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电生理实验常见问题解答.docx
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电生理实验常见问题解答
电生理实验常见问题解答
电生理实验常见问题解答
(1)『转载』
2010-10-0914:
53
请问目前分析细胞外放电的信号处理软件较好的是什么?
价格昂贵的有国外的PCLAMP系列软件和POWERLAB;价格便宜的较好用的有国产的PCLAB和MEDLAB。
如果感兴趣输入GOOGLE,一搜即知。
axonguide是很经典的哦,大家可以到公司主页上下载本书主要针对PATCH,是AXON公司的产品配套广告说明书,但是也包含了不少基本电生理知识,集中阅读一下第1、2章节有帮助。
可以下载看看,网站如下,
请教:
干扰的大小如何检测?
检测干扰大小和你记录电信号一样,可以从相关软件读出来,也可以从示波器上读出。
建议丁香妹妹找一些基础电生理书籍熟悉一下,不要着急,先入门为重。
请问微电极的电阻如何测量?
怎样才能保证电极尖端已被电极内液完全充满?
给予电极一个电流/电压,可以从示波器上读出来,也可以从相应的放大器上显示出来。
建议购买带有芯的玻璃电极,这样可以简单地从尾部灌入内液后,轻轻用手指敲打电极即可;如果是无芯电极,就需要先用注射器将电极尖端充满,而后在从尾部灌入内液。
问题是有时尖端太细,从尾部注入内液后,很难保证尖端全被充满.
注射器接皮管——皮管接电极尾部——电极尖端深入电极液中——抽吸注射器——电极尖端充满液体——再从电极尾部管电极内液——解决问题了。
我在记录细胞外放电时,干扰太大,诸如50hz的交流电干扰,请问如何尽可能地排除这些干扰信号?
交流电干扰应该不难处理,只需要中间接一个直流电转换器即可。
我想用Patch做平滑肌的BK通道,请教Pleace前辈,在酶解法分离细胞时,使用DMEM会因为含钙高而影响结果吗?
文献多数都用无钙液,如果使用前我用PBS洗三次是否可以?
你最好用无钙液,即使后来用PBS洗三次也不可以。
因为之前的无钙液操作不仅可以保护细胞,而且可以使之处于低兴奋状态。
屏蔽和接地是电生理基本要求。
如果你记录的信号足够大的话,可以不用屏蔽。
但生物电信号一般都很弱,这就是为什么要屏蔽和接地。
也是为什么很多时候晚上做实验干涉小——因为晚上用大功率电器的人相对少些,空间的电磁干扰相对小些,地线相对也干净一些。
屏蔽笼即法拉第笼,一般是一层铜网,一层铁网。
铜网屏蔽电,铁网屏蔽磁。
屏蔽笼和系统的信号共地。
关于地线,根据你的系统所记录的信号的强弱要求可以不同,信号越弱,要求越高。
一般细胞外记录甚至更粗的记录要求相对不高。
要是做到单通道水平,就不是凑合能解决问题的。
就是这样,电生理的地线也应该和公共地线区分开来。
一般比较正规的电生理实验室的地线应该单独埋设。
地线埋设的要求其实很简单,尽量减小对地电阻。
但实施起来就有很多方法了。
我听说的一个方法是:
从实验室下到地的主线用大概10cm的铜缆。
地上要挖个深1.5—1.8m、1.5*1.5m宽的坑。
铜缆用铜铆钉(尽量减少材质造成的电阻差异)焊在一块1.5m*1.5m*4cm的铜板上。
铜板放入坑中。
板上埋2.5kg食盐、2.5kg木炭。
再将坑添上。
主线到各个信号地分支点用铜棒焊接。
铜棒上钻孔接地线。
仪器电源不直接接到公共电源上,而是通过稳压隔离电源后接到另设的电源上。
仪器电源的地线和系统的信号地分开接地。
信号地接到单独埋设的地线上。
仪器电源的地线也就是三相插头的顶端那个插头很多时候不接。
震动太大:
可能原因有防震台防震效果不好,充气不足,或是实验室附近有什么强振动源;记录槽设计是否合理;液体流速是否太快?
