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RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响
RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响
【关键词】RNA干扰;ERCC1基因;卵巢癌;耐药
摘要:
目的:
观察RNA干扰沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞耐药的影响。
方法:
体外合成靶向于ERCC1基因的小干扰RNA(ERCC1-siRNA),用脂质体法转染至卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP,RT-PCR方法检测转染前后细胞内ERCC1mRNA的表达,Westernblot方法检测ERCC1基因蛋白表达的改变,MTT实验检测转染前后COC1/DDP细胞对顺铂敏感性的变化。
结果:
转染ERCC1-siRNA后,COC1/DDP细胞中ERCC1基因的mRNA和蛋白表达均明显减少。
RNA干扰联合顺铂用药能明显提高COC1/DDP细胞对顺铂的敏感性。
结论:
RNA干扰ERCC1基因能明显抑制COC1/DDP细胞内ERCC1基因mRNA和蛋白的表达,增加COC1/DDP细胞对化疗药顺铂的敏感性。
关键词:
RNA干扰;ERCC1基因;卵巢癌;耐药
EffectonCytotoxicitybyRNAiERCC1GeneExpressioninOvarianCancerCelILine
Abstract:
Objective:
TostudytheeffectondrugresistancebyRNAimediatedERCC1genesilencinginovariancancercellline.Method:
SmallinterferenceRNAtargetedERCC1genewassynthesizedinvitroandwastransfectedintoCOC1/DDPcell.TheexpressionofERCC1wasdetectedbysemi-quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)andwesternblot.MTTtestwereappliedtomeasuretheinhibitioncombinedwithcisplatinofCOC1/DDPstrain.Result:
AftertransfectionofERCC1-siRNA,mRNAandproteinlevelsofERCC1geneinCOC1/DDPcellswereobviouslyreduced;ERCC1genecombinedwithcisplatinincreasesthesensitivitytochemotherapy.Conclusion:
ERCC1-siRNAcouldreducetheexpressionofERCC1geneandincreasethesensitivitytocisplatininCOC1/DDPcell.
Keywords:
RNAi;ERCC1gene;Ovariancancer;Drug-resistance
卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤,其5年生存率仅为20%~30%。
治疗的难点为卵巢癌细胞对化疗药物―尤其是一线化疗药顺铂产生耐药性,严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应。
ERCC1基因是核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER)基因家族成员之一,与卵巢癌化疗耐药密切相关[1]。
ERCC1基因表达上调是卵巢癌顺铂耐药的重要原因。
RNA干扰技术是近10年出现的一种研究基因功能和进行基因治疗的一种新方法,是外源双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)分子在mRNA水平沉默靶基因,阻断基因的表达[2]。
由于RNAi具有序列特异性和高效性,目前已成为抗肿瘤基因治疗的有效手段。
本研究根据ERCC1基因高表达于卵巢癌耐药细胞以及RNAi高效特异抑制目的基因的特点,针对ERCC1基因设计合成小干扰RNA,在脂质体的介导下转染人卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP,以RT-PCR及Westernblot方法检测RNA干扰前后细胞内ERCC1基因mRNA及蛋白表达水平的改变。
采用MTT实验检测RNA干扰ERCC1基因后卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP对顺铂敏感性的改变,以探讨逆转卵巢癌化疗耐药的新方法。
1材料与方法1材料与试剂:
卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP购自中国典型培养物保藏中心。
RNA干扰试剂盒购自美国Ambion公司。
阳离子脂质体转染试剂盒Lipofectamine2000、TrizolRNA提取试剂盒、M-MLV逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。
RPMI-1640培养基、胎牛血清购于GIBCO公司。
ERCCI鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠IgG-HRP、Actin(1~19)多克隆抗体SANTACRUZ公司。
2细胞培养:
COC1/DDP细胞常规培养于含10%胎牛血清,50U/ml青霉素,50mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中,37℃、5%CO2孵箱培养。
在培养过程中加顺铂1mg/L以维持耐药性,实验前3d停药。
3小干扰RNA的构建:
根据siRNA设计原则和GeneBank中ERCC1基因的编码序列,选择以AA开始长21nt的核苷酸序列为反义模板,与之互补链为正义模板,两者3‘端均加上T7启动子引物,序列为:
5‘CCTGTCTC3‘。
ERCC1-siRNA模板序列的两条链分别为5‘AAGGAAGAAATTTGTGATACCCCTGTCTC3‘和5‘AAGGTATCACAAATTTCTTCCCCTGTCTC3‘。
两条链经体外转录合成dsRNA。
4siRNA的转染:
细胞接种于含10%胎牛血清、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中,置37℃、5%CO2培养箱孵育,实验前无药培养3d。
