脂肪细胞脂质代谢对肝细胞营养感应信号的影响机制论文毕业论文.docx

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脂肪细胞脂质代谢对肝细胞营养感应信号的影响机制论文毕业论文

脂肪细胞脂质代谢异常及其对肝细胞营养感应信号的影响和机制

一、立项依据（项目所面向的我国经济、社会、国家安全和科学技术自身发展的重大需求，项目研究的科学意义，对解决国家重大需求问题的预期贡献等）

近20年来我国高脂血症或脂质代谢异常发生率明显升高，伴随的人群心血管疾病发生率也显著增加。

高脂血症主要是指胆固醇和（或）甘油三酯升高，脂质代谢异常还包括高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）降低。

高脂血症发生的原因诸多，对机体所产生损害的作用机制也非常复杂。

目前认为，脂肪和肝脏是高脂血症和脂质代谢紊乱发生密切相关的组织。

所以，脂肪细胞脂质代谢异常及病理性脂肪因子分泌增多，必然会对肝细胞内营养感应信号产生重要的作用，这也是当前研究的热点。

而脂肪细胞是如何影响肝脏的脂质代谢，也将是未来几年的研究方向和重点，这些研究可为探索高脂血症的发病机制及防治措施提供新的思路。

二、国内外研究现状和发展趋势（国际最新研究进展和发展趋势，国内研究现状和水平，在相关研究领域取得突破的机遇等）

目前认为，脂肪组织已不仅是能量储存器官，还具有分泌瘦素、脂联素、抵抗素等脂肪因子，调节糖、脂代谢等功能。

但是，在肥胖状态下，脂肪细胞可发生功能失调，主要表现为胰岛素抵抗，分泌功能紊乱和病理性脂肪因子分泌增多[1,2]。

然而，有关脂肪细胞功能失调的原因及其机制尚待深入探讨。

虽然，我们对脂肪细胞的能量代谢有较为深入地了解，但对脂肪细胞参与胆固醇的代谢过程及机制却知之不多。

有研究表明，胆固醇稳态对于维持脂肪细胞正常的生理功能具有重要意义。

脂肪细胞肥大，胰岛素抵抗，分泌功能紊乱，胆固醇稳态失衡可能是其中的关键机制[3]。

脂肪细胞内胆固醇稳态失衡主要表现为胞内胆固醇聚集，而细胞膜胆固醇含量降低。

有研究表明，细胞内胆固醇失稳态可能是脂肪细胞功能异常的关键所在：

用环糊精介导脂肪细胞膜胆固醇流出，模拟肥大脂肪细胞胞膜胆固醇相对减少状态，可导致细胞表现出胰岛素抵抗，分泌功能异常[4]；反之，纠正细胞胆固醇失衡，则可一定程度改善脂肪细胞的功能[5]。

但是，目前，胆固醇失稳态致细胞功能异常的机制尚不明确。

内质网应激是一种重要的细胞应激反应，过强或过长时间的激活会影响细胞的代谢及功能。

内质网是细胞内进行蛋白合成、修饰、折叠和亚基组合的重要场所，蛋白是否被折叠成正确构像有赖于内质网的功能。

当不利因素干扰内质网的功能时，未折叠或错误折叠蛋白在内质网聚集，引起非折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse,UPR），即促发内质网应激[6]。

游离胆固醇具有显著的细胞毒性，有研究发现，在胆固醇过度负荷的巨噬细胞，随着胆固醇转运至内质网，巨噬细胞则出现明显的内质网应激[7]。

近期已有研究证实肥胖小鼠脂肪细胞内存在增强的内质网应激，并与其胰岛素抵抗有关[8,9]。

对其他类型细胞的研究发现，内质网应激能诱导内皮细胞及巨噬细胞表达分泌IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子；与此同时，在炎症因子表达分泌的调节中发挥重要作用的IKK/NF-κB通路在发生内质网应激反应时可被激活[10]。

因此，基于以上证据，我们推测：

脂肪细胞内胆固醇过度负荷，过多的胆固醇转移至内质网，触发细胞内质网应激，继而导致细胞分泌功能异常，而其中IKK/NF-κB通路可能在其中起介导作用。

脂肪因子的影响包括全身（内分泌）和局部作用（旁分泌）。

近来研究提示，内脏周围的脂肪积聚可对其临近的器官产生损害，例如，心脏、血管及肾脏的周围脂肪组织堆积能增加相应器官的损害并增加心血管病的危险[11]，提示脂肪组织的作用与其旁分泌效应密切相关。