记录系统是否稳定:
微电极放大器电容补偿是否调好,是否需要校正?
记录系统干扰和噪
HEKA的Pulse-pulsefit,不太好做单通道分析,建议使用Pclamp9,或minianalysis功能强大。
胰岛β细胞的patchclamp很难作的,主要是分离单细胞的质量很难保证。
电导、电流-电压图与直方图能用clampfit得出来,但用他不太方便,作图功能不是太强,建议使用sigmaplot
灌流装置很简单,用灌流瓶重力灌流就可,灌流瓶通过一般的一次性输液器与培养皿相连,连接管入水的部分用细的硅胶管。
流出道用同样口径的细管,然后将流出管与负压吸引装置相连,或者用蠕动泵。
如果要让DRG在盖波片上贴壁,你怎么灌流?
怎么保证细胞的活性?
如果你担心在培养皿不好贴壁,大可放心。
不过培养皿一定要干净,最好一次性的。
当然可以让DRG在玻片上贴壁,但玻片应放在加有细胞外液的皿里,方便灌流。
这样做的好处是你可以一片一片取出来做,时间可以久一些。
因为我是新手,我们实验室也才建,所以遇到一些问题只好向你们请教。
我做大大致步骤是:
1.配置人工脑脊液(ACSF):
成分:
NaCl124mmol/LKCl5mmol/LKH2PO41.2mmol/LMgSO41.3mmol/LCaCl22mmol/LNaHCO326mmol/LGlu10mmol/L用超纯水配置。
2.取大鼠,迅速断头,剪开头皮,拨开颅骨,取出大脑和小脑并置于含95%O2和5%CO2饱和的冰冷的ACSF中。
马上在浸有ACSF的滤纸上将小脑略加修剪,同琼脂一起用502胶水粘在切片槽的固定位置。
槽中放有冰冷的ACSF(小于4℃),并不断通入含95%O2和5%CO2混合气体。
用振动切片机切出小脑矢状脑片(400um),切好的脑片置于25℃下含95%O2和5%CO2饱和气体的ACSF中孵育2小时。
3.电极内充液:
将含2%膀胺天蓝的0.5mol/L的醋酸钠溶液充入微电极尖端,电阻大约在2兆。
银丝上镀有氯化银,但可能不太多了。
4.将孵育好的脑片移入灌流槽小室(设定温度在32℃左右),并用含95%O2和5%CO2混合气体的ACSF以4ml/min的流速持续灌流。
记录时,将记录微电极用微推进器推进,插入脑片,观察放电,并****声音。
我做出来一次,连续记录到了放电,而且放大器上的电压数值基本稳定在74mv左右。
但近好几次都没记录到,所以纳闷到底哪里出了问题。
麻烦你帮我看看,给我点指导。
我也问了几个人,他们都说是脑片活性的问题,但我觉得我做的已经很小心了。
多谢!
1、用的大鼠鼠龄多大?
如果是幼鼠,取脑没有什么问题。
取脑时间越短越好。
如果是成年鼠,最好用冰的acsf心脏灌流后再取脑。
不过成年鼠我也没做过。
2、取脑后在冰冻的氧饱和acsf内冻10min后再上台切片。
3、电极尖端还可以再细点,阻抗到5-10M(尖端越细,记录的电位越接近单个细胞的电位变化。
),配膀胺天蓝时记得用滤纸过滤后再使用。
银丝重新镀一层氯化银。
电生理抗干扰并不难:
其一,仪器连接要有章法。
导线不能肆意穿插。
其二,最好有共同的地线。
其三,动物接地要良好最后,电极拉制要过关。
成年鼠和幼年鼠不一样的地方是:
1、成年鼠颅骨比较硬,手术困难程度大些;
1,在做大鼠的立体定位时,在准确无误的上好耳棒的前提下,根据立体定位图谱,(Paxinos&Waston,1986),最好还是采用耳间线定位法。
尽量不要采用前囟(Bregma)法。
特别是要定位比较深层的脑核团组织。
前囟(Bregma)法不可靠!
