中药肉苁蓉多糖和总苷的提取分离及质量控制方法研究.docx
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中药肉苁蓉多糖和总苷的提取分离及质量控制方法研究
摘要
肉苁蓉为多年生草本植物,分布于新疆、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏等地,具有补肾阳、益精血、润肠通便的功能。
本论文研究内容主要包括以下4个方面:
1、肉苁蓉多糖的研究
肉苁蓉多糖是肉苁蓉的有效成分之一,本文采用水提醇沉法对多糖进行提取分离,通过紫外分光光度法测定粗多糖和可溶性多糖的含量。
结果表明,粗多糖和可溶性多糖的含量分别为4.56%和17.41%;在肉苁蓉多糖提取研究的基础上对肉苁蓉多糖部位进行了研究,通过调节醇沉阶段的含醇量进行分段,用蒽酮-硫酸法对各部分多糖部位进行了含量测定。
结果显示,用20%乙醇沉淀所得多糖的含量最高,达到样品量的9.71%,占总多糖的44.0%。
2、肉苁蓉中毛蕊花糖苷的研究
采用超声辅助提取法对肉苁蓉有效成分进行提取,用高效毛细管电泳法对肉苁蓉中毛蕊花糖苷进行含量测定。
详细考察了分离电压在8~25kV范围和硼酸-硼砂缓冲溶液的pH在8.0~10.0之间对毛蕊花糖苷的分离影响,得到最佳分离条件为:
电压8kV,运行缓冲溶液为30mmol/L的硼酸-硼砂(pH=9.0),室温,检测波长为334nm。
毛蕊花糖苷的浓度在0.015~0.375mg/mL范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程y=13946x+560.32,(R2=0.9983),样品回收率为99.26%,RSD=1.16%,精密度RSD=0.96%。
通过上述研究,建立了毛蕊花苷的高效毛细管电泳含量测定方法,并用此方法测得肉苁蓉中毛蕊花糖苷的含量为样品的1.02~1.04%。
3、肉苁蓉中红景天苷的测定方法研究
采用HPLC和HPCE两种方法对肉苁蓉中红景天苷的测定方法进行了研究。
用HPLC法对肉苁蓉中红景天苷的测定研究,采用色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱,流动相为乙腈∶水(1∶9),流速为1.0mL/min,室温,红景天苷的检测波长为278nm。
红景天苷在0.055~0.44µg范围呈良好的线性关系,其线性回归方程y=91207x-1097,(R2=0.9953),样品的回收率为94.8%,RSD=1.50%,精密度RSD=0.39%。
通过研究得出HPCE法测定红景天苷的最佳条件:
分离电压8kV,运行缓冲溶液30mmol/L的硼酸-硼砂(pH=9.0),室温,检测波长为278nm。
红景天苷的浓度在0.007~0.14mg/mL范围呈良好的线性关系,其线性回归方程y=42915x-92.541,(R2=0.9903)。
样品的回收率为100.1%,RSD=1.45%,精密度RSD=0.96%。
对两种分离测定红景天苷的方法进行了比较,结果显示高效液相色谱法与毛细管电泳法对肉苁蓉中红景天苷的分离效果均较好,测定结果无明显差异,其含量均为0.103~0.120%。
4、肉苁蓉的指纹图谱研究
本文采用HPCE方法,对肉苁蓉样品的提取成分进行了分离分析,以肉苁蓉的主要有效成份毛蕊花糖苷作为评价指标,建立了肉苁蓉药材的HPCE指纹图谱,其分离度和重现性均较好,各峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于5%,为肉苁蓉药材的质量标准的建立提供了科学依据。
关键词:
肉苁蓉;多糖;毛蕊花糖苷;红景天苷;指纹图谱
Abstract
HerbaCistanche,asperennialherbs,distributeinXinjiang,InnerMongolia,Shaanxi,Gansu,Ningxiaandotherplaces,withkidney-yang,essenceandblood,andRunchangpurgefunction.
