附录一试验室常用溶液配制.docx
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附录一试验室常用溶液配制
一、常用贮液与溶液
(一)常用缓冲液
1.磷酸缓冲液
(1)25℃下磷酸钾缓冲液的配制※
pH
1mol/LK2HPO4(mL)
1mol/LKH2PO4(mL)
(2)25℃下磷酸钠缓冲液的配制※
pH
1mol/LNa2HPO4(mL)
1mol/LNaH2PO4(mL)
※:
用蒸馏水将混淆的两种
1mol/L储存液稀释至
1000mL,依据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH
值:
pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])
在此,pK’=6.86(25℃)。
2.电泳缓冲液
常用的电泳缓冲液
缓冲液
使用液
浓储存液(每升)
Tris-乙酸(TAE)
1×:
乙酸
50×:
242gTris碱
57.1mL冰乙酸
100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)
Tris-磷酸(TPE)
1×磷酸
10×:
10gTris碱
15.5mL85%磷酸()
40mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)
Tris-硼酸(TBE)a
0.5×硼酸
5×:
54gTris碱
27.5硼酸
碱性缓冲液
Tris-甘氨酸
说明:
b
c
20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)
1×:
50mmol/LNaOH1×:
5mL10mol/LNaOH
1mmol/LEDTA2mL0.5mmol/LEDTA(pH8.0)
1×:
25mmol/LTris5×:
15.1gTris
250mmol/L甘氨酸94g苷氨酸(电泳级)(pH8.3)
0.1%SDS50mL10%SDS(电泳级)
①TBE溶液长时间寄存后会形成积淀物,为防止这一问题,可在室温下用玻璃瓶保留5×溶液,出现
积淀后则予以荒弃。
以片都以1×TBE作为使用液(即1:
5稀释浓贮液)进行琼脂糖凝胶电泳。
但0.5×的使用液已具备
足够的缓冲容量。
当前几乎全部的琼脂糖胶电泳都以1:
10稀释的储存液作为使用液。
进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小,故经过缓冲液的电流量往常较大,需要使用1×TBE
以供给足够的缓冲容量。
②碱性电泳缓冲液应现用现配。
③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3.凝胶加样缓冲液
缓冲液种类
6×缓冲液
储存温度
0.25%
溴酚蓝
Ⅰ
0.25%
二甲苯青FF
4℃
40%(W/V)蔗糖水溶液
0.25溴酚蓝
0.25%
二甲苯青FF
Ⅱ
室温
15%聚蔗糖(Ficoll400)
0.25%
溴酚蓝
Ⅲ
二甲苯青
4℃
0.25%
FF
30%甘油水溶液
0.25%溴酚蓝
Ⅳ
4℃
40%(W/V)蔗糖水溶液
碱性加样缓冲液:
300mmol/LNaOH
6mmol/LEDTA
18%聚蔗糖(Ficoll400)
0.15%溴甲酚绿
4℃
Ⅴ
0.25%二甲苯青FF
使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三:
增大样品密度;以保证DNA平均进入样品孔内;
使样品体现
颜色,进而使加样操作更加便利,含有在电块中能以可预知速率朝阳极泳动的染料。
溴酚蓝在琼脂
糖中挪动的速率约为二甲苯青
FF的2.2倍,而与琼脂糖浓度没关。
以
0.5×TBF作电泳液时,溴酚蓝
在琼脂糖中的泳动速率约与长
300bp的双链线状DNA同样,而二甲苯青FF的泳动则与长
4kb的双
链线状DNA同样。
在琼脂糖浓度为
0.5%~1.4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并
不明显。
采用哪一种加样染料纯属个人喜恶。
可是,关于碱性凝胶应该使用溴甲酚绿作为示踪染料,因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜亮。
4.各样pH值的Tris缓冲液的配制
各样pH值的Tris缓冲液的配制
所需pH值(25℃)
的体积
7.1
45.7
7.2
44.7
7.3
43.4
7.4
42.0
7.5
40.3
7.638.5
7.7
36.6
7.8
34.5
7.9
32.0
8.0
29.2
某一特定pH值的缓冲液的配制:
将碱溶液与上表所示相应体积(单位:
mL)的混淆,加水将体积调至100mL
(二)常用酶的配制
1.溶菌酶
用水配制成50mg/mL的溶菌酶溶液,分装成小份并保留于-20℃。
每一小份一经使用后便予抛弃。
2.蛋白水解酶类
储存液
储存温度
反响浓度
反响缓冲液
温度
预办理
Tris(pH7.8)
链霉蛋
20mg/mL
-20℃(溶
1mg/mL
37℃
自消化b
白酶a
于水)
0.5%SDS
Tris(pH7.8)
蛋白酶
20mg/mL
-20℃(溶
50μg/mL
37~
不必预处
Kc
于水)
理
56℃
0.5%SDS
a:
链霉蛋白酶是从链球菌(