取对数生长期细胞,调整细胞浓度为×105/ul,接种于24孔板中(每孔500ul),用脂质体转染试剂Lipofectamine2000,按试剂盒说明进行操作,转染ERCC1-siRNA后48h收集细胞做以下实验。
5半定量RT-PCR检测转染前后COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA的表达:
从未转染和转染48h后的细胞中提取细胞总RNA,按逆转录(RT)试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。
聚合酶链(PCR)反应,上游引物:
5‘TCGATCCCTCTGCAGTCTTT3‘,下游引物:
5‘ATTGCGCACGAACTTCAGTA3‘,扩增片段约为447bp。
PCR反应体系50ul,反应条件:
预变性94℃5min,94℃变性30s,60℃退火40s,72℃延伸40s,30个循环,末次延伸10min。
实验以GAPDH为内参照,其上游引物:
5‘TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGG3‘,下游引物:
5‘CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC3‘,扩增片段约为983bp。
具体操作过程参照说明书进行,扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳观察。
6Westernblot检测细胞内ERCC1蛋白水平的变化:
转染后48h收集细胞,蛋白上样缓冲液裂解细胞,提取总蛋白,紫外分光光度计法进行蛋白定量。
40g蛋白进行15%SDS-PAGE凝胶电泳,以蛋白电泳转移仪将产物转至NC膜上,室温封闭2h。
加入1:
100ERCC1鼠抗人单克隆抗体,4℃反应过夜,PBS洗膜,加入1:
1000羊抗鼠IgG/HRP,室温孵育2h,化学发光试剂反应5min,发光成像仪取像。
7MTT试验:
取对数生长期细胞,脂质体转染6h后,每孔细胞加入20ul不同浓度的DDP继续培养,对照组加无血清、无抗生素的培养基,每个药物浓度设3个复孔。
转染48h后,每孔加入20ul浓度为5mg/ml的MTT,4h后离心,加入DMSO100ul,震荡后置酶标仪546nm处测定吸光度值。
8统计学分析:
采用SPSS11.0forwindows统计软件处理,采用t检验。
2结果
ERCC1-siRNA的鉴定和定量:
合成的ERCC1-siRNA经12%丙烯酰胺凝胶电泳可见一条21-21bp的双链RNA条带。
将合成的siRNA稀释后测定260nm的吸光度值,提示合成的siRNA产量在40~110ug之间。
应用RT-PCR法检测RNA干扰前后COC1/DDP细胞中ERCC1基因的转录水平(图1)。
各组细胞在相对于447bp的位置均可见ERCC1基因电泳带存在,但其亮度存在明显差异,干扰组电泳带亮度明显弱于非干扰组。
图1半定量RT-PCR检测转染ERCC1-siRNA前后COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA表达
图1:
M为分子量Marker,泳道1为转染后ERCC1mRNA的表达,2为转染后ERCC1mRNA的表达,3、4为β-actin对照
转染ERCC1-siRNA后细胞中ERCC1蛋白的表达:
采用蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测COC1/DDP细胞中ERCC1基因蛋白的表达(图2),结果显示在位于36KD处出现ERCC1特异性蛋白杂交带,但转染前后条带亮度有明显差异,其中RNA干扰组细胞的蛋白条带亮度明显低于对照组。
图2Westernblot检测转染ERCC1-siRNA前后COC1/DDP细胞中ERCC1蛋白的表达
MTT实验:
转染ERCC1-siRNA后,卵巢癌细胞COC1/DDP对化疗药物顺铂的敏感性增强,IC50值在干扰前为±/ml,干扰后为±/ml;IC50值在干扰后比干扰前下降倍,两者相比差异具有显着性(P0.
05)。
3讨论
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是近年来发现的一种重要基因沉默现象,是存在于真核生物体内的一种自我保护现象,能对抗外源导入或病毒基因所表达的mRNA等外源基因的侵害,也能降解自身异常基因产生的mRNA[3]。
高效特异的阻断基因的表达是RNAi的一大特征。
在线虫、果蝇体内.RNAi能达到基因敲除的效果,在小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术也成功的阻断了基因的表达,实现了细胞水平的基因敲除[4]。
ERCC1基因是核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER)基因家族成员之一,与肿瘤化疗耐药密切相关。
多相研究表明,ERCC1基因表达上调是卵巢癌顺铂耐药的重要原因[5,6]。
因此,以ERCC1为靶基因的靶向治疗以逆转肿瘤的耐药,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性成为卵巢癌治疗的新途径。
本研究根据ERCC1基因高表达于卵巢癌耐药细胞以及RNAi高效特异抑制目的基因的特点,针对ERCC1基因mRNA设计小干扰RNA,采用体外合成的方法合成dsRNA,将其转染至卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP,用RT-PCR和Westernblot方法分别在mRNA及蛋白水平检测ERCC1基因表达,结果显示ERCC1-siRNA能有效干扰ERCC1基因的表达,阻断mRNA向蛋白质的信息传导,进而达到对目的基因的抑制作用。
结果与文献报道相一致[7]。
MTT实验显示了转染ERCC1-siRNA后,COC1/DDP细胞对顺铂的反应性明显增强,提高了化疗药物对肿瘤细胞生长的抑制作用,部分逆转了COC1/DDP细胞对顺铂的耐药。
证实了RNA干扰技术在肿瘤基因治疗领域的作用。
由于RNA干扰技术具有特异、高效抑制靶基因表达的特性,因而成为抗肿瘤基因治疗的新方法,在肿瘤基因治疗领域显示了诱人的前景。
但由于肿瘤细胞产生耐药机制具有复杂性,因此,需要进行更深入的研究以观察RNAi逆转肿瘤细胞耐药的疗效。
参考文献:
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309-316.
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- RNA 干扰 ERCC1 基因 表达 卵巢癌 细胞 耐药 影响