现代生化技术实验讲义生物08.docx

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现代生化技术实验讲义生物08

现代生化技术实验讲义（生物08）

实验一牛乳中酪蛋白的提取及其含量测定

一、实验目的

1、掌握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作；

2、掌握双缩脲法测定蛋白含量的基本原理及基本操作。

二、实验原理

酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。

它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。

它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。

酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。

酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。

在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。

常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。

本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。

其原理为：

蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在540nm波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。

三、材料与试剂

市售牛奶

10mg/ml酪蛋白标准溶液（用0.1MNaOH配制）

0.1MNaOH溶液、0.2MpH4.6的HAc－NaAc缓冲液

双缩脲试剂：

称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5g，加水100ml，加热助溶；另称取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化钾5g溶于500ml水中。

两液混匀后，在搅拌下加入10%NaOH300ml，后用水稀释至1000ml，贮存于塑料瓶中。

此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。

四、操作步骤

1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀

用量筒量取25ml牛乳置50ml烧杯中，水浴加热至40℃，在搅拌下慢慢加入到已预热至40℃的等体积的0.2MpH4.6的HAc－NaAc缓冲液中，混匀，冷却静置30min沉淀酪蛋白后，3000r/min离心15min，弃上清液，收集沉淀。

2、除杂

将上述沉淀捣碎，加入10ml95%乙醇，搅拌制成悬浮液。

将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再用10ml乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗涤沉淀两次，最后再用10ml乙醚洗涤沉淀两次，抽干。

将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开挥干乙醚后，称量（质量为m0）。

称取挥干乙醚后的酪蛋白沉淀适量（质量为m1），置烘箱中80℃干燥过夜，称重（m2）。

其余沉淀留作下步试验用。

3、酪蛋白产品纯度测定

（1）标准曲线的绘制

分别移取酪蛋白标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于干燥试管中，不足1.0ml者用0.1MNaOH溶液补足1.0ml，然后分别加入4.0ml双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度。

以酪蛋白质量（mg）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

（2）酪蛋白含量测定

称取“2步骤”中留取的沉淀适量（m3），用0.1MNaOH溶液溶解，配成10mg/ml样品溶液（体积为Vml）。

取该溶液1.0ml，加入4.0ml双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。

平行测定3次，求其平均值（m4）。

五、结果与讨论

1、牛乳中酪蛋白含量的计算

含量（g/ml）=

2、酪蛋白产品纯度的计算

酪蛋白纯度=

六、思考题

1、为什么在等电点沉淀时需加热至40℃？

2、除杂时，能否将三种溶剂的顺序颠倒？

为什么？

3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么？

实验二大蒜细胞SOD酶的提取与分离

一、实验目的

1、掌握SOD酶的提取、分离、检测等一般步骤；

2、掌握酶在提取过程中的两个重要参数：

回收率和纯化倍数。

二、实验原理

超氧化物歧化酶（SOD）是一种就有抗氧化，抗衰老，抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：

2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组合组织或者细胞破碎后，可用PH7.8的磷酸缓冲液体提取。

由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮将其沉淀析出。

邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。

邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。

颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。

三、试剂和材料

新鲜蒜瓣，市售

磷酸缓冲液：

0.05mol/L，pH7.8

氯仿一乙醇混合溶剂：

氯仿﹕无水乙醇=3﹕5（V/V）

丙酮：

用前冷却至4～10℃

0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）

10mmol/LHCl

45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）

四、实验步骤

1、组织或细胞破碎

称取5g左右大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨，使组织或细胞破碎。

2、SOD的提取

将上述破碎的组织或细胞，加入2～3倍体积（10-15ml）的0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000r/min下，离心15min，收集上清液得提取液。

留出1ml备用，剩余提取液准确量取体积后进行下步实验。

3、除杂蛋白

提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min离心15min，去杂蛋白沉淀，收集上清液得粗酶液。

留出1ml备用，剩余粗酶液准确量取体积后进行下步实验。

4、SOD的沉淀分离

将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r/min离心15min，得SOD沉淀。

将SOD沉淀溶于少量（5ml）0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液中，再加水5ml，5000r/min离心15min，收集上清液，得SOD酶液。