Streptomycesgriseus)中分别到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混淆物。
b:
自消化可除去DNA酶和RNA酶的污染,经自消化的链酶蛋白酶的配制方法以下:
把该酶的粉
末溶解于10mmol./LTris
·HCl(pH7.5)、10mmol/LNaCl
中,配成20mg/mL浓度,于37℃温育1h。
经
消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中,保留
-20℃。
c:
蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,
从林伯氏白色念球菌(TritirachiumalbumLimber
)
中纯化获得。
该酶有两个
Ca2+联合位点,它们离酶的活性中心有必定距离,与催化机理并没有直接关
系。
但是,假如从该酶中除掉
Ca2+,因为出现远程的构造变化,催化活性将丧失
80%左右,但其剩
余活性往常已足以降解在一般状况下污染酸制品的蛋白质。
所以,蛋白酶
K消化过程中往常加入
EDTA(以克制依靠于Mg2+的核酸酶的作用)。
可是,假如要消化对蛋白酶K拥有较强耐心的蛋白,
如角蛋白一类,则可能需要使用含有
1mmol/LCa2+而不含EDTA
的缓冲液。
在消化完成后、纯化核
酸前要加入EGT()至终浓度为
2mmol/L,以鳌合Ca2+。
3.无DNA酶的RNA酶
将胰RNA
酶(RNA酶A)溶于10mmol/LTris
·HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中,配成10mg/mL的
浓度,于100℃加热15min,迟缓冷却至室温,分装成小份保留于
-20℃。
(三)常用抗生素溶液
储存液a
工作浓度
抗生素
浓度
保留条件
紧密型质粒
废弛型质粒
氨苄青霉素
50mg/mL(溶于水)
-20℃
20μg/mL
60μg/mL
羧苄青霉素
50mg/mL(溶于水)
-20℃
20μg/mL
60μg/mL
氯霉素
34mg/mL(溶于乙醇)
-20℃
25μg/mL
170μg/mL
卡那霉素
10mg/mL(溶于水)
-20℃
10μg/mL
50μg/mL
链霉素
10mg/mL(溶于水)
-20℃
10μg/mL
50μg/mL
四环素b
5mg/mL(溶于乙醇)
-20℃
10μg/mL
50μg/mL
a:
以水为溶剂的抗生素储存液经过0.22μm滤器过滤除菌。
以乙醇为溶剂的抗生素溶液不必除菌处
理。
全部抗生素溶液均应放于不透光的容器保留。
b:
镁离子是四环素的拮抗剂,四环素抗性菌的挑选应使用不含镁盐的培育基(如LB培育基)。
(四)常用储存液的配制
1.30%丙烯酰胺溶液
【配制方法】
将29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于整体积为60mL的水中。
加热至加水至终体积为100mL。
用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌,查证该溶液的,置棕色瓶中保留于室温。
37℃溶解之,补
pH值应不大于
【注意】
丙烯酰胺拥有很强的神经毒性并能够经过皮肤汲取,其作器具积累性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可以为聚丙烯酰胺无毒,但也应慎重操作,因为它还可能会含有少许未聚合资料。
一些价钱较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺往常含有一些金属离子,在丙烯酰胺储存液中加入大概0.2体积的单床混淆树脂(MB-1Mallinckrodt),搅拌留宿,而后用Whatman1号滤纸过滤以纯化之。
在储存时期,丙烯酰胺和双丙烯酰胺会迟缓转变成丙烯酰和双丙烯酸。
2.40%丙烯酰胺
【配制方法】
把380g丙烯酰胺(DNA测序级)和20gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于整体积为600mL
持续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法办理,但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为
的蒸馏水中。
1L。
【注意】
见上述配制30%丙烯酰胺的说明,40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。
3.放线菌素D溶液
【配制方法】
把20mg放线菌素D溶解于4mL100%乙醇中,1:
10稀释储存液,用100%乙醇作空白比较读取OD440
值。
放线菌素D(分子量为1255)纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21,900,故而1mg/mL的放
线菌素D溶液在440nm处的吸光值为,放线菌素D的储存液应放在包有箔片的试管中,保留
于-20℃。
【注意】
放线菌素D是致畸剂和致癌剂,配制该溶液时一定戴手套并在通风橱内操作,而不可以在开放在实验桌面长进行,提防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。
药厂供给的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等增添剂。
