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肿瘤生物治疗张
肿瘤生物治疗2001/4/5
张叔人
一.肿瘤生物治疗发展概况
# 早期的肿瘤免疫治疗多采用非特异性免疫增强剂。
如卡介苗(BCG)和小棒状杆菌(C.Parvum)菌苗。
膀胱癌
# 80年代初期,Rosenburg应用LAK过继免疫治疗晚期癌症病人取得明显疗效,再次掀起免疫治疗的高潮。
(TILCIK 生物导弹)
# 90年代,比利时ThierryBoon首先应用T细胞克隆的方法找到了人类肿瘤抗原。
SEREX法发现了一批肿瘤抗原。
DC 肿瘤抗原肽
# 肿瘤基因治疗。
P53Rb
# 针对阻止肿瘤血管生成治疗肿瘤。
近几年随着分子生物学的发展,在肿瘤抗原、抗原递呈和T细胞识别等方面均有了突破性进展,对于肿瘤的免疫效应机制,以及肿瘤的免疫逃逸机理有了深入的认识。
众多肿瘤免疫疗法如雨后春笋般应运而生。
肿瘤免疫治疗与手术、放疗、化疗三大常规疗法有明显的互补性,在控制肿瘤的复发和转移方面展示良好前景。
生物治疗:
应用生物的组织、细胞、蛋白质、多糖、基因等生物制剂
治疗疾病。
肿瘤的生物疗法的策略:
调节强化抗肿瘤免疫、祛除免疫抑制、直接
杀伤或诱导肿瘤凋亡、促肿瘤分化、阻断肿
瘤营养供应、提高肿瘤被杀伤的敏感性。
二.肿瘤的免疫治疗
策略:
去除免疫抑制、提高免疫原性、增强宿主免疫细胞的反应性
以及免疫导向。
1.过继免疫治疗(adoptiveimmunotherapy):
LAK,TIL,CIK
(1)淋巴因子活化的杀伤细胞(LymphokineActivatedKiller):
制备:
IL-2;测定:
51Cr释放法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法
NationalBiotherapyStudyGroupinterleukin-2
Trials:
TumorResponseAccordingtoTypeofCancer
Response
DiseaseCRPRMRSDPDTotal(CR+PR)%
Melanoma52824587333/18818
Lung17318228/5116
Breast14113155/3415
Renal31011766713/1678
Colon01636331/761
Other0124475912/12210
Total10624924826972/63811
CR:
completeresponse;PR:
partialresponse,MR:
mixedorminorresponse
SD:
stabledisease:
PD:
progressivedisease.
rIL-2:
半衰期短,给药方式:
皮内、瘤内、腔内、淋巴管内、吸入
副作用:
寒战、发热、恶心、乏力、心律失常、神经异常、毛细血
管渗漏综合症(Capillaryleaksyndrome,CLS),肺水肿
预防和处理:
地塞米松、消炎痛、安定类、吸氧
(2)其他非MHC限制性过继免疫治疗
粘附MNCA-LAK
+抗CD3CD3AK
LAK(MNC+IL-2)+抗CD3+IFN-+IL-1CIK
+MEP(TCR-V9、V2)T
Monoethylpospate
LAK、CD3AK、CIK细胞活性及增殖数量(李殿俊)
LU/106cellsCellnum.x106TotalLU
LAK238104
CD3AK18871566
CIK26782028
TAK:
IL-2+抗CD3+Tu-Ag
(2)肿瘤浸润性淋巴细胞
富含肿瘤细胞
1.055-
富含TIL
1.077-
(Tumor-infiltratinglymphocyte,TIL)
制备:
