遗传学实验教程.docx
- 文档编号:24794521
- 上传时间:2023-06-01
- 格式:DOCX
- 页数:147
- 大小:344.82KB
遗传学实验教程.docx
《遗传学实验教程.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《遗传学实验教程.docx(147页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
遗传学实验教程
遗传学实验教程
主编徐振平
副主编范雪辉陈伟
王树芳杨述芳
新乡医学院生命科学技术系
1
5
人类性染色质标本制备技术
9
12
22
Feulgen31
--
33
35
38
-
40
41
43
实验一人类染色体标本制备
人体内任何旺盛有丝分裂的细胞或者在体外适当培养下能旺盛分裂的组织细胞群,均可作为细胞遗传学研究的材料,用于制备染色体标本。
常用的材料有外周血淋巴细胞、骨髓细胞、羊水细胞、绒毛细胞、胸腹水细胞、性腺活检组织、精子、实体瘤组织,以及皮肤、肝和肾等组织。
这些材料按下述方法进行处理后,都可作为研究人类染色体的材料,用于染色体病的诊断和产前诊断等。
【实验目的】
了解和掌握外周血细胞培养试剂的配制和消毒方法;学习、掌握培养细胞的染色体制备的一般方法,掌握人类染色体的一般形态结构。
【实验器材和试剂】
1.仪器设备
超净工作台、带有照相装置的光学显微镜、隔水式恒温培养箱或
CO2培养箱、恒温水
浴箱、电热干燥箱、离心机、冰箱、分析天平
(1/10000)或电子天平、普通天平、高压蒸气灭菌锅、
小型真空泵、电吹风、
pH计、定时钟、秒表。
2.器材
G6型玻璃漏斗(细菌滤器)、蒸馏水瓶、蒸馏水器、
10ml
刻度离心管、
10ml
培养瓶(或
青霉素小瓶、带瓶塞)、2ml注射器、吸管、滴管、烧杯、量筒、锥形瓶、试管架、三角烧瓶、染色缸、
酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷盘、铝制饭盒、酒精棉球、碘酒棉球以及
包布等。
3.试剂
RPMI-1640
培养液(含
10%~
20%小牛血清)、NaHCO3、PHA、青霉素、链霉素、肝素溶液、
秋水仙素或秋水仙胺、
1mol/LHCl、双蒸水(
ddH2O)、0.075mol/LKCl、甲醇、冰醋酸、
Giemsa染液液、
pH6.8的PBS。
【实验内容与方法】
外周血的淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,
它们都处于间期的G0或G1期,故在未经培养的外周血
中很难见到正在分裂的淋巴细胞。
1960年Nowell
发现从芸豆(phaseolusvulgaris
)中提取的能使红
细胞凝集的物质——植物血球凝集素(
phytohemgglutinin,PHA)可以刺激淋巴细胞,使其转化为幼稚
的原始细胞样(blastlike)的细胞淋巴母细胞而具有重新分裂的能力。
以外周血为材料制备淋巴细胞
染色体标本由于具有取材方便、用血量少(
0.3~1.0ml)及容易培养、培养时间短即可得到大量有丝分
裂相等优点,故该方法在国内外的有关实验室中以及临床上被广泛应用,细胞遗传学领域中几乎
90%以
上的研究取材于外周血。
按容器是否密闭,培养方法可分两种:
一种是使用二氧化碳培养箱,培养容器
不需密闭,用循环的5%的CO2调节培养基的pH;另一种是使用普通的恒温箱,
培养瓶口要密封或用瓶塞
塞紧。
后一种在一般实验室内即可做到。
此外,按培养的血量或淋巴细胞数目,可分标准法、半微量或
微量全血法(wholebloodmicroculture
)两种。
微量全血方法采血量少,尤其在对小儿、新生儿的研究中更为适用。