只需经过丈量储存液在440nm波优点的光汲取确立放线菌素D的浓度,这种制品即可用于克制自己指引作用。
4.腺苷三磷酸(ATP)溶液
【配制方法】
在0.8mL水中溶解60mgATP,用调至pH值至,用蒸馏水定容1mL,分装成小份保留于-70℃
5.10mol/L乙酸酰溶液
【配制方法】
把770g乙酸酰溶解于800mL水中,加水定容至1L后过滤除菌。
6.10%过硫酸铵溶液
【配制方法】
把1g过硫酸铵溶解于终量为10mL的水溶液中,该溶液可在4℃保留数周。
7.BCIP溶液
【配制方法】
把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP)溶解于10mL100%的二甲基甲酰胺中,保留于4℃
8.2×BES缓冲盐溶液
【配制方法】
用整体积90mL的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸]、1.6gNaCl
和0.027gNa2HPO4,室温下用HCl调理该溶液的pH值至、而后加入蒸馏水定容至
100mL,
用0.22μm滤器过滤除菌,分装成小份,保留于-20℃。
9.1mol/LCaCl2溶液
【配制方法】
在200mL蒸馏水中溶解54gCaCl2·6H2O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成10mL小份储存于-20℃。
【注意】
制备感觉态细胞时,拿出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100mL,用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过
滤除菌,而后骤冷至0℃。
10.溶液
【配制方法】
在20mL蒸馏水中溶解13.5gCaCl2·6H2O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1mL小份储存于-20℃。
11.1mol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液
【配制方法】
用乙酸钠溶液()溶解3.09gDTT,过滤除菌后分装成1mL小份储存于-20℃。
【注意】
DTT或含有DTT的溶液不可以进行高压办理。
12.脱氧核苷三磷酸(dNTP)溶液
【配制方法】
把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右,用微量移液器汲取碱分别调理
每一dNTP溶液的pH值(用pH试纸检测),把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适合稀释,
在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实质浓度,而后用水稀释成终浓度为
50mmol/L的dNTP,分装成小份储存于-70℃。
碱基
波长(nm)
消化系数(ε)[L/(mol·cm)]
A
259
×104
G
253
×104
C
271
3
×10
T
260
3
×10
比色杯光径为1cm时,吸光度=εM
13.0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液
【配制方法】
在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H2O),在磁力搅拌器上强烈搅拌,
用NaOH调理溶液的pH值至(约需20gNaOH颗粒)而后定容至1L,分装后高压灭菌备用。
【注意】
EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至靠近,才能完整溶解。
14.溴化乙锭(10mg/mL溶液)
【配制方法】
在100mL水中加入1g溴化乙锭,磁力搅拌数小时以保证其完整溶解,而后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中,保留于室温。
【注意】
当心:
溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性,使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套,称量染料时要戴面罩。
15.2×HEPES缓冲盐溶液
【配制方法】
用总量为90mL的蒸馏水溶解1.6gNaCl、0.074gKCl、0.027gNa2PO4·2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES,
用调理pH值至,再用蒸馏水定容至100mL。
用0.22μm滤器过滤除菌,分装成5mL小份,储存于-20℃。
16.IPTG溶液
【配制方法】
IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(分子量为),在8mL蒸馏水中溶解2gIPTG后,用蒸馏水定容至10mL,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1mL小份储存于-20℃。
17.1mol/L乙酸镁溶液
【配制方法】
在800mL水中溶解214.46g四水乙酸镁,用水定容至1L过滤除菌。
18.1mol/LMgCl2溶液
【配制方法】
在800mL水中溶解203.4gMgCl2·6H2O,用水定容至1L,分装成小份并高压灭菌备用。
【注意】