2,乌拉坦麻醉行人工呼吸,乌拉坦应该不会对血流动力学产生显著性影响。
这里关键还是乌拉坦的剂量要合适。
建议你还是使用戊巴比妥钠,比较好。
因为乌拉坦的安全剂量较窄。
3,验证中枢位点,通用方法是,电泳。
这也就是为什么玻璃微电极要灌充膀胺天蓝的原因。
如果是成年鼠的话,要进行4度蔗糖人工脑脊液心脏灌流。
加入蔗糖是为了维持细胞渗透压并功能。
灌流时注意肝脏颜色,变白即可。
去脑后冰冻2分钟确实时间太短。
我个人觉得至少得7~8分钟。
如果时间太短,脑片内层细胞温度来不及降低,一方面细胞代谢高,另一方面切片时硬度不够,也易损害细胞。
相反,如果冰冻太久,形成冰晶,也易引起细胞死亡。
关于取脑时间:
一般要求在1min以内。
我个人认为1min15sec不致于造成太大影响。
如果取脑时间稍常的话,可以在打开部分颅骨后先在冰水ACSF中让大脑冷却几秒钟再继续。
我一般打开颅骨后的取脑过程是在冰水ACSF进行的。
不知你是不是也是这样?
灌流速度确实会影响脑片活性。
一般灌流速度在2~4ml/min.速度太慢,会导致细胞缺血缺氧,加快死亡。
如果你的实验是这个原因,应该有个时间上的关系,即随时间推移,成功率降低,或记录到放电时间缩短。
建议你再检查一下配置的ACSF的PH和渗透压。
电极溶液的离子组成必须和细胞膜所暴露的体内或培养液的离子组成相似。
因此当细胞外溶液作为浴液时主要由NaCl组成,全细胞或细胞外面向外分离膜片记录中细胞内液作为电极灌注溶液主要含有钾离子。
典型的ECS(细胞外液)和ICS(细胞内液)组成可以在表中
化学组成细胞外液(mM)细胞内液(mM)
Na+1265
K+6147
Mg2+2.51.2
Ca2+1.20
Cl-125150
GTP00.1
ATP05
HEPES1020
Glucose1111
Sucrose670
可以看到。
在试验中我们有许多类型的离子组成可以运用,但PH值和渗透压对成功的封接是非常关键的。
理论上,ECS的PH和渗透压应该和待测物来源环境一致,即培养细胞时的培养液,PH是由缓冲液来调节,在膜片钳试验中有以下几种常用的缓冲溶液:
CO2缓冲溶液,是由气体CO2和HCO3-平衡组成的。
CO2缓冲溶液的许多特性被认为是对于脊椎动物待测物的生理环境最为相似的缓冲液。
但CO2缓冲液必须需要一个装置使溶液始终暴露于CO2而不是空气。
其他缓冲液如磷酸盐或HEPES虽然被广泛运用但有报道一些间接作用。
实验的经验将决定最终使用那种缓冲溶液。
当一个细胞是从HEPES缓冲介质中生长来的,那么我们很难反对使用HEPES缓冲溶液,但对于新鲜的分离的细胞或组织切片使用CO2缓冲溶液比HEPES缓冲溶液要安全。
电极中的缓冲溶液是个难题,因为其中的气体成分是难于控制的,因为溶液暴露于空气,因此这时不能使用CO2缓冲溶液。
并且ICS通常需要运用化学手段如EGTA排除钙离子,钙离子使溶液的PH很低,并且需要高浓度的HEPES或其他缓冲溶液,同时放大了一些干扰作用。
大多数脊椎动物的的ECS的PH值大约是7.4。
在试验过程中保持PH恒定是非常重要的,因为PH的很小的变化也会影响离子通道的作用。
ICS稍稍偏酸一些大约在7.2~7.3。
1.判断地线是否接好的一个简单方法就是在开机记录状态下,观察,当取下实验用仪器,比如,放大器或刺激器上所连接的地线后,你所记录的电信号是否会发生变化,也就是说,你要仔细观察地线的”有”和”无”是否对生物电信号的记录产生明显的影响。
如果有影响,说明你所连接的地线产生了作用。
请注意,接地时要一点接地,而不要多点接地,造�?
