台内的废液缸中；（注意：

如果在操作过程中凡是涉及到移液器碰到废液缸的情况，均需要使用75%的酒精重新擦拭移液器）;

2.5、从冰箱中取出提取的样本DNA，平衡到室温。

3、实验操作步骤（所有过程应在PCR工作间中完成）

3.1、关闭紫外灯，使用75%的酒精对手套进行消毒，手伸入超净台内开始下一步操作

3.2、从试剂盒中取出X+1个PCR管（X=样本数目，1为阴性对照，即蒸馏水），8000rpm离心5s.放在管架上，在管盖上标注样本编号。

3.3、取出DNA样本及对照品，放入离心机中点动离心，取出后按照PCR管次序顺序摆放，放在管架上；

3.4、将放有DNA样本的管架放入超净工作台（样本处理区）内，使用75%的酒精对手套进行消毒后，手伸入超净台内开始下一步操作；

3.5、打开第一个PCRmix管的管盖，从冰上取出阴性对照管（蒸馏水），吸取4µl阴性对照加入PCR管中，然后滴加一滴石蜡油，盖上PCR管盖。

将阴性对照管（蒸馏水）放回冰上；

3.6、垂直将吸头小心打入盛有10%次氯酸钠的废液缸中，确保移液器前端没有碰到废液缸口；

3.7打开第二个PCR的管盖，从管架上拿出与PCR管编号相同的DNA样本管，吸取4µl加入PCR管中，然后滴加一滴石蜡油，盖上PCR管盖，垂直将吸头小心打入盛有10%次氯酸钠的废液缸中，确保移液器前端没有碰到废液缸口；（将DNA样本管放回放有DNA样本的管架上，但确保摆放位置与还没有加样的DNA样本管有区别）；

3.8、重复步骤7，直到DNA样本加完。

对比PCR管的排列及DNA样本管的排列，确保样本加样无误；

3.9、确定加样操作完成后，将所有的PCR管，放入离心机点动离心；

3.10、将阴性（蒸馏水）对照管放入-20℃冰箱保存；

3.11、从离心机中取出PCR管小心轻放在管架上，脱去PCR加样用手套，换PCR扩增室专用衣服，进入PCR扩增区。

3.12、将装有样本的PCR反应管放入PCR扩增区中的PCR扩增仪中，设定扩增程序，开始PCR反应，具体程序如下：

94℃5min

94℃60s

55℃30s35cycles

72℃90s

72℃5min

10℃保存

4、实验后处理

4.1、从超净工作台中拿出废液缸，远离超净工作台的地方倒入塑料袋中，封口后丢弃。

4.2、将废液缸洗净后放回超净工作台，用75%的酒精擦拭超净台及PCR所用到的移

液器、离心管架、旋涡振荡器等物品（这些物品均为PCR专用，放在超净工作台内）；

4.3、开启紫外灯，紫外杀菌30min后关闭；

4.4、扩增产物保存:

扩增结束后，将PCR扩增管放入4oC冰箱保存（4小时内），如超过4小时则放入-20oC冰箱。

5、注意事项

5.1、进入实验室区域必须全程穿着专用工作服，注意不同房间的工作服不能混用，PCR区域的工作服绝对不能进入PCR前区域，PCR产物分析间应与其它操作区隔开，以避免气溶胶交叉污染。