Thisthesisincludesfourparts:
1.StudyonthepolysaccharidesofHerbaCistanche
CistanchedeserticolapolysaccharidesaretheactiveingredientsinHerbaCistanche.Polysaccharideswereseparatedbyusingaqueousalcoholextractionmethodandthecontentofcrudepolysaccharideandsolublepolysaccharidewasdeterminedwithultravioletspectrometry.TheresultsshowedthatthecontentofcrudepolysaccharideandsolublepolysaccharideinHerbaCistancheis4.56%and17.41%separately.BasedonthestudyoftheextractionofpolysaccharideinCistanche,polysaccharidescontentisthehighestwhen20%ethanolwasused,whichcangotoupto9.71%ofsampleand44.0%oftotalpolysaccharides.
2.StudyontheActeosideofHerbaCistanche
Ultrasound-assistedextractionofactiveingredientswasemployed,andacteosideinHerbaCistanchewasdeterminedbyhighperformancecapillaryelectrophoresis.Afterdetailedstudyoftheimpactoftheseparationvoltageintherangeof8~25kVandboricacid-boraxbuffersolutionofpH8.0~10.0ontheseparationofacteoside,thebestseparationconditionswereasfollows:
voltageat8kV,runningbuffersolutionwith30mmol/Lofboricacid-borax(pH=9.0),roomtemperature,anddetectionwavelengthat334nm.Acteosideconcentrationintherangeof0.015~0.35mg/mLshowedgoodlinearrelationship.Thelinearregressionequationisy=13946x+560.32(R2=0.9983),andsamplerecoveryyieldwas99.26%withRSD(1.16%)andprecisionofRSD(0.96%).Throughthisresearch,weestablishedthemeasurementofacteosidebyhighperformancecapillaryelectrophoresismethod,andthecontentofMulleinglycosideincistanchewasdeterminedtobe1.02~1.04%bytheabovemethod.
3.StudyonthedeterminationofsalidrosideinHerbaCistanche
TheuseofHPLCandHPCEmethodsforthedeterminationofsalidrosideinHerbaCistanchewasstudied.ForHPLCmethod,columnloadedwithoctadecylsilanebondedsilica,mobilephaseofacetonitrile:
water(1:
9),flowrate1.0mL/minatroomtemperature,andthedetectionwavelengthat278nmwereemployed.Theresultsindicatedthatsalidrosideintherangeof0.055~0.44μgwasingoodlinearrelationshipwiththelinearregressionequationy=91207x-1097,(R2=0.9953),andsamplerecoveryyieldwas94.8%,RSD=1.50%,andprecisiondegreeofRSD=0.39%.
Throughourstudy,thebestconditionsforHPCEmethodwereasfollows:
separationvoltageat8kV,runningbuffer30mmol/Lofboricacid-borax(pH=9.0),roomtemperature,anddetectionwavelengthat278nm.Theresultsshowedsalidrosideconcentrationintherangeof0.007~0.14mg/mLwasingoodlinearrelationshipwiththelinearregressionequationy=42915x-92.541,(R2=0.9903).Samplerecoveryyieldwas100.1%,RSD=1.45%,andprecisionofRSD=0.96%.
Incomparisonofseparationanddeterminationofsalidrosidebytwomethods,theresultsshowedthatbothhigh-performanceliquidchromatographyandcapillaryelectrophoresiscanwellworkonsalidrosidecistancheseparationwithoutsignificantdifferencesinmeasurements,anditscontentrangesfrom0.120%to0.103%.
4.StudyonthefingerprintofHerbaCistanche
Inthispaper,HPCEmethodwasemployedtoanalyzetheingredientinCistanchesamples.Themainactiveingredient,theActeosideofHerbaCistanche,wassetasevaluationindextoestablishtheHPCEcistanchefingerprint,andtheseparationdegreeandreproducibilityarereliableandexcellent.TheRSDofallrelativepeakareaandtherelativeretentiontimearelessthan5%.OurresearchprovidesasolidscientificbasistotheestablishmentofqualitystandardsofmedicinalCistanche.