准确量取体积。

将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力和蛋白浓度。

5、SOD活力测定

参照李建武的《生物化学实验原理和方法》，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的酶活力。

邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用，在自氧化过程中产生有色中间物和O2-自由基，反应开始后溶液逐渐变成黄色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化O2-自由基与+H结合生成02和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率。

中间产物在325nm时有强力的光吸收，采用分光光度计即可检测。

（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：

在试管中按表1加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。

以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算邻苯三酚自氧化速率k0（直线斜率）。

表1邻苯三酚自氧化测定加样表

试剂

加样量（ml）

校零管

测定管

0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）

4.5

4.5

蒸馏水

4.4

4.4

10mmol/LHCl

0.1

——

45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）

——

0.1

总体积

9.0

9.0

（2）SOD酶活的测定：

在试管中按表2加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。

以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算加入SOD酶样品后的邻苯三酚自氧化速率k1（直线斜率）。

表2SOD酶活测定加样表

试剂

加样量（ml）

校零管

测定管

0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）

4.5

4.5

蒸馏水

4.3

4.3

10mmol/LHCl

0.1

——

待测样

0.1

0.1

45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）

——

0.1

总体积

9.0

9.0

（3）酶活力测定

酶活性单位定义为：

在lml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。

按下式计算样品中SOD酶单位活力：

单位体积活力（U/ml）=

总活力（U）=

式中：

反应液总体积=9ml；样品液稀释倍数=1；加入样品液体积=0.1ml；活性单位定义体积=1ml；样品液总体积=实验中各样品实测体积。

6、样品中可溶性蛋白含量的测定

从1ml备用的提取液、粗酶液、酶液中分别取0.2ml、0.4ml、0.5ml，按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍进行稀释，分别测定稀释液在260nm和280nm波长处的吸光值，按下式计算可溶性蛋白的含量：

蛋白质浓度（mg/ml）=（1.45A280–0.74A260）×稀释倍数

总蛋白（mg）=蛋白质浓度×样品液总体积

五、结果与讨论

将试验结果及相应的计算结果填入下表：

体积

（ml）

单位活力

（U/ml）

总活力

（U）

蛋白浓度

（mg/ml）

总蛋白

（mg）

比活力

（U/mg）

回收率

（%）

纯化倍数

提取液

100

1

粗酶液

酶液

相关计算公式：

比活力U/mg=

；纯化倍数=

；回收率=

六、思考题

1、在SOD酶提取步骤中应注意的关键问题是什么？

2、综合评价蛋白或酶的提取分离流程优劣的指标有哪些？

实验三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量

一、实验目的

1、学习SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的原理；

2、掌握垂直板电泳的操作方法；

3、运用SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。

二、实验原理

十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate,简称SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在实验基础上发展起来的一项新技术。

用这种方法测定蛋白质的分子量具有快速灵便，设备简单等优点。

蛋白质的电泳迁移率在一般的电泳方法中，主要取决于它在某pH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性，而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对大多数蛋白质，主要取决于它们的分子量，与原有的电荷量和形状无关。

SDS是一种阴离子表面活性剂，在一定的条件下，它能打开蛋白质氢键和疏水键，并按比例地结合到这些蛋白质分子上形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。

SDS与蛋白质的定比结合使蛋白质-SDS复合物均带上相同的负电荷，其量远远超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了蛋白质间原有的电荷差异。

在水溶液中，蛋白质-SDS复合物具有相同的构象，近似雪茄烟形的长椭园棒，克服了蛋白质间原有的形状差异。

这样蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。

蛋白质分子量与电泳迁移率间的关系可用下式表示：

lgMr=K–bm

式中 Mr为分子量；K为常数；b为斜率；m为迁移率。

因此，用本法测定蛋白质的分子量只需根据待测蛋白质在已知分子量的标准蛋白质的lgMr～迁移率的图中的位置，就能得知分子量。

三、试剂与材料

30％丙烯酰胺贮存液：

称取丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后装于棕色瓶，于4℃冰箱保存备用（可用1-2月）。