而肝脏紧邻腹部脂肪，所以腹型肥胖对肝脏的影响可能与脂肪细胞旁分泌有关。

临床中也观察到，腹型肥胖特别是合并脂肪肝的患者血清HDL-C水平降低及TG升高更突出，因此，肥胖时，脂肪细胞分泌功能紊乱，分泌增多的病理性脂肪因子对肝细胞HDL及TG代谢可产生影响。

肝脏是HDL代谢的关键器官，其代谢过程包括两大方面：

首先，肝脏合成ApoAI并在ATP结合盒转运体A1（ABCA1）作用下使ApoAI脂化形成HDL，ABCA1介导的ApoAI向HDL转化可发生在肝脏及肝脏外组织，但研究证实，选择性敲除肝脏ABCA1可使HDL-C下降80%以上[12]，提示肝脏ABCA1（而不是肝外组织ABCA1）是决定体内HDL-C水平的关键。

另外，肝脏还通过高密度脂蛋白受体（B类I型清道夫受体）SR-BI摄取循环HDL中的胆固醇，促进HDL中的胆固醇向胆汁及肠道排泄。

以上两方面作用均有利于外周组织的胆固醇向体外排泄，即所谓的“胆固醇逆转运”，这也是HDL抗动脉粥样硬化的首要机制。

最近，我们通过比较正常及饮食诱导的肥胖小鼠体内胆固醇逆转运功能，结果发现在注射荷载3H-标记胆固醇的巨噬细胞后，与对照小鼠比较，肥胖小鼠血清及粪便3H-胆固醇放射活性在不同时间点均有降低，表示肥胖小鼠体内胆固醇逆转运下降。

同时，48小时粪便3H-胆固醇放射活性在两组的差异大于48小时血清3H-胆固醇放射活性在两组的差异，说明肥胖小鼠从血清到粪便的胆固醇转运受损更加严重，提示肥胖对肝脏参与的胆固醇逆转运影响更突出。

而肥胖状态下，脂肪细胞是通过何种脂肪因子，如何影响肝脏HDL代谢尚不清楚。

Wueest等人的研究发现，选择性敲除脂肪组织中的凋亡信号通路Ras基因，能减少高脂饮食诱导的细胞因子（如IL-6）升高，更重要的是显著减轻脂肪肝和明显增加肝脏对胰岛素的敏感性[13]，提示高脂饮食导致的脂肪细胞凋亡通路激活是体内炎症反应和肝脏胰岛素抵抗的关键因素之一。

无独有偶，另外一项近期发表在Science的研究也证实，选择性敲除脂肪组织中的应激信号通路JNK1基因，能阻断高脂饮食诱导的脂肪组织炎症反应（IL-6升高）和肝脏的胰岛素抵抗[14]，提示肝脏是脂肪组织作用的主要靶点，支持脂肪细胞与肝细胞之间存在交互作用，而IL-6是重要的介导之一。

综上所述，我们推测：

肥胖状态下，脂肪细胞可通过旁分泌脂肪因子影响肝脏HDL代谢相关蛋白的表达和对HDL胆固醇的摄取，从而影响胆固醇逆转运。

除HDL代谢外，肝脏也是TG代谢的主要场所之一。

肥胖状态下，过多的TG沉积在肝脏，致脂肪肝形成，但其分子机制尚不完全清楚。

近年来研究发现，DNA断裂因子相似蛋白（CIDE）家族是机体能量平衡及脂质代谢的重要调节因子，与代谢综合征、肥胖及脂肪肝等脂类代谢相关疾病密切相关[15]。

CIDE家族包括三个成员：

CIDE-A、CIDE-B和CIDE-C。

研究显示，敲除了CIDE-A、CIDE-B、FSP27的动物都表现出了能量释放增多，且能够抵抗饮食导致的肥胖、IR及肝脂肪变性[16]。

CIDE家族定位于内质网、脂滴和线粒体，参与甘油三酯的储存、水解以及分泌等代谢过程。

在生理情况下，肝脏主要表达CIDE-B，然而发生肝脂肪变性时，CIDE-A和CIDE-C的表达则上调。

在肝细胞中，CIDE-B基因敲除后，固醇调节元件结合蛋白（SREBP1c）的表达明显下降，同时影响该蛋白下游的多种酶类的活性，从而增强线粒体β氧化，降低了脂肪的合成[16]。