在需要大量染色体标本(如进
行G、Q显带的研究)以及需要积累大量有丝分裂细胞,尤其是早期分裂细胞(如高分辨染色体的研究)时,标准培养法仍然适用。
淋巴细胞在体外培养至72小时左右时,大多数细胞已处于第二次增殖周期内,在收获细胞前加入
一定量的秋水仙素或秋水仙胺将细胞阻止于有丝分裂中期,可导致积累大量含有可见的中期染色体的细
胞,然后将细胞悬液离心、低渗和固定处理,最后将细胞悬液滴于湿冷清洁的玻片上。
空气中自然干燥
即得可供分析的中期染色体标本。
从染色体标本中不仅能精确计数染色体的数目,而且能用来检验个别
染色体畸变(变异)。
近年来,由于各种显带技术与高分辨染色体技术的问世与不断改进,使淋巴细胞
培养已成为遗传学研究中的一种常用方法。
一人外周血淋巴细胞培养
以半微量全血法为例,有关器械的清洗和消毒、细胞培养用液的配制及消毒见附录。
1.采血用一次性2ml注射器抽取肝素稀释液0.2ml,湿润针管,然后将多余的肝素排除。
以碘酒
及酒精清洗并消毒供血者肘部皮肤,用橡皮管结扎静脉回流的上端,将肝素预先润湿的注射器刺入肘部
静脉,抽取静脉血0.5~2ml,然后转动针管,使血液和肝素混合。
2.接种和培养在无菌室内的超净工作台上,或用酒精消毒培养瓶的翻口瓶塞后插入针头,将抽
得的抗凝血迅速接种到5ml含适量PHA(约0.2ml)及小牛血清的培养瓶中,每瓶接种全血0.4ml左右
(6号针头15~20滴),轻轻摇匀,置37℃培养箱中培养,根据研究需要与具体情况(如各实验室条件、
试剂的影响等)可培养
48~72
小时,一般有丝分裂的高峰多在培养
60~72小时之间。
标准培养法由于用血量大,
不易为受检者接受。
一般的程序是:
取静脉血5~10ml,室温下静置
1~
2小时,或低速离心(
400~500r/min)数分钟。
此时可见血浆及介于血浆与红细胞层之间的白细胞层,
将血浆及白细胞层吸出混匀,以
0.6~0.8ml
接种到已配制的混合培养液
5ml中,剩余的红细胞层仍可
按上述全血法进行培养。
3.积累中期细胞
在终止培养前4~6小时,用1ml注射器(装
5号针头)加入浓度为5μg/ml
的
秋水仙素2滴,使培养液中的秋水仙素终浓度为
0.05μg/ml。
轻轻摇匀,放回培养箱中继续培养至
72
小时。
加入秋水仙素的目的在于抑制纺锤丝的形成,使细胞分裂停止在中期。
以下步骤则不需无菌操作。
二染色体标本的制备
1.收获细胞
取出培养瓶,将培养液摇匀后倾入
10ml
刻度离心管中,在粗天平上配平后放入离心
机,以
1000r/min
离心
8~10min,吸弃上清液,保留细胞悬液约
0.5ml
。
2.低渗处理
往离心管中加入
8ml已温浴达
37℃的
0.075mol/LKCl
溶液,用吸管混匀,置
37℃
恒温水浴箱中低渗
15~25min(精确的低渗时间可自行摸索)
。
3.预固定
低渗处理完成后,加入
1ml新配制的固定液(甲醇∶冰醋酸为
3∶1)并用吸管混匀,
平衡后放入离心机,以
1000r/min
离心
8~10min。
吸弃上清液。
4.固定
加入
6ml
固定液,用吸管将沉淀的细胞轻轻混合成细胞悬液,室温下静置
20min
后,1
000r/min
离心
8~10min。
吸弃上清液。
5.再固定
加入
4ml
固定液,用吸管轻轻吹打使细胞混匀,室温下静止
15min
或更长时间。
(如由
于某种原因,不能立即制片时,可将离心管口盖好,置冰箱中过夜或更长时间)
。
6.制片
将上述细胞混悬液离心(
1000r/min
,8min),吸弃上清液,视离心管中沉淀(细胞)的
多少加入
0.2~0.4ml
左右的固定液,用吸管轻轻混成细胞悬液(混合后的液体呈淡乳白色即表示细胞
浓度适当)。
用吸管吸取细胞悬液以