肿瘤组织消化(透明脂酸酶、胶原酶、DNA酶)单细胞密度梯度分离富含TIL+IL-2/抗CD3/100Gy自体肿瘤
标志:
CD3+/CD8+CD3+/CD4+
NK、LAK、TIL之间的区别
NKLAKTIL
来源外周血,脾外周血,脾肿瘤区域
抗原致敏+
产生条件自然存在IL-2IL-2、Ag、抗CD3
选择性杀瘤能力++++++
抗瘤谱窄广窄
MHC限制+
体内增殖能力差弱强
聚集肿瘤部位差差强
免疫记忆+
LGL特征++
CD3/++
TIL和LAK体内抗肿瘤效力的比较
回输TIL或LAK早期荷瘤小鼠肺转移抑制率%
数量 X106TIL+IL-2LAK+IL-2
0.4~0.516±8
1~274±12
4~596±4
8~10100
3012±1
6028±4
10059±26
20097±2
肿瘤——照射灭活裂解+DC——注入淋巴结区域腹股沟——
取淋巴结——CTL克隆——扩增——回输
2.肿瘤疫苗:
(1)细胞瘤苗
a. 细菌或病毒佐剂瘤苗:
BCGNDV
b. 转基因细胞瘤苗:
细胞因子(IL-2GM-CSF)
MHC(classIIIB7)
共刺激分子(B7)
c.基于DC的瘤苗:
负载多肽 导入肿瘤抗原基因
d. 红细胞瘤苗:
RBC-唾液酸酶
e. 细胞融合瘤苗:
肿瘤细胞+B细胞/DC
(2) 亚细胞瘤苗:
exosome(外泌小体)
近期发现DC分泌的exosome属于亚细胞结构,具有多种抗原递呈分子和T细胞共刺激分子。
肿瘤抗原肽刺激的DC产生的exosome能够呈递肿瘤抗原,活化CTL,抑制和根除已建立的小鼠肿瘤,所以exosome瘤苗极具发展潜力。
(3) 多肽分子瘤苗:
肿瘤提取抗原多肽(酸洗脱),病毒成分(HPV16-E6、E7)合成肿瘤抗原多肽,HSP
(4) 多糖瘤苗:
MUC-1
(5) 基因瘤苗:
CEA-痘苗V、HPV、erbB2/neu
3.基于抗体的免疫治疗:
Ag抗体抗抗体
(1)激活效应细胞(抗CD3AbCIK,TIL,抗4-1BBT)
(2)
idiotype-抗抗体瘤苗
(3)抗肿瘤相关抗原抗体,体内应用直接产生抗瘤作用。
Trustuzumab(Herceptin)anti-HER2
VLlinkerVH
VL
VH
VLNVHCPPVHNVLC
Base-loop
LHHLKGGK
鼠Fab
人Fc
(4)抗体导向治疗
对抗体改造克服HAMA反应
a.小分子抗体:
SinglechainFv(ScFv)1/6
Disulfide-stabilizedFv(DsFv)
PermutatedFv(pFv)
b.双功能抗体(BispecificAb)
●杂化杂交瘤技术
轻重链无改变X2
重链不变X4
重、轻链均变X4
●化学交联Fab
●基因重组两套重轻链基因
c.嵌合抗体(chimericAb)Fc
d.人源化抗体(humannizedAb)
重构抗体,VH,VL区6个CDR
移植,骨架区的一些氨基酸同
时移植
e.人源抗体:
利用基因工程技术
构建的小鼠XenoMouse,产生
抗EGFr单抗,在裸鼠模型显
示很强的抑瘤作用。
FcRScFv
Ag
TcellTumor
FcRScFv
f.
T-body:
T细胞表达的嵌合受体(Fv或ScFv为胞外区与Fcγreceptor
和ζ链 铰链区重组)。
不受MHC限制,杀伤肿瘤或半抗原修饰的肿瘤。
毒素
分类:
双链毒素:
Abrin,Ricin,Modeccin,
植物毒素Viscumin
单链毒素:
PAP,SAP,Lonin,Monoridin,
内化毒素Triuchosanthin
细菌毒素:
Diptheriatoxin(DT),Pseudomonas
exotoxin(PE),
膜活性毒素:
staphylococcal-hemolysin(HL),streptolysinO,