此外，CIDE-B敲除鼠分泌VLDL-TG水平减少[17]。

同样，CIDE-A或CIDE-C基因敲除可增强肝细胞的β氧化，增加胰岛素的敏感性[16,18]。

目前关于CIDE蛋白的上游调节因子的研究很有限。

有研究表明，PPAR-γ可上调CIDE-A和CIDE-C的表达[19,20]，而正常的肝细胞仅表达低水平的PPAR-γ，当其发生脂肪化时，PPAR-γ水平则显著上调。

因此，除影响HDL代谢外，脂肪因子作用于肝细胞后，使肝细胞的PPAR-γ表达上调，从而升高CIDE的表达，进而通过影响其下游的信号通路促进肝细胞脂质合成、降低β氧化和胰岛素敏感性，最终导致脂肪肝。

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三、拟解决的关键科学问题和主要研究内容（详细阐述围绕国家重大需求所要解决的关键科学问题的内涵。

主要研究内容要围绕关键科学问题，系统、有机地形成一个整体来详细阐述，重点要突出，避免分散或拼盘现象）

（1）脂肪细胞内胆固醇失衡机制探讨：

1培养成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞（3T3-L1细胞促分化至21天），检测其对胆固醇的摄取和流出能力；与摄取和流出有关的蛋白表达。

2构建腺病毒载体，分别沉默SREBP2和LXR，探讨SREBP2在脂肪细胞胆固醇代谢失衡中的体制。

（2）内质网应激介导胆固醇负荷所致脂肪细胞分泌功能异常：

培养成熟脂肪细胞，观察胆固醇过负荷对内质网应激和脂肪因子表达分泌的影响，探讨其机制；建立肥胖小鼠模型，在体观察脂肪细胞胆固醇负荷、内质网应激与脂肪因子分泌变化之间的联系。

（3）脂肪因子影响肝脏HDL代谢：

用脂肪细胞与肝细胞共培养模型和基质胶皮下种植/回收技术，分别观察不同状态的脂肪细胞及脂肪组织对肝细胞HDL代谢的影响及分子机制，并探讨脂肪细胞因子及其调节通路在介导脂肪细胞和肝细胞相互作用中的价值。

最后通过不同模型肥胖小鼠观察肥胖对肝脏HDL代谢的影响并探索体内注射脂肪细胞炎症因子拮抗剂干预的作用。

（4）炎性脂肪因子影响肝脏TG代谢：

观察肝细胞与脂肪细胞共培养对肝细胞脂质蓄积的影响，探讨脂肪细胞对肝细胞CIDE表达的影响及相关通路和分子机制。

四、总体目标、五年预期目标（总体目标和五年预期目标应从对解决国家重大需求的预期贡献，在理论、方法、技术等方面预期取得的进展、突破及其科学价值，优秀人才培养等方面分别论述。

五年预期目标要求有较为具体的量化考核指标。

）

本课题为临床基础研究，其成果将进一步阐明肥胖状态下脂肪细胞代谢失衡及分泌功能异常的机制，揭示肥胖时肝细胞HDL和TG代谢异常的分子机制，明确CIDE家族在调控肝细胞脂质代谢中的作用，并证实其相关作用通路。

为探讨代谢综合征及脂肪肝等疾病的发病机制及防治策略提供新的思路。

同时，本项目的开展有利于学科的建设和人才的培养，预计可完成有价值的论文8篇，培养博士研究生5名，硕士研究生7名。

五、总体研究方案（结合主要研究内容阐述学术思路、技术途径、与国内外同类研究相比的创新点与特色、取得重大突破的可行性分析等。

）

本课题拟探讨肥胖状态下脂肪细胞分泌功能紊乱的机制，并以脂肪细胞和肝细胞相互作用为切入点，通过体外共培养及体内基质胶种植技术，研究肥胖时肝细胞HDL和TG代谢异常的分子机制。

主要技术路线如下：

第一部分肥大脂肪细胞胆固醇代谢失衡机制探讨

（1）肥大脂肪细胞胆固醇代谢率的改变

①成熟脂肪细胞诱导分化：

选择小鼠3T3Ll前体脂肪细胞，采用经典的激素鸡尾酒方法诱导分化至成熟脂肪细胞。

具体方法为：

将3T3Ll置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，待细胞生长至完全融合后48h开始诱导分化。