20~35cm高的距离滴于清洁预冷的玻片上,每片滴
2~3
滴,滴完
后立即对准玻片吹气以助细胞的分散,并立即将玻片放在酒精灯火焰上来回过几下(勿烤干),静置并
空气中晾干。
最好先滴片一张,置高倍镜下观察,如染色体分散良好,即可制片,如分散不好,可按上
述方法再次固定。
必要时可采用甲醇∶冰醋酸(1∶1)固定液进行固定,将会获得满意的染色体标本。
7.染色若所制备的标本用于染色体的非显带分析,则将晾干的玻片标本用
Giemsa染液(以
1份
Giemsa原液加9份pH6.8的PBS液混合而成)染色5~10min。
然后在自来水管下用细水流自玻片一端
轻轻冲洗,晾干或吹干后镜检。
8.观察将制片置于低倍镜下观察,选择染色体分散好,无胞浆背景的中期分裂相(图
1-1),然
后换高倍镜、油镜观察染色体形态,在镜下初步计数。
图1-1显微镜下的人类非显带中期染色体
三外周血淋巴细胞短期培养及制备染色体标本注意事项
外周血淋巴细胞短期培养及制备染色体标本并不困难,但如操作不严或试剂质量不好则可能使培养
结果及标本制作不佳或失败。
1.防止污染是培养成功与否的先决条件,收获前的所有操作过程应保持高度无菌,严防细菌和病
毒污染。
2.培养箱的温度应严格控制在37±0.5℃,为能精确有效地控温,在普通的隔水式恒温培养箱上可
加装一个电子控温仪。
3.培养基的pH值应调整到7.2~7.4之间,偏酸时细胞发育不良,偏碱时细胞会出现轻度固缩。
4.在采血或接种时,注意不要使用太多的肝素,因肝素过多会抑制淋巴细胞的转化,但也不宜太
少,否则易出现凝血现象。
如果培养物中出现膜状凝块,可轻摇培养瓶使凝块散开。
5.注意培养过程中盖紧培养瓶口(开放式培养除外),以免培养液的pH值发生较大变化。
如果培
养液变黄,说明偏酸,此时可加入无菌的2%NaHCO3溶液或另加入2~3ml培养液进行调整。
6.PHA的质量好坏直接关系到人体淋巴细胞培养的成败,市售的PHA由于厂家、出厂时间、批号不
同而有差异,精确的用量应自行摸索。
一般使用量为每毫升培养液200~300μg(市售10mg安瓿瓶PHA
用2ml生理盐水稀释,每瓶培养物加0.2~0.3ml)。
PHA的量也不宜过大,否则会导致红细胞凝集。
7.所用的玻璃器皿及其它用品都要清洗干净,各种试剂尽量选用分析纯级。
8.配制培养液等溶液所用双蒸水宜用玻璃蒸馏器制备。
9.离心机最好用水平式的,速度宜用1000r/min,如速度太高,沉降在管底的细胞团不易打散;
速度太低,分裂相易丢失。
如果低渗后离心速度过高,则会使分裂细胞过早破裂,在最后制成的标本中,
完整的分裂相过少。
10.秋水仙素的使用浓度和处理时间直接影响分裂相的数量及染色体的长度,量大使染色体缩短变
粗,量少则分裂相少;时间长则染色体收缩。
11.低渗时间的长短关系到染色体分散的好坏,时间不足染色体分散不好,低渗过度则染色体分散
过度甚至丢失。
12.固定应彻底,固定液要新鲜配制,吹打时用力要匀,不要过猛,以避免细胞破碎和染色体丢失。
细胞悬液浓度要适宜,太高,染色体分散不好,太稀则不易找到好分裂相。
13.培养液在抽滤除菌时不要等全部培养液抽干,最后一点要弃之,这样可防止空气中的细菌进入
已除菌的培养液中。
14.制片中如发现染色体分散不佳,可重复固定或延长固定时间。
15.滴片时如玻片冷却不够或有油污会影响细胞和染色体的分散。
另外,要使染色体分散良好,还要注意细胞悬液的浓度和滴片的技巧等。
16.培养液中小牛血清的质量和比例也是影响细胞培养成败的重要因素。
17.培养失败的常见原因有:
①培养瓶等器材未清洗干净;②培养用水不合格;③pH值过高或过低;
④细菌污染;⑤PHA质量有问题;⑥供血者细胞免疫水平低下;⑦血清质量不佳等。
【作业与思考】
1.固定液的作用是什么?