?
大地环路。
至于,到底需不需要在实验室外面挖坑,埋特殊而专门的地线。
众说纷纭。
其实,只要你的生物记录仪器的辨差率足够大的话。
并且,你的仪器连接有章法。
那些专门的特殊的埋地式的地线以及屏蔽网都可以省去。
2.在你的实验室,必备的仪器都有了,然而,你可能忽略了一件不起眼的设备。
也许你忘记写了。
那就是外接扬声器,也就是我们平常所说的音频****器。
一个好的有经验的电生理工作者,他的敏锐之处不是在眼睛上的看,而是在耳朵里的听。
可以说,神经信号的有无一听即知。
如果你没接扬声器的话,我建议你接上一个听听。
这对你的提高很有帮助。
3.有没有稳压器,意义不大。
当然,如果你不放心的话,你可以接上一个。
我想这主要是出于保护仪器的目的。
4.对于你设置的高低频滤过参数。
不同的实验室,不同的参数。
但是,大同小异。
你的参数也是这样。
我的建议是,你在调节微调旋钮时(如果你的仪器允许这样做的话),边听,边看。
很容易找到适合你实验的最佳参数。
5.我一直都是认为电生理的记录关键是在电极的拉制上,不管是胞内记录,还是胞外记录。
都要有一个?
��适的电极。
当你在遇到记录不到生物信号的时候,多想一想你的记录电极是不是有问题。
当然,这是有一个前提的,即你的生物信号放大系统工作正常。
对于你的实验,我感觉电极阻抗不合适。
建议你提高电极阻抗,再试试。
6.神经元的放电,有自发(spontaneousresponse)和诱发(induced-response)两大类。
而对于神经元放电频率的内在特性(ISI-InterSpikeinterval)的研究,目前正是一个热点。
查查Pubmed,你就会很有收获的。
电生理实验中,记录电极所选用的材料通常有铂金丝,Ag或AgCl丝,镍铬合金,不锈钢。
这主要考虑材料的电阻和传导性。
铜丝一般情况下较少使用,但不是不可使用。
比如,制备记录肌电的同心圆电极时就可采用在针管内插入漆包线的方法。
但是对于玻璃微电极内的引导电极丝,一般都是选用Ag-AgCl丝。
玻璃微电极是我们通常选用的细胞外记录的电极。
当然,也是胞内记录和膜片钳记录的专用电极。
通常情况下,我们要考虑电极阻抗。
为什么呢,因为在电生理实验中,没有一定的输入阻抗,是记录不到合适神经元的细胞放电的。
那么这里我们要清楚是什么因素决定电极阻抗的大小。
简单的讲,对于玻璃微电极而言,电极尖端(tip)的口径大小起了决定性作用。
尖端越细,阻抗越高。
正如你所言,电极阻抗小,相应的细胞信号的采集幅度也会变小,当然也包括噪声也会变小。
但是你有没有考虑过一个情况,在玻璃微电极阻抗较小的情况下,由于尖端口径较大,你的电极灌充液在不断的渗漏(leak)。
这对细胞外记录是很危险的。
对于你的胞外记录实验,电极尖端要在1微米左右。
简单的讲,电极阻抗较低能够收集到来自更大范围的更多的生物电信号。
然而,一点需要考虑,你是在做单细胞放电记录。
如果阻抗过低的话,势必会带来一个问题,多单位怎么处理?