将原培养液换成含115ng/ml3-异丁基1-甲基黄磦呤（IBMX）、1μmol地塞米松和10μg/ml胰岛素的完全培养液。

细胞孵育48h后，撤去IBMX和地塞米松，使培养液中只含有胰岛素10μg/ml。

再孵育48h后，撤去胰岛素，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液培养细胞，每48h换液一次，直到95%的细胞都为成熟的脂肪细胞。

诱导分化时间约1周。

②肥大脂肪细胞诱导分化：

脂肪细胞促分化至第21天，即为肥大脂肪细胞。

（方法参考：

ArteriosclerThrombVascBiol.2005;25:

2062-8.）

③两种脂肪细胞的胆固醇代谢率比较（胆固醇代谢实验）：

1）按

（1）、

（2）所述方法，将3T3Ll前体脂肪细胞分别诱导分化为成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞。

2）用含ac-LDL50mg/L的10%LPDS-DMEM诱导48h后，加入0.5μCi/ml[3H]标记的胆固醇（[3H]-胆固醇）7.4×107Bq/L继续孵育24h，收集培养液并离心，γ射线计数仪测定放射活性，即为培养液的[3H]-胆固醇放射活性，计算细胞胆固醇流出率，为培养液的[3H]-胆固醇放射活性占总放射活性的百分比。

3）PBS漂洗细胞，0.1mol/LNaOH1ml反复冻融3次裂解细胞，收集溶解后的细胞用γ射线计数仪测定放射活性，即为细胞所摄取的胆固醇的量，该值所占总放射活性的百分比，为细胞胆固醇摄取率。

4）比较两组细胞的细胞胆固醇流出率和摄取率，可知两种脂肪细胞的胆固醇代谢率差异。

5）比较两组细胞的胆固醇代谢相关因子表达差异：

按照步骤3）裂解细胞，抽提细胞RNA及其蛋白，分别通过RT-PCR和WesternBlotting，测定细胞中胆固醇摄取相关因子（如LDLR1、LDL受体相关蛋白、小窝蛋白caveolin、PPARα、PPARγ）和胆固醇流出相关因子（如ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα）的基因和蛋白表达水平，以明确两种脂肪细胞的胆固醇代谢差异的机制（图1）。

3T3Ll前体脂肪细胞

三

周

一

周

诱导分化

比较两组细胞的胆固醇代谢相关信号表达差异

比较两组细胞的胆固醇代谢率差异

肥大脂肪细胞

成熟脂肪细胞

胆固醇代谢实验

图1

（2）肥大脂肪细胞胆固醇失衡的分子机制探讨

1）利用siRNA技术，分别构建LXR和SREBP2的siRNA腺病毒载体，分别转染人成熟脂肪细胞和肥大脂肪细胞中；不同时间点检测LXR和SREBP2的表达，明确基因沉默效果；

2）合适的时间点（根据上一步确定的时间点）检测脂肪细胞内胆固醇的代谢率以及胆固醇代谢相关因子表达，以明确LXR和SREBP2在脂肪细胞胆固醇代谢失衡中的作用。

第二部分胆固醇负荷对脂肪细胞内质网应激和内分泌功能的影响及机制探讨

（1）胆固醇过负荷对脂肪细胞内质网应激及分泌功能的影响及其机制

1）在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞；

2）培养3T3-L1前体脂肪细胞，促分化为成熟的脂肪细胞；

3）用Ac-LDL及ACAT抑制剂处理脂肪细胞，使之为胆固醇过负荷的脂肪细胞；

4）在Ac-LDL及ACAT抑制剂的基础上应用U18666A，抑制胆固醇向内质网转运；

5）干预结束后用测定脂肪细胞胆固醇含量，分离内质网并测定内质网胆固醇含量；WesternBlot法检测脂肪细胞GRP78/Bip、XBP-1及磷酸化PERK与eIF2α的蛋白水平，评价是否诱导产生内质网应激；用定量RT-PCR法检测各种脂肪因子的mRNA表达，用ELISA法测定上清液脂肪因子的分泌；检测脂肪细胞IKK/NF-κB通路活性，包括用WesternBlot法测定胞浆蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白NF-κB表达水平，并用EMSA法测定NF-κB活性（图2）