在使用固定液时应注意什么?
2.低渗液起到什么作用,在使用过程中应注意什么问题?
实验二人类某些遗传性状(疾病)的调查分析
人类单基因遗传的性状或疾病在上下代之间的传递遵循孟德尔定律,如ABO血型、苯硫脲尝味能力、
眼睑的单与双、耳垂的有或无,能卷舌和不能卷舌及额前发际的形状等均属于单基因控制的性状,在一
个大的群体中,通过调查分析这些性状,可以对该群体的某一基因频率及基因型频率做出估计。
一、苯硫脲尝味试验
苯硫脲(phenylthiocarbamide,PTC)是一种白色结晶状药物,由于其含有N-C=S基团而有苦涩
味,但对人无毒副作用。
不同种族、民族和个体之间,对该物质的尝味能力不同,人体对苯硫脲的尝味
能力是由一对等位基因(Tt)所控制的性状,T对t为不完全显性。
正常尝味者能尝出浓度小于1/750000
PTC溶液的苦味,为纯合尝味者,基因型为TT;而Tt基因型的个体(杂合子)尝味能力稍低,只能尝
出浓度为1/40000~1/500000的PTC溶液的苦涩味,这种个体为PTC杂合尝味者。
当PTC浓度大于1/24000才能尝出其苦味的人,称为PTC味盲,基因型为tt;有的味盲个体甚至对PTC结晶也尝不出苦味来。
因此,人类对PTC尝味能力属于不完全显性遗传(半显性遗传)。
而且已知纯合体味盲(tt)者容易患
结节性甲状腺肿,因此可以把PTC的尝味能力,作为一种辅助性诊断指标。
我国汉族人群中,PTC味盲
约占10%。
(一)器材和试剂
1.器材试管、试管架、滴管。
2.试剂PTC溶液的配制:
取PTC粉末0.65g,加蒸馏水500ml摇匀,在室温下放置1~2天即完
全溶解成原液。
原液的PTC浓度约为1/750。
PTC尝味使用液配制:
将PTC原液编为1号液,将1号液
用蒸馏水稀释1倍编为2号液,将2号液再稀释一倍为3号液以此类推,直至配成14号PTC溶液,14
号液浓度为1/6000000,将配好的14种不同浓度PTC溶液分别置于消毒好的瓶内。
(二)操作程序
1.让受试者坐在椅子上,仰头张嘴。
首先用滴管滴5~10滴14号液于舌根部,让受试者徐徐下咽
品味,并用蒸馏水作对照试验。
2.询问受试者能否鉴别此两种溶液的味道,若不能鉴别或不能断定,则依次用13号、12号溶
液重复试验(应注意与蒸馏水交替测试),直到明确鉴别出PTC的苦味为止。
3.tt基因型的阈值范围为1~6号液,Tt基因型的阈值范围为7~10号液,TT基因型的阈值范围
为11~14号液。
为简化操作程序,也可只用6、7、10、11和13号5种溶液进行测试,尝不出6号苦
味者为tt基因型,尝出7号和10号液的苦味者为Tt基因型,尝出11号者为TT基因型。
4.统计所测人员的测试结果,按Hardy-Weinberg定律计算出所测人群中的PTC尝味基因的基因型
频率和基因频率。
(三)注意事项
PTC尝味试验所用滴管在滴液体时,注意不要接触受试者的口腔。
二、人类ABO血型检测方法
AB
i)控制。
人类的红细胞表面有A和B两种抗原,血清中有抗B(β)和抗A(α)两种天然抗体,依抗
原和抗体存在的情况,可将人类的血型分为A、B、AB和O四种血型。
由于A抗原只能和抗A结合,B抗原只能和抗B结合,因此可以利用已知的A型标准血清(即A
型人的血清,又叫抗B血清)和B型标准血清(即B型人的血清,又叫抗A血清)来鉴定未知血型,两