?
换句话讲,没有一定的电极阻抗,你是记录不到非常漂亮的单个神经元的细胞放电的(请注意,我这里使用的是单个神经元的概念)。
而对于场电位的记录,通常不需要高阻抗的电极。
在胞外单细胞记录中,你可以采用窗式幅度鉴别仪来处理(Functionsingleunitrecordingmethod)多单位的情况。
然而这不是一个好的办法去记录singleunit。
只是一个信号处理上我们通常采用的办法。
因此,较为可行的记录办法是适当提高玻璃电极阻抗,从而让记录电极只记录单个神经元的放电。
对于离子通道的进一步研究是离子通道有两个或更多的构型状态,这些构型状态是相对稳定的。
每种稳定的构型代表了不同的功能状态。
例如,每种离子通道至少有一种开放的构型状态和一种或两种关闭的构型状态。
离子通道在不同构型状态下的转换被称为门控。
相对于门控机制中离子通道的暂时的结构的变化,我们对于门控的分子机制还知之甚少。
虽然我们可以运用图形来方便地描述离子通道从开放到关闭的过程,但这个方法或许只对特定的通道是准确的。
更为常见的是,离子通道的门控包括通道构型的普遍的变化。
例如,我们从高分辨率的显微镜和图象分析器得到的证据表明间隙结合离子通道的开放和关闭包括组成离子通道的六个亚基的固有的缠绕和倾斜。
相似的证据表明骨骼肌细胞的Ach通道的激活是由组成离子通道孔道的五个亚基的协调的缠绕和弯曲完成的。
在从关闭状态到开放状态的转换过程中出现的分子重排,由于形成了较宽的孔道并且更多的极性氨基酸到达离子通道的水溶性孔道的表面。
离子通道门控有三种主要的生理模式:
离子通道的一个区域的局部的构型变化;离子通道全长的构型的普遍变化;通道入口处的阻塞粒子的进入到排出之间的转化。
因为神经细胞的主要功能是产生短暂的电信号。
三种主要的调节机制用于控制通道保持开放和激活的时间。
一些通道受化学配体的调控。
配体可以和通道直接结合,可以在细胞外的位点这时配体是递质,也可以在细胞内的位点这时是细胞质的特定成分如钙离子和核苷酸。
另外配体通过对蛋白的磷酸化对离子通道进行共价修饰能激活细胞信号的瀑布式传递。
另外一些离子通道受膜电位变化的调控。
最后一些离子通道受细胞膜的机械牵拉作用的调控。
在这些调控因素的影响下,离子通道进入下面三种功能状态:
关闭和静息状态,开放(激活),或关闭和不可激活状态。
门控的快速作用对于瞬间到瞬间的信号传导是必要的,但门控会受到细胞代谢水平的长效变化的影响。
例如在电压门控的钾通道对于细胞内的ATP水平很敏感,同时还有一些通道的门控特性随细胞内的氧化还原水平的不同而变化。
对于刺激引起通道从关闭状态向开放状态转换,这个过程是需要能量的。
在电压门控的离子通道中能量来源于通道蛋白带电部分的穿过膜电场的运动,这部分称为电压感受器。
电压感受器是有净电荷的因为感受器中有碱性氨基酸(正电荷)或酸性氨基酸(负电荷)。
带电的电压感受器的穿越电场的运动为通道开放状态和关闭状态的转换提供了能量。
在递质门控的通道中门控的能量来源于递质和通道的受体结合时所产生的能量。
对于机械门控的离子通道能量来源于细胞膜的拉伸,认为这种拉伸可以通过细胞骨架或直接通过脂质双分子层的张力的变化传递到通道。
门控通道的信号也控制着通道开放状态和关闭状态的转换的速度。
对于电压门控的通道,转换速度主要依赖于膜电位。
虽然转换的时间从几微秒到几分钟不等但大多数需要几微秒。