E.coli-hemolysin,pneumolysin,aerolysin,
perferins,eqinatoxins
a.毒素改造:
●PE664E(将结合细胞能力的DIa中Lys57,His246,Arg247,
和His249诱变为Glu,使其失去结合能力)
●PE40(缺失DIa,剩40KD)
●PE38(从PE40的DIb中去除365-380aa)
●PE38KDEL(将PE38中DIII的C端Arg-Glu-Asp-Leu-Lys用
Lys-Asp-Glu-Leu,KDEL替代,提高IT跨膜效率)
Reiter证明:
ScFv-PE38KDEL较ScFv-PE38对直肠癌多
种细胞系细胞毒活性高3-5倍,体内高2倍。
b.杂合毒素:
植物与细菌毒素杂交100-1000倍
c.基因重组毒素:
融合蛋白,必须存在与天然毒素一样的蛋白水解
位点,使毒素与载体内化时解离,便于进入胞质,发挥
杀伤效应。
d.膜活性毒素:
不需内化,杀伤力大,毒副作用大,需改造。
靶向治疗肿瘤相关的靶抗原
抗体靶向治疗的临床研究
●淋巴瘤
Kaminski:
1996131I-抗CD20鼠源,顽固性非何杰金氏淋巴瘤
75%患者有效,分化低的>分化高的,化疗不敏感的也取得较好疗效。
Knox:
90Y(钇)-抗CD20对非何杰金氏淋巴瘤有效率72%(治愈率
33%)。
90Y-抗个体基因型治疗B细胞淋巴瘤有效率近33%
●白血病
人源化抗CD33单抗M195治疗急性髓样白血病和急性早幼粒细胞白血病。
131I-M195与白消安或环磷酰胺合用于骨髓移植(BMT),除去排异反应的T细胞。
131I-抗CD54(ICAM-1)急性髓样白血病或急性单核细胞增多型白血病的BMT,与传统全身辐射除去T细胞对正常细胞毒性小。
●结直肠癌
鼠源抗表皮粘附分子单抗17-1A,对Duke’C期结肠癌死亡率和复发率分别降低了30%和27%,主要与低分化肿瘤结合,ADCC,80%产生HAMA,但未影响疗效。
人源化改造。
放免治疗:
131I-抗A33,与骨髓也有相当数量的结合,5/23有一定的疗效。
125I与靶向抗体偶联物易为肿瘤细胞内吞。
125I-抗A33,21例患者,10例显效,而骨髓细胞很少与125I标记抗体作用,被射线损伤机会少。
近来证明:
放射偶联物离细胞核越近,细胞毒越强,并成指数增加。
免疫毒素:
LeY-Ab与PE化学偶联,I期研究,5/38例好转,正常组织表达同样靶抗原,但未受损。
但是,由于毒素的免疫原性强,再次使用应有效果。
●乳腺癌
●肾癌
131I标记鼠源G250,由于HAMA反应,二次使用则失效。
131I-G250人鼠嵌合型,肿瘤富集浓度>0.1%(每克组织达到的注射计量,一般水平为0.001%-0.01%),16例中的2例有轻微
HACA反应。
ADCC
干扰素治疗肿瘤
肿瘤疗效
毛细胞白血病60-90%缓解
慢性白血病50%PR
淋巴瘤37%PR+CR
Kaposi氏肉瘤26%PR
急性白血病24%PR
多发性骨髓瘤20%PR+CR
神经胶质瘤17%PR+CR
肾细胞癌16%PR+CR
黑色素瘤10%PR+CR
局部应用好
卵巢癌10%PR
乳腺癌10%PR
4.细胞因子治疗
(1)干扰素(interferon,IFN)
I型干扰素:
细菌、病毒白细胞、成纤维细胞等,IFN-166-172aa(1、2亚族)无糖基;IFN-166aa糖蛋白;广谱抗病毒作用,促进多数细胞MHCI类分子的表达,提高巨噬细胞、NK细胞、CTL抗肿瘤作用。
II型干扰素:
IFN-成熟分子143aa的糖蛋白,同源双体形式存在,活化T细胞和NK细胞产生。
它可上调多种细胞MHCI类分子、II类分子表达,上调血管内皮细胞细胞间粘附分子-1的表达。
促转移?