N,N,N,N－四甲基乙二胺（TEMED）。

10％过硫酸铵溶液，当天配制。

SDS－分离胶缓冲液：

1.5mol/LTris－HCl，pH8.8，加0.4％SDS。

SDS－浓缩胶缓冲液：

0.5mol/LTris－HCl，pH6.8，加0.4％SDS。

SDS－样品缓冲液：

10％（W/V）甘油，5％巯基乙醇，0.05％溴酚蓝，2.3％（W/V）SDS和0.0625mol/LTris－HCl，pH6.8。

SDS－电极缓冲液：

0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，0.1％SDS，pH8.3。

染色液：

称取2.5g考马斯亮蓝R-250，加入910ml50%乙醇和90ml冰醋酸。

脱色液：

50ml乙醇、75ml冰醋酸和875ml水混合。

蛋白质样品液。

低分子量标准蛋白质系列：

包括牛血清蛋白，相对分子质量66000；卵清蛋白，相对分子质量45000；胰凝乳蛋白酶原，相对分子质量25000；溶菌酶，相对分子质量14300。

电泳凝胶模玻璃板、垂直板型电泳槽、直流稳压电源、微量注射器。

四、实验步骤

1、分离胶的制备

将玻璃板洗净、干燥后装置成凝胶模，保证其不漏水。

若漏水，则需将玻璃用无水酒精擦拭干净后，重新装置凝胶模。

按下列比例配制12％的分离胶：

SDS－分离胶缓冲液5.0ml，30％丙烯酰胺贮存液8.0ml，10％过硫酸铵溶液200μl，加水6.8ml。

混匀，抽气后，加入TEMED8μl，迅速混匀后倒入两块玻璃板之间（加至距离短板上沿约1.5-2cm），用尖头滴管加入一层水覆盖，让其聚合30～60min。

分离胶高度约占玻璃板高度的三分之二左右。

2、浓缩胶的制备

分离胶聚合好后，用滤纸条吸干水层。

按下列比例配制5％浓缩胶：

SDS－浓缩胶缓冲液1.5ml，30％丙烯酰胺贮存液1.0ml，10％过硫酸铵溶液60μl，加水3.4ml。

混匀，加入TEMED6μl，迅速混匀后，倒在分离胶上层，并插入样品槽模板，加入一层水覆盖，聚合30min。

聚合后，小心取出样品槽模板，形成相互间开的样品槽，用滤纸条除去水分。

将制备好的凝胶平板装进垂直平板电泳槽。

将电泳槽的上下槽加满电泳缓冲液。

3、加样品

取样品液1ml，与等体积的SDS－样品缓冲液混合后，置沸水浴中加热3-5min，冷却后备用。

另取低分子量蛋白标准系列50μl置沸水浴中加热3-5min，冷却后备用。

低分子量蛋白标准系列组成及其分子量为：

β-galactosidase（E.coli）116.0,Bovineserumalbumin（bovineplasma）66.2,Ovalbumin（chickeneggwhite）45.0,Lactatedehydrogenase（porcinemuscle）35.0.REaseBsp981（E.coli）25.0,β-lactoglobulin（bovinemilk）18.4,Lysozyme（chickeneggwhite）14.4。

用微量注射器将上述溶液加入到同一凝胶平板的不同样品槽中，标准蛋白系列加样量分别为10、15、20µl；蛋白样品液加样量分别为10、15、20µl。

记好加样顺序。

4、电泳

负极在上正极在下将电极接好，接通电源，开始电泳。

采用恒压法，开始时用80-100V，当样品进入分离胶后改用150V进行电泳，直至指示染料到达凝胶底部边缘约1cm时停止电泳。

5、染色和脱色

电泳结束后，取出凝胶平板，移去玻璃板，将凝胶切去一角后（以标记样品顺序）浸泡于染色液中，置摇床中染色1-2h。

染色完毕，倒出染色液，换用脱色液，置摇床中进行脱色，期间更换脱色液几次，直至无蛋白处无色为止。

6、迁移距离的测量

脱色完毕，拍照。

并用直尺量出标准蛋白质、样品蛋白和指示染料的迁移距离。

五、结果与讨论

比较样品蛋白质和标准蛋白质的电泳结果，按下式计算相对迁移距离：

相对迁移距离＝

以标准蛋白质相对分子质量的对数（lgMW）为纵坐标，相对迁移距离为横坐标作图，得到标准曲线。

然后根据样品蛋白质分子的相对迁移距离，从标准曲线上查出其相对分子质量。

六、思考题

1、在不连续体系SDS-PAGE中，当分离胶加完后，需在其上加一层水，为什么?

2、样品溶解液中各种试剂的作用是什么?

3、在不连续体系SDS-PAGE中，分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP，试述其作用?