MgCl2极易潮解,应选购小瓶(如100g)试剂,启用新瓶后勿长久寄存。
19.β-巯基乙醇(BME)溶液
【配制方法】
一般获得的是溶液,应装在棕色瓶中保留于4℃。
【注意】
BME或含有BME的溶液不可以高压办理。
20.NBT
溶液
【配制方法】
把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于
10mL70%的二甲基甲酰胺中,保留于
4℃。
21.酚/氯仿溶液
【配制方法】
把酚和氯仿等体积混淆后用HCl(pH7·.6)抽提几次以均衡这一混淆物,
上边覆盖等体积的HCl(pH7·.6)液层,保留于4℃。
置棕色玻璃瓶中,
【注意】
酚腐化性很强,并可惹起严重灼伤,操作时应戴手套及防备镜,穿防备服。
全部操作均应在化学通风橱中进行。
与酚接触过的部位皮肤应用大批的水冲洗,并用肥皂和水清洗,忌用乙醇。
22.10mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液
【配制方法】
用异丙醇溶解PMSF成(10mmol/L),分装成小份储存于-20℃。
若有必需可配成浓度高
达的储存液(100mmol/L)。
【注意】
PMSF严重伤害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,吸入、吞进或经过皮肤汲取后有致命危险。
一旦眼睛或
皮肤接触了PMSF,应立刻用大批水冲刷之。
凡被PMSF污染的衣物应予抛弃。
PMSF在水溶液中不稳固。
应在使用前从储存液中现用现加于裂解缓冲液中。
PMSF在水溶液中的活
性丧失速率随pH值的高升而加速,且25℃的失活速率高于4℃。
pH值为8.0时,20μmmol/LPMSF
水溶液的半寿期大概为85min,这表示将PMSF溶液调理为碱性(pH>8.6)并在室温搁置数小时后,可安全地予以抛弃。
23.磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液
【配制方法】
在800mL蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,用HCl调理溶液的pH值至7.4加水定容至1L,在15lbf/in2(1034105Pa)×高压下蒸气灭菌20min。
保留于室温。
24.1mol/L乙酸钾(pH7.5)溶液
【配制方法】
将9.82g乙酸钾溶解于90mL纯水中,用2mol/L乙酸调理pH值至7.5后加入纯水定容到1L,保留
于-20℃。
25.乙酸钾溶液(用于碱裂解)
【配制方法】
在60mL5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5mL冰乙酸和28.5mL水,即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。
26.3mol/L乙酸钠(pH5.2和pH7.0)溶液
【配制方法】
在80mL水中溶解408.1g三水乙酸钠,用冰乙酸调理pH值至5.2或用稀乙酸调理pH值至,加
水定容到1L,分装后高压灭菌。
27.5mol/LNaCl溶液
【配制方法】
在800mL水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L,分装后高压灭菌。
28.10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液
【配制方法】
在900mL水中溶解100g电泳级SDS,加热至68℃助溶,加入几滴浓盐酸调理溶液的pH值至,加水定容至1L,分装备用。
【注意】
SDS的微细晶粒易扩散,所以称量时要戴面罩,称量完成后要除去残留在称量工作区和天平上的SDS,10%SDS溶液不必灭菌。
29.20×SSC溶液
【配制方法】
在800mL水中溶解175.3gNaCl和
柠檬酸钠,加入数滴
10mol/LNaOH
溶液调理
pH
值至
,
加水定容至1L,分装后高压灭菌。
30.20×SSPE溶液
【配制方法】
在800mL
(约需
水中溶解17.5gNaCl、27.6gNaH2PO4·H2O和7.4gEDTA,用
6.5mL10mL/LNaOH),加水定容至1L,分装后高压灭菌。
NaOH
溶液调理
pH
值至
31.100%三氯乙酸溶液
【配制方法】
在装有
500gTCA
的瓶中加入
227mL
水,形成的溶液含有
100%(M/V)TCA。
32.Tris
缓冲盐溶液(
TBS)(25mmol/LTris
)
【配制方法】
在800mL蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱,加入0.015g酚并用HCl调至pH值至,
用蒸馏水定容至1L,分装后在151bf/in2(1.034105Pa)×高压下蒸汽灭菌20min,于室温保留。
33.X-gal
溶液
【配制方法】
X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。
用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/mL的储存液。
保
存于一玻璃管或聚丙烯管中,装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被损坏,并应贮
存于-20℃。
X-g
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