因此一旦通道开放将维持几微秒然后关闭,关闭维持几微秒后通道有重新开放。
一旦转换开始将自发的依次进行,因此此时再给予突然的电压上升的刺激,将会看到通过细胞膜离子通道的电流的全或无的梯形的变化。
递质门控通道和电压门控通道经过不同的过程进入离子通道不可激活状态。
配体门控通道进入离子通道的不可激活状态是由于它们对配体的长期的暴露。
这个过程被称为脱敏作用。
离子通道的脱敏的基本机制还没有完全清楚。
在一些通道中的脱敏作用是因为配体和通道相互作用的本质特征,而在另一些通道中则是由于蛋白激酶激活的通道分子的磷酸化引起的。
许多但不是全部的电压门控的离子通道能够在激活后进入不可激活状态。
这个过程被称为失活。
电压门控的钾通道和钠通道的失活被认为是通道内部构型发生改变,这种变化是由和激活控制区域分离的离子通道的亚单位或相应区域控制的。
(在细胞内运用蛋白水解酶来终止电压门控的钠通道失活而不影响通道的激活的能力。
)比较而言,电压激活的钙通道的失活需要钙离子的流入。
细胞内钙离子浓度增加会使钙通道失活,直接方式是通过和通道内的控制位点结合,或运用间接方式通过激活细胞内的相应的酶这些酶对通道蛋白磷酸化而使通道失活。
外来因素如药物和毒素,也能影响离子通道的门控位点。
大多数这些物质都是关闭通道的;只有很少的一些开放通道。
一些成分和通道的结合位点和细胞内的门控配体的正常的结合位点是一样的,因此阻止激活剂的行使相应的功能。
外来因素和通道的结合是不牢固的并且是可逆的,如箭毒封锁骨骼肌细胞膜上的烟酸Ach门控通道。
外来因素和通道的结合也有可能是牢固的并且是不可逆的,如蛇毒的а-bungaro毒素封锁骨骼肌细胞膜上的烟酸Ach门控通道。
有些外来物质是无竞争机制的,它们影响正常的门控机制却没有和配体的结合位点直接作用。
例如药物安定和GABA门控的氯离子通道的调控位点结合使得通道对GABA反应的开放时间延后。
这种间接影响不仅出现在配体门控的通道中,在电压门控和机械门控的通道中也存在。
离子通道的基因家族分类
大多数神经,肌肉细胞中的离子通道可以被分成几种基因家族。
每个基因家族的成员都有相似的氨基酸序列和跨膜结构。
每个基因家族认为都是由普通的原始基因通过基因复制和变异发展而来的。
编码配体门控的离子通道的基因能被乙酰胆碱,GABA以及甘胺酸激活属于同一家族。
这个家族中的离子通道是由五个密切的亲缘关系的亚单位组成。
每个亚单位有四个跨膜的α螺旋(M1-M4)。
配体门控的离子通道基因家族的成员的不同在于离子的选择性另外还有它们各自的配体的特性。
编码谷胺酸激活的通道的基因可以独立成为一个家族和其他的配体门控的通道区分开。
间隙结合的通道的基因编码属于一个独立的家族。
每个间隙结合点通道都是由12个相同的亚单位组成,每个亚单位有四个跨膜部分。
这种在电突触部位的特殊的通道跨越了两个细胞的细胞质。
编码电压门控型离子通道的基因都属于第三个家族。
这类通道被去机化电压激活并且对钠离子,钾离子,钙离子有选择性。
所有的电压门控的通道都有一个相似的结构。
它们都有由六个跨膜部分(S1-S6)组成的基本结构basicmotif的四次重复。
S5和S6相互连接形成环状结构,通过了细胞膜的细胞外侧面,P-区域组成了离子通道的选择性滤孔。
电压门控的钠和钙通道中每个单独的亚单位都有四个这种的重复结构。
钾通道是由四个分离的亚单位组成,每个亚单位有一个重复结构。