Keywords:
HerbaCistanche,polysaccharides,acteoside,salidroside,fingerprint
第一章前言
肉苁蓉(HerbaCistanche)为列当科(Oroban-chaceae)植物肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.ia)的带鳞片的干燥肉质茎,又名苁蓉、大芸、金笋、地精[1]。
本属植物全世界约有18个种,我国约有4个种1个变种,分别为肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)、盐生肉苁蓉[C.salsa(C.A.Mey.)G.Beck]、管花肉苁蓉[C.tubulosa(Schenk)R.Wight]、白花盐肉苁蓉(C.salsavar.albifloraP.F.TuetZ.C.Lou)及沙苁蓉(C.sinensisG.Beck),《中药大辞典》收载有3种:
盐生肉苁蓉、肉苁蓉、迷肉苁蓉[C.ambigua(Bge.)B.Beck]。
《中华人民共和国药典》(2005年版)收载了肉苁蓉为药用肉苁蓉。
肉苁蓉为多年生草本植物,生于盐碱地、干河沟、沙地、戈壁滩一带,寄生于梭梭、盐爪爪属植物、禾本科植物、柽柳科植物等植物的根上。
分布于新疆、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏等地。
肉苁蓉始载于《神农本草经》,列为上品。
《本草经疏》提到:
“肉苁蓉,滋肾补精血元之要药,气本做温,相传以为热者误也。
甘能除热补中,酸能入肝,咸能滋肾,肾肝为阴,阴气滋长,则五脏元劳热自退,肾肝足,则精血日盛。
”《本草汇言》提到:
“肉苁蓉,养命门,滋肾气,补精血之药也。
”《玉楸药解》“肉苁蓉滋木清风,养血润肠,善滑大肠”。
《本草正义》提到:
“能精血而通阳气,故曰益精气”。
在《本草纲目》中李时珍提到“此物补而不峻,故有从容之兮”。
肉苁蓉味甘、咸,性温,具有补肾阳、益精血、润肠通便的功能[2],由此可见肉苁蓉在中药的发展中起着非常的作用。
1985年版《中华人民共和国药典》就收载肉苁蓉为中药材,其制剂有“镇阳固精丸”等。
在1991年至2008年中华人民共和国部颁标准中的6152品种的药品中,大约有44种以肉苁蓉为主药的药品,如补肾益精丸,回春如意胶囊,益肾壮阳胶囊,便秘通,长春药酒等,含肉苁蓉的药物发展逐渐走向产业化,发展更多的制剂型药物,适合不同情况的人的需要。
肉苁蓉作为一种中药从简单的传统煮药,发展到提取有效成分,制成胶囊、口服液、酊剂等。
由于中药受到产地、采摘时间的不同、气候及其它条件的影响,其化学成份及其含量均有差别,需要用科学的手段来控制有效成分,为向世界上发达国家管理药品的水平看齐,这样才能使含肉苁蓉的药品及其制剂型的产业化。
在2000年版和2005年版《中华人民共和国药典》中肉苁蓉的质量标准很清楚,用肉苁蓉的活性物质(毛蕊花苷和松果菊苷)进行质量控制,可以对含有肉苁蓉的药物,用毛蕊花糖苷和松果菊苷含量进行药物的优劣进行鉴定。
从20世纪80年代开始,国内外对肉苁蓉的化学成分进行了大量研究,随着分离提取和检测技术的飞速发展,已分离出多种类型的物质,主要可分为苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、生物碱等。
环烯醚萜类化合物广泛存在于植物界中,其在植物分类学的重要作用及多种生物活性,近年来研究发展迅速,研究表明环烯醚萜苷类化合物具抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、利胆、通便及镇静等多种生理活性[3];多糖类成分在增强机体免疫功能、抗肿瘤方面的作用愈来愈受到人们的重视,其中对免疫增强作用机理的研究已深入到分子、受体水平;甜菜碱具有抗脂肪肝和抗肿瘤以及扩张外周血管和降压的作用;微量元素在人体内起着极其重要的双向调节作用,可纠正体内失调的物质代谢平衡,达到祛病健身,延年益寿之功效,中草药中的微量元素通常又与有机活性基团结合,使其活性高增,易于吸收。