(2)Interleukin,IL白细胞介素糖蛋白18种
IL主要生物学活性
1促T细胞分化,增殖、CTL,NK活性↑
2 促T细胞分化,增殖、CTL,NK,LAK活性↑
3 多能干细胞、T细胞增殖
4 促B细胞增殖,产生Ig,DC
5 促B细胞分化
6 促T、B、干细胞增殖,Ig↑,巨核细胞分化
7 促T、B细胞增殖,诱导LAK
8 趋化中性、嗜碱性粒细胞、T细胞
9 T细胞生长,协同IL-3刺激肥大细胞
10 抑制TH1,促胸腺和肥大细胞增殖
11 促Ig分泌,促血小板形成
12 协同IL-2促进CTL、NK、LAK分化
13促B细胞增殖
14 促B细胞增殖
15 CTL,NK,LAK活性↑
16 促进CD4+细胞增殖,抑制病毒复制(HIV)
17 促IL-6、IL-8、PGE2、MCP-1、G-CSF↑
18 NK、T↑
IL-12:
●35KD、40KD异二聚体,激发NK、LAK、T细胞增值、分化;向肿瘤趋化;诱导IFN-产生;促巨噬细胞产生NO;抑制肿瘤血管生成;有利于TH1细胞分化。
●临床研究:
I期美国遗传研究所主持安全性和耐受性
II期另一研究组,肾癌17人中15人出现严重副作用。
胃肠
道出血,肝毒性和贫血,2人死亡。
动物实验表明:
第一次单计量注射两周后再多次给药可预防毒
性反应。
SC代替iv,减少用药次数,未出现毒性反应。
●改进:
IL-12基因自体纤维母细胞扩增注入体内(或与灭活的瘤细胞混合,作为瘤苗)CD4+,CD8+细胞浸润,出现大量并指状细胞。
对晚期肿瘤有效。
(3)肿瘤坏死因子TNF:
分为两种,TNF-又称为恶质素;TNF-又称为淋巴毒素。
两者都是同源三聚体。
炎症因子,与败血症休克、发热、多器官衰竭、恶病质有关。
体内外均能杀死某些类型的瘤细胞,或抑制其增殖,激活免疫细胞攻击肿瘤,增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力,促进IL-2、CSF、IFN-等淋巴因子产生,干扰肿瘤血液供应。
它的许多功能与IL-1相同。
另一方面,肿瘤坏死因子又可促肿瘤有丝分裂、肿瘤扩散、血管生成和恶液质。
毒性大,基因重组突变型
(4)血细胞生成因子 G-CSF、GM-CSF、TPO、EPO、IL-6、SCF
其他生物反应调节剂:
BCG、OK432、香菇多糖、中草药(黄芪、女贞子
对抗免疫抑制:
PGE2-InM;Ts-CYC或低剂量辐射;反义RNA(TGF-,IGF,IL-10)
配体导向治疗:
IL-2/IL-2R、EGF/EGFR
三、抗血管生成
肿瘤长至1-2mm3无新血管行成供应营养,则不能生长。
策略
Fourstrategies(todesignanti-angiogenesisagents)
(1)Blocktheabilityoftheendothelialcellstobreakdownthe
surroundingmatrix.
(2)Inhibitnormalendothelialcellsdirectly.
(3)Blockfactorsthatstimulateangiogenesis.
(4)Blocktheactionofintegrin,amoleculeontheendothelial
cellsurface.
1阻断内皮细胞降解周围基质的能力
2直接抑制正常内皮细胞
3阻断刺激血管生成的因子
4阻断整合素的作用(内皮细胞表面的分子)
活化内皮细胞生长、运动的因子
activeendothelialcellgrowthandmovement
1vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)
2fibroblastgrowthfactor(FGF)
3angiogenin
4epidermalgrowthfactor(EGF)
5scatterfactor(SF)
6placentalgrowthfactor(PlGF)
7interleukin-8(IL-8)
8tumornecrosisfactoralpha(TNF-α)
天然抗血管因子
naturallyoccurringinhibitorsofangiogenesis
1.Angiostatin
2.endostatin
3.Interferons(IFN)
4.plateletfactor4(PF4)
5.thrombospondin(凝血栓蛋白)
6.transforminggrowthfactorbeta(TGF-)
7.16Kdfragmentofprolactin
8.tissueinhibitorofmetalloproteinase-1,-2,and-3
(TIMP-1,TIMP-2andTIMP-3)
●Angiostatin血管抑素:
1994年O’Reily研究转移癌抑制机制时从Lewis肺癌鼠血清和尿中提取38Kda蛋白,亲肝素和赖氨酸,抑制血管内皮生长和新的血管形成。
是纤溶酶原的酶解产物。
●endostandin内皮抑素:
1997年从血管内皮细胞培养上清中发现,20kDa,胶原XVIII的酶解产物,原核表达无天然折叠,可溶性差,体外无活性。
皮内注射出现活性。
●抗肿瘤作用:
手术、放疗、化疗、免疫治疗各有其局限性,肿瘤生长严格依赖血管形成。
肿瘤长至1-2mm3无新血管行成供应营养,则不能生长。
通过抑制血管形成对各种实体瘤均有效。
血管内皮细胞为新生血管前体,很少发生变异,治疗效果稳定不易产生耐药性。
对正常静止的血管内皮细胞无抑制作用。
O’Reily称其为休眠疗法(dormancytherapy)。
真核表达的血管抑制素有种属差异。
小鼠实验中达同样抗肿瘤效果,人血管抑制素用量100mg/kg.d,小鼠血管抑制素为6mg/kg.d
●基因重组内皮抑素皮下注射已长至小鼠体重3%的多种肿瘤都缩小至镜下可见水平。
凋亡率是对照组的7倍之多。
接种3%endostandinendostandin
2-6个周期
●andostandin+Angiostatin肿瘤不复发
●非实体瘤白血病血管形成在骨髓,血管形成抑制剂同样有效。
●优越性;几乎对所有的原发和转移瘤都有效。
不产生耐药性。
无毒副作用。
给药途径方便(SC)
●问题:
长期应用对人类能否产生副作用。
对自发性人类肿瘤的疗效是否与小鼠实验效果相同。
四 基因治疗
1.策略:
基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活
内容:
直接攻击肿瘤(诱导凋亡和直接杀伤)、调节免疫系统、
对抗肿瘤血管生成、修饰保护正常细胞
2.载体:
retrovirus(RV)、adenovirus(AdV)、adeno–asociatedvirus(AAV)、herpessimpexvirus(HSV)、Epstein-Barrvirus(EBV)、vacciniavirus(VV)、其他真核表达质粒
各种病毒载体的特点
RVAdVAAVHSV
类型双链RNA双链DNA单链DNA双链DNA
整合与细胞染色体随机整合不整合定点19号短臂可整合
产生感染病毒条件 缺陷病毒 穿梭载体 复制:
辅助 缺陷病毒
包装细胞 缺陷病毒 病毒AdV,VV 包装细胞
PA317(gag包装细胞HSV 或 (早期病毒
Pol,env)293(E1)UV,γ-射线 基因IE3)
外源基因装载容量8kb35kb4.9kb>30kb
感染细胞谱广谱,分裂期广谱广谱,辅助病毒神经和上皮类细胞
制备效价(PFU/ml)106-107101210121011-1012
感染效率较低高高高
安全性有风险安全安全有风险
3.基因导入方法:
病毒感染、脂质体(图)、电穿孔、基因枪(图)、
裸基因注射、基因缝线等
基因缝线:
汤健缝线直接涂抹DNA或通过polylysine偶联到缝线上
血管、骨骼肌、心肌比单纯注射表达率高5-10倍。
尿激
酶基因缝线微小动脉缝合防止吻合口血栓形成和狭窄。
基因针:
用polylysine将基因粘附在不锈钢针上(75-100gDNA)
刺入肌肉(0.2V,1mA,直流脉冲,DNA为负极无关电极为
正)电针30分钟第3天表达14天达高峰持续一个
月。
针刺捻转为电针效率的1/3-1/5。
基因球囊和支架:
外源基因(反义N-ras)在冠状动脉中表达,抑
制损伤造成的血管内膜下增生和狭窄
血管外基因转移:
a外科切开蘸有基因的滤纸贴于血管外膜
b可溶性纤维蛋白+DNA——血管周围注射——凝血酶+组织凝血因子——网状不溶性纤维蛋白/DNA复合物——>14天纤溶酶作用降解
4.肿瘤基因治疗的靶向性和组织特异性表达
(1)病毒:
●RV:
IL-2替代其envN端部分IL-2-Env淋巴细胞
胶联EGF、Ab有待评价
●AdV:
Ad5-纤维蛋白的糖基,经化学修饰与一种血清类粘蛋白(ASOR)和多聚赖氨酸连接物共价连接与ASOR+细胞结合
●HSV:
具有嗜神经性,改造成只感染分裂相胶质瘤细胞,而脑内正常细胞不受影响。
●EBV:
EBNA-1是EBV复制所需唯一的反式激活因子。
存在于所有的EBV转化的细胞中。
pFR-tk-Zta质粒中溶细胞性复制周期反式蛋白Zta是依赖EBV激活。
(HBV-嗜肝性)
(2)脂质体:
特异性配基(抗体、凝集素、病毒表面的糖蛋白)
EGFp-LysDNA
+++
(3)受体介导:
转铁蛋白-多聚赖氨酸/DNAK562
EGF-多聚赖氨酸/DNAK562
(5)肿瘤组织特异性表达:
组织特异性启动子、增强子、反式作用因子调控表达。
AFP启动子/增强子-TK
5.目的基因及其应
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