种标准血清内所含每一种抗体将凝集含有相应抗原的红细胞。
因此一种血液其红细胞在A型标准血清中
发生凝集者为B型,在B型标准血清中凝集者为A型,在两种标准血清中都凝集者为AB型,在两种标
准血清中都不凝集者为O型。
(一)器材和试剂
1.器材显微镜、双凹玻片或普通载玻片、采血针、青霉素小瓶、胶布、记号笔、牙签或小玻棒、
棉球、小镜子。
2.试剂A型(抗B)和B型(抗A)标准血清、70%酒精、0.9%生理盐水。
(二)操作程序
一般实验室常用的方法有试管法与玻片法。
试管法的优点是敏感,较少发生假凝集;玻片法则简便
易行,但玻片法如控制不好,易发生不规则的凝集现象。
本实验用玻片法。
1.取一清洁的双凹玻片(或用普通载玻片用玻璃蜡笔划出方格代替),两端上角分别用记号笔或胶
布注明A和B及受试者姓名,然后分别用吸管吸取A和B型标准血清各一滴,滴入相应凹格(或方格)
内。
2.用70%酒精棉球消毒受试者的耳垂或指端,待酒精干后,用无菌的采血针刺破皮肤,用吸管取1~
2滴血放入盛有0.3~0.5ml生理盐水的青霉素小瓶中,用吸管轻轻吹打成约5%的红细胞生理盐水悬液。
3.在玻片的每一凹格(或方格)内分别滴一滴制好的红细胞悬液(注意滴管不要触及标准血清),
然后立即用牙签或小玻棒分别搅拌液体,使血球和标准血清充分混匀。
4.在室温下每隔数分钟轻轻晃动玻片几次,以加速凝集,等
10~30min
后观察有无凝集现象。
若
混匀的血清由混浊变为透明,出现大小不等的红色颗粒,表示红细胞已凝集。
若仍呈混浊状,无颗粒出现,则表明无凝集现象;若观察不清可用显微镜在低倍镜下观察;若室温过高,可将玻片放于加有湿棉
花的培养皿中,以防干涸;室温过低可将玻片置于37℃恒温箱中,以促其凝集。
5.根据ABO血型检查结果,判断自己及受检者的血型。
(三)注意事项
标准血清必须有效;红细胞悬液不宜过浓或过稀;反应时间及温度要适中,应注意辨别假阴性和假
阳性。
三、卷舌性状的调查
在人群中有的人能够卷舌(tonguerolling),即舌的两侧能在口腔中向上卷成槽形,甚至卷成筒
状,称为卷舌者(tongueroller),受显性基因(T)控制,有的人则不能卷舌,见图18-1。
观察受检
者或对镜观察自己是否具有卷舌能力,并对自己的家族进行调查,绘制系谱图,确定该性状的遗传方式。
图18-1卷舌(左)与非卷舌(右)
四、眼睑性状的调查
人群中的眼睑(eyelid)可分为单重睑(俗称单眼皮,又叫上睑赘皮)和双重睑(俗称双眼皮)两种性状。
一些人认为双眼皮受显性基因控制,为显性性状;单眼皮为隐性性状。
关于这类性状的性质和遗传方式,目前尚有争论,还有待进一步研究。
调查一下自己家族中有关成员的眼睑情况,并绘制成系谱图,分析其遗传方式。
五、耳垂性状的调查
人群中依个体不同,耳朵可明显区分为有耳垂(freeearlobe)与无耳垂(attachedearlobe)两种情况,见图18-2。
该性状是受一对等位基因所控制的,有耳垂为显性性状,无耳垂为隐性性状。
调查你的家庭各成员的耳垂性状,是否符合孟德尔式遗传,调查受检人群中无耳垂出现频率。
图18-2
有耳垂(左)与无耳垂(右)
六、额前发际的调查
在人群中,有些人前额发际(hairlineoftheforehead)基本上属于平线,有些人在前额正中