结合相关文献,对肉苁蓉属的化学成分作了全面系统的介绍,其中对苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木质素及其苷类,对肉苁蓉药材质量控制标准和含量测定及中药的提取方法和含量测定作了综述。
为肉苁蓉资源的保护、引种栽培、品质的控制及新药的研发提供了科学依据。
1.1化学成分
1.1.1苯乙醇苷类
现代研究表明,肉苁蓉具有壮阳、抗衰老、提高免疫功能,增强记忆力,降血脂和通便等作用[4],有“沙漠人参”之美誉,其主要活性成分是苯乙醇苷类(PhGs)[5]。
据文献报道,苯乙醇苷类具有抗不良刺激、增强学习记忆力和助阳等多方面功能,肉苁蓉含这类成分较多。
国内学者对C.desertieola研究较多,堵年生等从中分得松果菊苷、肉苁蓉苷A、类叶升麻苷、2-乙酰类叶升麻苷[6];徐文豪等从中分得类叶升麻苷、2-乙酰类叶升麻苷、松果菊苷、肉苁蓉苷A、B、C、H等[7];徐朝晖从中分得红景天苷[8]等。
由于PhGs的紫外吸收很强,尤其适用于高效液相色谱法(HPLC)分析,已有多位学者对本属各植物中的PhGs成分肉苁蓉属植物的PhGs,发现所研究的7个植物样品皆含有大量的PhGs,其中土耳其产盐生肉苁蓉的PhGs总量最高,国产盐生肉苁蓉、卡塔尔产鳔苁蓉、巴基斯坦产和巴林产管花肉苁蓉的PhGs总量较多,而国产荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉的PhGs总量较少;他们还对每个植物中所含的7个PhGs化合物进行了定量分析,结果发现7个PhGs的含结果表明5种生药皆含有多种PhGs,其中荒漠肉苁蓉、栽培的荒漠肉苁蓉、盐生肉苁蓉、盐生油肉苁蓉、白花盐苁蓉和管花肉苁蓉所含PhGs成分相似,而沙苁蓉与其他种差别较大。
此外对5个PhGs成分进行了含量测定,5种生药的含量各不相同。
国外学者对C.salsa的研究:
日本小林弘美(HiromiKobayashi)等对我国内蒙产C.salsa进行了系统研究,先后从中分离得到苯乙醇苷类成分[9-12]:
肉苁蓉苷A(CistanosideA)、肉苁蓉苷B(CistanosideB)、松果菊苷(Echinacoside)、肉苁蓉苷C(CistanosideC)、肉苁蓉苷D(CistanosideD)、类叶升麻苷(Acteoside)、2-乙酰类叶升麻苷(2-Acetyacteoside)、肉苁蓉苷E(CistanosideE)、肉苁蓉F(CistanosideF)及OsmanthusideB;小林弘美等又从巴基斯坦卡拉奇产C.tubulosa中分得新化合物[13]:
TubulosideA、TubulosideC、TubulosideB、异类叶升麻苷(Acteosideisomer)和TubulosideD;日本唐沪ひろ子等从C.salsa中分得新化合物[14]:
肉苁蓉苷H(CistanosideH)、肉苁蓉苷I(CistanosideI)、Decaffeoylacteoside、肉苁蓉苷G(CistanosideG)、红景天(Salidroside);FumioYoshizawa等从C.tubulosa中得到新化合物[15]:
TubulosideE、SyringalideA、3′-α-L-rhamnopyranoside及Isosyringalide-3′-α-L-rhamnopyranoside。
1.1.2多糖
徐文豪从C.deserticola中分得葡萄糖,蔗糖,甜菜碱、琥珀酸,甘露醇,β-谷甾醇,胡萝卜苷等。