编码电压门控钾通道的主要的基因家族和另两类编码选择性钾通道的基因家族几乎没有关联,因为这两种基因家族有着特殊的结构和属性。
一类基因家族是由编码内向整流的钾通道的基因组成,基因在超极化时被激活。
每个通道亚单位只有两个跨膜部分,并且和形成通道孔道的P-区域相连接。
第二类编码选择性钾通道的基因家族的亚单位有两个形成孔道结构的重复。
这些通道也对静息时钾离子的传导力有贡献。
分子生物学研究的快速发展快速引发了对其他的一些离子通道基因家族的证实。
这些家族包括氯离子通道,氯离子通道对于确定神经和肌肉细胞静息电位以及确定一类由ATP激活的配体门控型离子通道(这类通道在特定的突触上有神经递质的作用)都是很重要的。
对这些离子通道的基因测序将揭示更多的通道家族。
由于通道是由许多亚单位组成,因此亚单位在结合时不同的变化就会使离子通道显示不同的功能特性,通道的种类也非常多。
在神经元中已知就有超过12种类型的离子通道,并且每种离子通道还有几种密切的亲缘关系的构型(同分异构体),它们的差别在于通道开放和关闭的速度以及对不同激活信号的敏感性。
离子通道的多样化是两种或多种有密切的亲缘关系基因的表达和mRNA从同一个基因转录后选择性地剪接或对mRNA的加工这些因素共同造成的。
和酶的同分异构体一样,离子通道类型的变化在特殊的发育阶段,在大脑中的不同的细胞类型中,甚至是同一细胞的不同的区域都有着不同的表现。
离子通道结构和功能的微妙的变化使得离子通道功能高度专一。
近年对于线虫Caenorhabditiselegans整个基因组测序工作强调了多细胞有机生物的离子通道的复杂性。
这个基因组包括编码电压门控钙通道的五个基因,编码选择性钾通道的60多个基因,编码配体门控型通道的90个基因,以及编码选择性氯通道的六个基因。
在这个基因组中没有编码电压门控型钠通道的基因。
不同细胞上的丰富的离子通道类型使得对于发展作用于神经系统选择性区域上的离子通道的激活和阻塞的药物成为可能。
这种药物理论上应该具有最大的治疗效果和最小的副作用。
因为你是刚开始做,建议你严格按步骤做,同时尽量将你的实验条件也严格化,这样有利于你在实验中寻找导致问题的关键所在。
1、水尽量用好些的,双蒸水甚至三蒸水,有去离子水更好——以排除水中的离子杂质对脑片活性的影响。
2、在称量药品时尽量精确,药品用分析纯,有条件用国外的更好。
3、有条件的话PH值和渗透压都要测一下。
渗透压有专门的渗透压仪检测,可以看看别的实验室有没有,借用一下。
4、灌流的acsf配好后就持续给混合气,不要到记录时才给。
灌流的速度可以参考相关文献,有的文献有报道。
使用别人已经比较成熟的记录槽。
5、记录系统方面,如果你的放大器是使用多年的,按说明书将放大器调试、校正到最佳状态。
但如果最近有人用这个放大器做过类似实验,而且记录很好,可以暂不调试。
当然这个最好在熟悉该仪器的技术人员指导下进行。
6、微电极不仅要测电阻,而且要在显微镜下量直径,直径要保证在1微米左右。
内液要过滤,充灌要完全。
如果你使用的是新电极,要先清洗后再使用。
如果你的记录系统没有问题,而且脑片活性很好,即使1-2M的电极,也能记到电位,不过记到的是singleunit还是fieldpotential就
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