发际向下延伸呈峰形,即明显地向前突出,形成V字形发尖称寡妇尖(widow′speak),见图18-3。
这种特征属显性遗传。
调查受检人群中有哪些人前额发际呈峰形,记为“V”,平线者记为“-”。
图18-3前额V形发尖
七、发式和发旋的调查
人类的发式有卷发和直发之分。
东方人多为直发,为隐性性状,卷发则为显性性状;每个人头顶稍
后方的中线处都有一个螺纹(有的人不止一个),其螺纹方向受遗传因素控制,顺时针方向者为显性性
状,逆时针方向者为隐性性状。
调查家族中有关成员的发式和发旋性状,是否符合孟德尔式遗传。
调查
统计受检人群中不同个体发式和发旋情况。
八、拇指端关节外展的调节
在人群中有的人拇指的最后一节能弯向桡侧与拇指垂直轴线呈60度角(图18-4)。
该性状呈隐性
遗传,即该性状的纯合隐性个体的拇指端可向后弯曲60°。
调查受检人群中哪些人有此性状,统计该性
状出现的频率。
图18-4拇指端关节超伸展
九、达尔文结节的调查
耳轮边缘上的一个小突起称为达尔文结节(Darwinianpoint)或称为达尔文耳点(Darwin′searpoint)。
人群中有的人两个耳朵上都有此结节,有的个体仅一个耳朵有,也有的人无此性状。
一般认为
该性状为显性遗传性状。
有的人虽具有这个显性基因,但是由于该性状外显率低,因此呈现出类似于隐性性状的遗传。
调查受检人群中该结节出现的频率。
实验三人类性染色质标本制备技术
性染色质有X染色质(Xchromatin)和Y染色质两种类型。
X染色质又称X小体或Barr小体,是
女性细胞分裂间期核内的一种特有染色质。
X染色质位于核膜边缘,一般呈三角形、半圆形或扁平形等,
为异固缩小体。
正常女性间期核X染色质出现率为10%~59%,数目为X染色体的数目减1。
X染色质
可被多种染料显示,是快速鉴定性别的一种简单方法,同时,也是确定性发育异常患者X染色体数目的
一种简单方法。
Y染色质又称Y小体或F小体,是男性细胞间期核内的一种特有染色质,用喹吖因类染
料染色,可在荧光显微镜下被发现。
Y染色质的数目和大小分别与Y染色体的数目和Y染色体长臂末端
能被荧光染料着色的异染色质的大小相一致,因此,Y染色质检查可进行性别鉴定和性发育异常诊断。
【实验目的】
掌握鉴定人类X染色质的方法,熟悉鉴定人类Y染色质的方法,在显微镜下正确识别X染色质的特
征及其所在位置。
【实验器材和试剂】
1.器材显微镜、荧光显微镜、牙签、镊子、载玻片和盖玻片。
2.试剂甲醇、冰醋酸、乙醇、硫堇、碳酸氢钠、醋酸钠、盐酸、甲苯胺兰、地依红、猩红、磷
钨酸、快绿、磷钼酸、柠檬酸、磷酸氢二钠、盐酸阿的平和芥子喹吖因等。
【实验内容与方法】
一、X染色质标本制备与观察
(一)口腔粘膜细胞标本制备
用干净牙签轻轻刮取被检者口腔粘膜细胞,均匀地涂布于干净的载玻片上,将标本浸入3∶1的甲
醇-冰醋酸固定液中固定
30min,晾干备用,选用下面
1~2种染色方法制备
X染色质标本。
(二)X染色质标本制备
1.硫堇染色法
(1)试剂配制:
①硫堇原液:
1g硫堇溶于
100ml50%乙醇中;②
Michaelis
缓冲液:
醋酸钠
9.7g、
碳酸氢钠
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 遗传学 实验 教程