薛德钧从C.tubulosa中分得β-谷甾醇,D-甘露醇,D-葡萄糖,D-果糖,胡萝卜苷,琥珀酸等[16]。
又从产地不同的C.deserticola中分离出杂多糖,并进行了定性定量分析,发现产地不同的肉苁蓉中所含的单糖种类不尽相同,多糖的含量不同,且组成杂多糖的单糖成分也不同,内蒙阿盟产的肉苁蓉游离单糖为阿糖和葡萄糖,其多糖中单糖组分为鼠李糖、阿糖、半乳糖,多糖含量为13%;新疆天山以南产肉苁蓉中的游离单糖为果糖、半乳糖,组成多糖的单糖成分为鼠李糖、阿拉伯糖、果糖和葡萄糖,多糖含量为8.5%[17]。
赵中岩等从野生肉苁蓉的茎中分离水溶性多糖和粗多糖,以葡萄糖和半乳糖为主兼有阿拉伯糖鼠李糖和甘露糖的中性杂多糖。
1.1.3环烯醚萜类
目前从肉苁蓉属植物中分离得到环烯醚萜2个,环烯醚萜苷10个。
徐文豪等从C.desterticola中分得8-表马钱子苷酸[18];罗尚夙等从C.desterticola中分得8-表马钱子酸葡萄糖苷[19];日本小林弘美等对我国内蒙古产肉苁蓉C.salsa进行了系统研究[20-22],从中分得8-表马钱子酸(8-Epiloganicacid)、Mussaenosideacid、Gluroside、京尼平酸(Geniposidicacid)、Bartsioside、6-Deoxy-catalpol、苁蓉素(Cistanin)、苁蓉氯素(Cistanchlorin)等化合物。
1.1.4木质素
小林弘美从C.salsa中分得[22-24]:
(+)-Syringaresinolo-β-D-glucopyranoside、Liriodendrin、松脂醇(Pinoresinol)粉末、(+)-Pinoresinolo-β-D-glucopyra-noside和松脂酸;从C.tubulosa中分得新木质素:
De-hydrodiconiferylalcoholγ′-O-β-D-glucopyranosid,及Dehydrodiconiferylalcohol4′-o-β-D-glucopyranoside。
1.1.5挥发油成分
1988年,堵年生、曲淑慧等从新疆产的C.salsa中用水蒸气蒸馏法提取精油,并用MS/DS手段分析了精油中的成分和相对含量,共鉴定出38个化学成分[25];马熙中等利用超临界流体萃取技术测定了C.deserticola中挥发性组分中的三十多个化合物,并将其分为三类:
正构烷烃C16-C28,酯类化合物中有三个主要成分是邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯和邻苯二甲酸二异辛酯,含氧含氮化合物以丁子香酚为主,其次为香草醛和异丁子香酚等[26];回瑞华等用同时蒸馏-萃取法提取肉苁蓉挥发性物质,测得肉苁蓉挥发油的含量为3.5%;利用C.C/MS法分离确认出24种化学成分;用峰面积归一化法得出各化学成分在挥发油中的相对百分含量,其中主要成分为丁香酚,占总挥发油的83.60%;又用单离子法分离出丁香酚,并用IR,EI-MS析确认。
1.1.6其它类
肉苁蓉的有效成分还包括酚苷、单萜苷、甾醇、生物碱及微量元素等。
日本小林弘美从C.salsa中分得8-羟基牦牛儿醇-1-β-吡喃葡萄糖苷、D-甘露醇、β-谷甾醇、琥珀酸、β-谷甾醇-β-D-吡喃葡萄糖苷和丁香苷;从C.tubulosa中分得20-Hy-droxyecdysone及6-去氧梓醇。
罗尚夙等从C.deserticola中分离出甘露醇,并测定其中氨基酸的含量[27]。
陈妙华等从C.deserticola中分得β-谷甾醇、胡萝卜苷、丁二酸、咖糖酯、三十烷醇及甜菜碱[28]。
张淑运对炮制前后的C.deserticola的甜菜碱的含量进行了对比分析[29]。
屠鹏飞从C.deserticola鲜花序中分得6-去氧梓醇,
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