5.2、工作全程必须带有房间专用手套，这样可以起到安全保护作用及控制不同实验室污染的作用。

5.3、样本和试剂应储藏在不同的冰箱中，以防止样本对已打开的试剂产生污染。

5.4、为了避免可能的气溶胶污染，离心机应远离准备PCRmix以及将临床DNA样本加入混合液的地方。

5.5、每次实验之前，试验区域工作台面须用10%次氯酸钠擦拭消毒，然后使用75%酒精擦拭。

（1）所有PCR试剂的准备及PCR模板的加入都应该在超净工作台中完成。

（2）为了避免试剂和样本污染，所有使用的容器及移液器吸头都必须灭菌和消毒。

（3）PCRMIX必须保存在-20℃冰箱中，使用时也必须使用冰浴或冰盒上操作。

（4）在PCR扩增区中，PCR管严禁开盖。

五、电泳检测分析

1、所需物品及设备

荧光染料（EB），6×溴酚蓝上样缓冲液，DNAMarker，PCR产物，琼脂糖粉末,50×电泳缓冲液电泳仪，电泳槽，微波炉，凝胶成像系统，胶床，胶带纸，Parafilm膜，锥形瓶，锡纸，药匙，厚手套，电子天平，1.5mL离心管架，50mL量筒，10μl移液器和配套吸头（灭菌后使用），一次性手套等。

2、实验前准备：

（1）用蒸馏水稀释50×电泳缓冲液至1×电泳缓冲液。

（2）取出-20℃中保存的DNA，室温解冻。

（3）离心管中试剂可以4000r/min离心5s后使用。

3、实验步骤

a.制备1.2%（w/v）的琼脂糖凝胶

b.于胶床未封闭的两端贴上胶带纸，形成约8mm高的挡墙（要确保严密，以免胶液漏出）；将两排梳子分别插入到胶床上的第一和第三个小凹槽内，再把胶床放在水平面上。

c.在锥形瓶中加入0.48g琼脂糖粉末及40mL1×电泳缓冲液，锡纸封口，用微波炉的中高火档加热1分钟左右使琼脂糖溶化，戴厚手套取出锥形瓶（小心烫手）。

d.溶化的琼脂糖溶液冷却到60℃左右时，加入1.5μl荧光染料，摇匀（尽量避免气泡），倒入已准备好的胶床内，在室温下静置20min左右至凝胶固化。

e小心地拔出固定在凝胶中的梳子，撕去胶床两端的胶带纸，用刀将凝胶切开，保证每一块凝胶上有一排加样孔，然后将带凝胶的胶床置于电泳槽中。

注意：

放置时，加样孔的一边应靠近电泳槽的负极。

f在电泳槽内加入足够的1×电泳缓冲液至凝胶完全浸没在缓冲液中。

（2）上样及电泳

a.在Parafilm膜上点上2μl的6×上样缓冲液，再取5-10μlPCR产物与之混合充分，从每排加样孔的第二孔开始，用微量移液器将样品小心加入到凝胶的每个小孔内（包括一个阴性对照）。

b.在每排加样孔的第一个孔内，分别加入5μlDNAMarker。

c.盖好盖子，开启电源，调节电压（20或5V/cm），开始电泳。

注意：

加入样品后，应立即开始电泳，以防样品扩散。

d.当上样缓冲液中的溴酚蓝染料迁移至凝胶的2/3处时，停止电泳（约60-90min）。

4结果观察

（1）戴一次性手套小心取出凝胶放置在紫外透射分析仪的指定位置，盖上盖子，打开紫外灯开关，透过观察镜观看电泳以后的DNA条带。

（2）根据DNAMarker（如图，各数值单位为bp）确定DNA片段的大小；

（3）本实验PCR产物的电泳结果中，长度为1800bp的条带是-珠蛋白正常基因的扩增产物；长度为2000bp，1600bp，1300bp的条带分别是-珠蛋白基因-α3.7缺失型、-α4.2缺失型、--SEA缺失型的扩增产物。

α-地贫三种缺失型电泳检测示意图

5附录

（1）50×电泳缓冲液配方（pH8.5）：

242gTris碱，57.1mL冰醋酸，37.2gNa2EDTA2H2O，加H2O至1L，室温保存。

（2）1×电泳缓冲液：

即将50×电泳缓冲液稀释50倍（即40mmol/LTris•Ac，2mmol/LEDTA）。

六：

临床意义：

对地中海贫血患者α基因缺失SEA、4.2、3.7三种类型和α基因点突变CS、QS、WS三种类型进行诊断。

七：

支持性文件及程序：

1、深圳益生堂生物企业有限公司地贫基因试剂盒说明书